Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Polyethyleneimine beschichteten Eisenoxid-Nanopartikeln als Vehikel für die Lieferung von kleinen interferierende RNA an Makrophagen In Vitro und In Vivo

8.3K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/58660

⸱

5. Februar 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Ministry of Education for Developmental Genes & Human Diseases, Institute of Life Sciences and School of Medicine, Southeast University, 2State Key Laboratory of Bioelectronics, Jiangsu Key Laboratory for Biomaterials & Devices, School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Methode der Verwendung von Polyethyleneimine (PEI)-superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln für transfecting Makrophagen mit SiRNA beschichtet. Diese Nanopartikel können effizient SiRNA zu Makrophagen in Vitro und in Vivo und Stille Ziel Genexpression liefern.

Zusammenfassung

Wegen ihre entscheidende Rolle bei der Regulation der Immunantwort Makrophagen kontinuierlich Gegenstand intensiver Forschung und stellen eine vielversprechende therapeutische Ziel bei vielen Erkrankungen wie Autoimmunerkrankungen, Arteriosklerose und Krebs. RNAi vermittelte Gen-silencing ist ein wertvoller Ansatz, Sonde und Makrophagen Funktion zu manipulieren; jedoch die Transfektion von Makrophagen mit SiRNA wird oft als technisch anspruchsvoll, und zur Zeit gibt es einige Methoden, die die SiRNA-Übertragung auf Makrophagen gewidmet. Hier präsentieren wir ein Protokoll mit Polyethyleneimine beschichteten superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln (PEI-Mondfotos) als Vehikel für die gezielte Bereitstellung von SiRNA zu Makrophagen. PEI-Mondfotos sind in der Lage, verbindliche und vollständig kondensiert SiRNA erreicht die Fe: SiRNA-Gewichts-Verhältnis 4 und vor. In-vitro-, diese Nanopartikel können effizient SiRNA liefern, in primären Makrophagen sowie in die Makrophagen-wie RAW 264,7 Zell-Linie, ohne kompromittierende Zellviabilität an die optimale Dosis für Transfection und, letztlich, sie induzieren SiRNA-vermittelten Ziel Gen-silencing. Neben für in-vitro- SiRNA Transfection verwendet, sind PEI-Mondfotos auch ein viel versprechendes Instrument für die Bereitstellung von SiRNA zu Makrophagen in Vivo. Angesichts seiner kombinierten Funktionen der magnetische Eigenschaft und Gen-silencing Fähigkeit dürften systemisch verabreichten PEI-SPION/SiRNA-Partikel nicht nur zu modulieren, Makrophagen-Funktion, sondern auch aktivieren Makrophagen abgebildet und nachverfolgt werden. PEI-Mondfotos repräsentieren im Wesentlichen eine einfache, sichere und wirksame nonviral Plattform für SiRNA Lieferung an Makrophagen in Vitro und in Vivo.

Einleitung

Makrophagen sind eine Art von angeborenen immunen Zellen verteilt in allen Körpergeweben, wenn auch in unterschiedlichen Mengen. Durch die Herstellung einer Vielzahl von Zytokinen und anderer Vermittler, spielen sie wichtige Rollen in der Wirt Verteidigung gegen eindringende mikrobielle Krankheitserreger, in Reparatur von Gewebe nach Verletzungen und bei der Aufrechterhaltung der Homöostase-Gewebe1. Aufgrund ihrer Bedeutung waren Makrophagen kontinuierlich Gegenstand intensiver Forschung. Jedoch trotz der Prävalenz in der Genregulation und Funktionsstudien, SiRNA-vermittelten Gen-silencing ist weniger wahrscheinlich, da in Makrophagen erfolgreich diese Zellen – insbesondere primäre Makrophagen – sind oft schwer zu transfizieren. Dies kann eine relativ hohe Toxizität im Zusammenhang mit etabliertesten Transfektion Ansätze, in denen die Zellmembran chemisch ist (z. B.mit Polymeren und Lipide) zugeschrieben werden oder körperlich (z.B.durch Elektroporation und gen Kanonen) gestört, um SiRNA-Moleküle die Membran, dadurch drastisch Makrophagen Lebensfähigkeit2,3überqueren zu lassen. Darüber hinaus sind Makrophagen spezielle Fresszellen, die reich an abbauende Enzyme. Diese Enzyme können die Integrität von SiRNA, die Stummschaltung Effizienz zu schwächen, auch wenn in der Zelle3,4Gen-spezifischen SiRNA geliefert wurde beschädigt. Daher muss eine wirksame Makrophagen ausgerichtete SiRNA Delivery-System zum Schutz der Integrität und Stabilität von SiRNA während Lieferung4.

Es wird immer offensichtlicher, dass dysfunktionale Makrophagen in der Initiierung und Progression von bestimmten gemeinsamen klinischen Erkrankungen wie Autoimmunerkrankungen, Arteriosklerose und Krebs verwickelt sind. Aus diesem Grund Modulation Makrophagen-Funktion mit, zum Beispiel, SiRNA hat als eine attraktive Methode für die Behandlung dieser Erkrankungen5,6,7aufgetaucht. Obwohl große Fortschritte erzielt wurden, ist eine große Herausforderung SiRNA basierenden Behandlungsstrategie der Arme Zelle Besonderheit der systemisch verabreichten SiRNA und die unzureichende SiRNA-Aufnahme durch Makrophagen, die somit zu unerwünschten Nebenwirkungen führen. Im Vergleich mit kostenlosen Nukleinsäure-Therapeutika, die in der Regel fehlt optimale Zelle Selektivität und führen oft zu Nebenwirkungen, Medikament beladenen Nanopartikeln (NPs), aufgrund ihrer spontanen Neigung gefangen vom retikuloendothelialen System Ziel, für passive targeting zu Makrophagen in Vivo, zulassend verbesserten therapeutischen Wirksamkeit mit minimalen Nebenwirkungen8projektierbar. Aktuelle NPs erforscht für die Lieferung von RNA-Molekülen gehören anorganische darin, verschiedene Liposomen und Polymere-9. Unter anderem zeigt Polyethyleneimine (PEI), eine Art von kationischen polymeren in der Lage zu binden und kondensierenden Nukleinsäuren in stabilisierter NPs, die höchsten RNA liefert Kapazität9,10. PEI schützt Nukleinsäuren vor enzymatischen und nonenzymatic Abbau, vermittelt ihre Übertragung über die Zellmembran und fördert ihre intrazellulären Freigabe. Obwohl zunächst als ein DNA-Lieferung-Reagenz eingeführt, zeigte sich PEI anschließend zu einer attraktiven Plattform für in Vivo SiRNA Delivery, entweder lokal oder systemisch9,10.

Superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln (Mondfotos) zeigten viel versprechend in der Biomedizin, aufgrund ihrer magnetischen Eigenschaften, Biokompatibilität, vergleichbarer Größe auf biologisch wichtige Objekte, hohe Oberfläche-Bereich-zu-Volumen-Verhältnis und leicht anpassbar Oberfläche für Bioagent Anlage11. Zum Beispiel haben wegen ihres potenziellen Nutzens als Kontrastmittel und schnelle Aufnahme durch Makrophagen Mondfotos als klinische Lieblingswerkzeug Bild Gewebe Makrophagen12entstanden. Während Mondfotos als Nukleinsäure-Lieferung Fahrzeuge11,13,14,15, nach unserer Kenntnis auch ausgiebig studiert haben enthält die Literatur einige Berichte von Mondfotos als Träger für Makrophagen-gezielte SiRNA Lieferung. Gen-Lieferung von Mondfotos ist ihre Oberfläche in der Regel mit einer Schicht von hydrophilen kationischen polymeren beschichtet auf dem negativ geladenen Nukleinsäuren elektrostatisch angezogen und angebunden werden können. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode zur Synthese von Mondfotos, dessen Oberfläche mit niedrigem Molekulargewicht (10 kDa), verzweigte PEI (PEI-Mondfotos) geändert wird. Diese magnetische Nanoplatforms werden dann eingesetzt, um kondensieren SiRNA, bilden PEI-SPION/SiRNA-komplexe, die SiRNA-Transport in die Zelle zu ermöglichen. Wir Grund, dass spontane Phagozytose von Mondfotos durch Zellen des retikuloendothelialen System16, gepaart mit der starken Fähigkeit der Bindung und kondensierenden Nukleinsäuren von PEI, rendert PEI-Mondfotos geeignet für den effizienten Transport von SiRNA in Makrophagen. Die hier vorgestellten Daten unterstützen die Machbarkeit des PEI-SPION/SiRNA-mediated Gene silencing in Makrophagen in Kultur als auch in Vivo.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Alle Methoden, die mit lebenden Tieren, im Einklang mit dem Tier durchgeführt wurden kümmern und Richtlinien der Southeast University, China.

1. Vorbereitung des PEI-Mondfotos

  1. Vorbereitung der Ölsäure geändert Mondfotos
    1. Lösen sich FeCl3•6H2O und FeSO4•7H2O in Wasser unter dem Schutz der N2.
      1. Hinzufügen von FeCl3•6H2O 28 g und 20 g FeSO4•7H2O in 80 mL entionisiertem Wasser in ein Becherglas. Führen Sie N2 in das Wasser durch eine Glas-Leitung ein und rühren Sie, bis die feste Materie aufgelöst hat.
      2. Erhitzen Sie das Reaktionsgemisch auf 72 ° C mit einer mitreißenden Rate von 800 u/min, gefolgt von Zugabe von 40 mL Ammoniakwasser (28 %). 5 min köcheln.
    2. Hinzugeben Sie 9 mL Ölsäure tropfenweise in die oben genannten Lösung und rühren Sie es bei 72 ° C für 3 h.
    3. Kühlen Sie die resultierende Lösung auf Raumtemperatur (RT). Die Lösung über magnetische Trennung herbeiführen.
    4. Waschen Sie den Niederschlag mit Mondfotos 3 X mit absoluten Spiritus und dann den Niederschlag in 100 mL N-Hexan zu zerstreuen.
  2. Vorbereitung der Dimercaptosuccinic Säure-modifizierte Mondfotos
    1. Hinzufügen von 800 mg von Ölsäure (OA)-geändert Mondfotos zerstreut in 200 mL N-Hexan und 400 mg Dimercaptosuccinic Säure (DMSA) in 200 mL Aceton, dispergiert in einem drei-Hals-Kolben in einem Wasserbad bei 60 ° C.
      Hinweis: Zur Bestimmung der Konzentration von OA-modifizierte SPION aus dem vorherigen Schritt erhalten, nehmen Sie ein kleines Volumen (z.B. 1 mL) der SPION Dispersion, verdampfen Sie das N-Hexan und wiegen Sie das resultierende Pulver.
    2. Fügen Sie 200 µL Triethylamin tropfenweise in die oben genannten Lösung mit Rühren bei 1.000 u/min und zurückfließt.
    3. Erhalten Sie nach 5 h rühren und zurückfließt einen schwarzen Niederschlag durch magnetische Trennung.
    4. Die hydrophilen Mondfotos in entionisiertem Wasser homogen durch den pH-Wert der Lösung mit Tetramethylammonium Hydroxid zu zerstreuen.
  3. Vorbereitung der PEI-Mondfotos
    1. DMSA-modifizierte SPION kolloidalen Lösung tropfenweise hinzufügen, in PEI-Lösung (10 kDa) in einen 500-mL drei Hals Kolben unter mechanischen Rühren bei 1.000 u/min für 2 h (WFe: WPEI = 1:3).
      Hinweis: Die Ladung und Größe des PEI-Mondfotos variieren je nach Verhältnis von WFe WPEI. Der W-Fe: WPEI -Verhältnis von 1:3 kann ein guter Ausgangspunkt zur Synthese von PEI-Mondfotos für SiRNA Delivery geeignet sein.
    2. Fügen Sie die resultierende Lösung in eine Ultrafiltration Rohr mit einem Molekulargewicht Cutoff von 100 kDa und einen Inhalt von 15 mL; dann, Zentrifuge bei 5.400 x g für 10 min bis die restliche Lösung 1 mL ist. Die Lösung für das Volumen 15 mL wieder machen und wiederholen den obigen Vorgang 10 deionisiertes Wasser hinzufügen X, um das Endprodukt zu erhalten. Dann filtern Sie die Lösung durch einen 0,22-μm-Filter und speichern Sie das Endprodukt bei 4 ° C.
    3. Bestimmen Sie die Fe-Konzentration von PEI-Mondfotos durch die kolorimetrischen Verfahren unter Verwendung Phenanthroline17. PEI-Mondfotos mit entionisiertem sterilem Wasser zu einer Konzentration von 1 mg Fe/mL verdünnen und bei 4 ° c lagern
    4. Verdünnen Sie 10 μL der PEI-SPION-Lösung (1 mg Fe/mL), 1 mL mit entionisiertem Wasser; Anschließend testen Sie die hydrodynamischen Größe und Zetapotenzial durch ein dynamischen Lichtstreuung Gerät.
      Hinweis: Bereiten Sie PEI-Mondfotos im Bereich von etwa 30-50 nm. In diesem Größenbereich scheint die Wirkung der NP Größe auf SiRNA Bindung und zelluläre Aufnahme nicht erheblich sein. PEI-Mondfotos mit einer durchschnittlichen Zeta-Potential über + 37 mV in der Dosisbereich zur Transfektion toxisch sein kann, und ein Zytotoxizität-Assay durchgeführt werden, um Sicherheit zu gewährleisten. Die Oberflächenladung und hydrodynamischen Größe der Nanopartikel können durch Anpassen der PEI-Inhalte innerhalb eines gewünschten Bereichs gesteuert werden.

2. Vorbereitung und Agarose-Gelelektrophorese PEI-SPION/SiRNA NPS

  1. Verdünnen Sie SiRNA mit RNase-freies Wasser um eine Endkonzentration von 20 μM (0,26 µg/μl) zu erzielen.
  2. Bereiten Sie fünf RNase-freie Mikrozentrifugenröhrchen beschriftet, 0, 1, 2, 4 und 8. Die Etiketten sind verschiedene Fe: SiRNA-Gewichts-Verhältnis. Pipettieren 3 μL der SiRNA-Lösung für alle Rohre (~0.8 μg SiRNA/Röhre).
  3. Fügen Sie 0, 0,8, 1,6 mm, 3,2 und 6.4 μg Fe in Form von PEI-Mondfotos beschriftet 0, 1, 2, 4 und 8, bzw. Rohre hinzu. Halten Sie die Gesamtstichprobe jede Röhre weniger als 20 μL. Mischen Sie, indem Sie sanft auf und ab pipettieren.
  4. Inkubieren Sie die Mischungen bei RT für 30 min, PEI-SPION/SiRNA Komplexbildung zu ermöglichen. Während dieser Zeit machen Sie eine 3 % Agarose mit hohem Reinheitsgrad Agarose-gel.
    Hinweis: Zusätzliche PEI-SPION/SiRNA-komplexe mit anderen Fe: SiRNA-Verhältnisse (z.B.5 oder 6) können vorbereitet und getestet werden.
  5. 1 μl 6 x DNA Loading Puffer je 5 μl Probe hinzufügen und vorsichtig mischen. Laden Sie alle Proben und Elektrophorese mit 5 V/cm ausgeführt, bis die Bromophenol Blue bis zu zwei Drittel der Länge des Gels migriert. Färben Sie das Gel mit Interkalation Bromid (EB) für 15-20 min.
    Hinweis: Frisch zubereitete Elektrophorese Puffer und EB-Lösung sollte verwendet werden.
  6. SiRNA Bands unter einem UV-imaging-System zu visualisieren. Überprüfen Sie die Fe: SiRNA-Verhältnisse an die SiRNA Formen komplexe mit PEI-Mondfotos und infolgedessen die Bands kostenlos SiRNA vertreten sind, verzögert oder nicht nachweisbar.

3. die Transfektion von RAW264.7 Makrophagen In-vitro-

  1. Kultur Mauszellen Makrophagen-wie RAW264.7-ein 10-cm-Schüssel mit DMEM komplette mittlere mit 10 % fötalen Rinderserum (FBS) pro 100 U/mL Penicillin pro 100 μg/mL Streptomycin bei 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator.
  2. Aspirieren Sie einen Tag vor der Transfektion Medium aus den Zellen und spülen Sie sie mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (pH 7,4). Die 10-cm-Schüssel 1 mL von 0,25 % Trypsin hinzufügen. Trypsinize RAW264.7 Zellen für ca. 5-10 min bei 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator.
  3. Wenn die Mehrheit der Zellen (nach ca. 5-10 min) getrennt haben, fügen Sie 5 mL DMEM komplette Medium in die Schale, die Trypsin zu inaktivieren. Pipettieren rauf und runter, Zellcluster in Einzelzellen zu zerstreuen.
  4. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine sterile 15 mL konische Rohr. Zentrifugieren sie 300 X g für 3 min bei RT. Entfernen Sie überstand.
  5. Aufschwemmen der Zellen mit 5 mL frischem DMEM komplette Medium und die Zellen zu zählen.
  6. Platte 9 x 104 Zellen pro auch in einem 6-Well-Platte mit 2 mL des kompletten DMEM Medium und Inkubation bei 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator für ca. 24 h.
    Hinweis: Wenn Sie einen Teller mit einer anderen Größe zu verwenden, einstellen Sie die vergoldeten Zelldichte im Verhältnis zu der relativen Fläche so, dass die Zellen 80 % Konfluenz zum Zeitpunkt der Transfektion erreichen.
  7. Wenn Zelle Konfluenz 80 % ist, entfernen Sie das Medium aus den Zellen zu und ersetzen Sie es mit 1 mL DMEM komplette Medium pro Bohrloch. Rückkehr der Plattenrandes in den Inkubator bis PEI-SPION/SiRNA-komplexe vorbereitet worden und sind bereit für den Einsatz (ca. 30 min).
  8. Bereiten Sie PEI-SPION/SiRNA-komplexe: berechnen Sie die Menge der PEI-SPION/SiRNA-komplexe für eine Transfektion Experiment benötigt. Mischen Sie in einem 1,5 mL RNase-freie Microcentrifuge Schlauch einen angemessenen Betrag von PEI-Mondfotos mit SiRNA bei einem bestimmten Fe: SiRNA-Verhältnis. Zum Beispiel um PEI-SPION/SiRNA NPs enthält 100 µg Fe bei einem Fe: SiRNA-Verhältnis von 4 vorzubereiten, addieren Sie 100 µL (1 mg Fe/mL) PEI-Mondfotos, 96 μL von SiRNA (0,26 µg/μl), gefolgt von sanft mit einer Mikropipette mischen. 30 min bei RT inkubieren
    Hinweis: Bereiten Sie ein Volumen von PEI-SPION/SiRNA-Komplex, 10 % mehr als die abschließende Gesamtmasse entfallen jegliche anfallende Verluste ist. Stellen Sie PEI-SPION/SiRNA-komplexe bei niedrigen Fe: SiRNA Verhältnisse, unter denen SiRNA-Moleküle werden auf PEI-Mondfotos vollständig geladen und somit können kleine Mengen von PEI-Mondfotos verwendet werden, um potenzielle Zytotoxizität zu minimieren. Pilotprojekte (Gel Retardierung Assay) für die Optimierung des Fe: SiRNA sind notwendig.
  9. Nehmen Sie die 6-Well-Platte aus dem Inkubator (Schritt 3,7). Fügen Sie eine gewünschte Lautstärke des PEI-SPION/SiRNA komplexes tropfenweise in jede Vertiefung und wirbeln Sie die Platte vorsichtig um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten. Die Platte in den Inkubator erst die Bewertung der zellulären Aufnahme oder gen Knockdown Effizienz (1-3 d) zurück.
    Hinweis: Transfecting Makrophagen mit PEI-SPION/SiRNA in einer Konzentration von ~ 15 μg Fe/mL können Transfection Leistungsfähigkeit maximieren bei gleichzeitiger Minimierung der möglichen Zytotoxizität.

4. systemische Lieferung von SiRNA zu Makrophagen bei Ratten mit experimentellen Arthritis

  1. Erhalten Sie spezifische Erreger-freie männliche Wistar-Ratten, die 7 Wochen alt sind. Gewöhnen Sie die Ratten für 7D vor Gebrauch und versorgen sie mit ausreichend Nahrung und Wasser. Adjuvanter Arthritis (AA) bei den Ratten als zuvor beschriebenen18zu induzieren.
  2. Bereiten Sie PEI-SPION/SiRNA-komplexe wie in Schritt 3.8 beschrieben vor.
  3. Die PEI-SPION/SiRNA NPs (0,3 mg von SiRNA/kg) in der AA Ratten über die Rute Vene injizieren. Bewerten der zelluläre Aufnahme über, zum Beispiel Durchflusszytometrie, Gewebe Bioverteilung über, zum Beispiel eine Echtzeit-Fluoreszenz imaging-System, oder therapeutische Wirkungen anhand z. B. klinische, histologische und radiologische Analysen zur gewünschten Zeit weist18.
    Hinweis: Für Mobilfunk und Gewebe Bioverteilung Studien, behandeln Sie die Ratten mit einer einzigen Injektion die gewünschte NPS; injizieren Sie für Therapiestudien die Ratten mit dem NPs geprüft 1 x pro Woche für drei aufeinander folgende Wochen sein.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Die Größe und Zeta Potential der PEI-Mondfotos vorbereitet mit diesem Protokoll wurden im Bereich von 29-48 nm (Polydispersität Index: 0,12 - 0,23) und 30-48 mV, beziehungsweise. Sie waren seit über 12 Monaten ohne offensichtliche Aggregation im Wasser bei 4 ° C stabil. Um ihre SiRNA verbindliche Fähigkeit zu bewerten, wurden PEI-Mondfotos mit SiRNA bei verschiedenen Fe: SiRNA-Gewichts-Verhältnis gemischt. Abbildung 1 zeigt, dass erreicht die Fe: SiRNA-Gewich...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Makrophagen sind refraktär gegenüber von häufig verwendeten nonviral Ansätze wie Elektroporation, kationische Liposomen und Lipid Arten transfizieren. Hier haben wir eine zuverlässige und effiziente Methode, um Makrophagen mit SiRNA transfizieren. Mit Hilfe dieses Protokolls, werden über 90 % der Makrophagen-wie RAW 264,7 Zellen (Abb. 2 b) und Ratte peritonealen Makrophagen18 mit SiRNA ohne wesentliche Beeinträchtigung des die Zellviabilität transfiziert können. Diese...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81772308) und National Key Research and Development Program of China (Nr. 2017YFA0205502) unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DMEMGibcoC11995500BTWarm in 37° C Wasserbad vor Gebrauch
Fötales RinderserumGibcoA31608-02
Penicillin/Streptomycin (1,5 ml)Gibco15140122
Tetrazolium-basiertes MTS-Assay-KitPromegaG3582Für die Zytotoxizitätsanalyse
RAW 264.7 ZelllinieZellbank der Chinesischen Akademie der Wissenschaften, Shanghai, ChinaTCM13
Gewebekulturplatten (6-Well)Corning3516
Gewebekulturschalen (10 cm)Corning430167
RNasefreie Röhrchen (1,5 ml)AXYGENMCT-150-C
Zentrifugenröhrchen (15 ml)Corning430791
TrypsinGibco25200-056
Wistar RattenShanghai Experimental Animal Center of Chinese
Academy of Wissenschaften
Bacillus Calmette– Gué gefriergetrocknetes PulverNational
Institutes for Food and Drug Control, China		zur Induktion von adjuvanter Arthritis bei Ratten
siRNAGenePharma (Shanghai, China)
Cy3-siRNARiboBio (Guangzhou, China)
Polyethylenimin (10 kDa)Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.
AmmoniakwasserAladdin Chemisches Reagenz Co., Ltd.
ÖlsäureAladdin Chemisches Reagenz Co., Ltd.
DimethylsulfoxidAladdin Chemisches Reagenz Co., Ltd.
FeSO4• 7H2OSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10012118
FeCl3• 6H2OSinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd10011918
DimercaptobernsteinsäureAladdin Chemisches Reagenz Co., Ltd.
UltrafiltrationsröhrchenMilliporeUFC910096
TetramethylammoniumhydroxidlösungAladdin Chemical Reagent Co., Ltd.
Partikelgrößen- und Zetapotenzial-AnalysatorMalvern, EnglandNano ZS90
E107079A112077O108484D103272D107254T100882

Referenzen

  1. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723(2011).
  2. Maeß, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments. (91), e51960(2014).
  3. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The Expression of Exogenous Genes in Macrophages: Obstacles and Opportunities. Macrophages and Dendritic Cells. , Springer. 123-143 (2009).
  4. Zhang, M., Gao, Y., Caja, K., Zhao, B., Kim, J. A. Non-viral nanoparticle delivers small interfering RNA to macrophages in vitro and in vivo. PLoS ONE. 10 (3), e0118472(2015).
  5. Davignon, J. -L., et al. Targeting monocytes/macrophages in the treatment of rheumatoid arthritis. Rheumatology. 52 (4), 590-598 (2012).
  6. Brown, J. M., Recht, L., Strober, S. The promise of targeting macrophages in cancer therapy. Clinical Cancer Research. 23 (13), 3241-3250 (2017).
  7. Karunakaran, D., et al. Targeting macrophage necroptosis for therapeutic and diagnostic interventions in atherosclerosis. Science Advances. 2 (7), e1600224(2016).
  8. Prosperi, D., Colombo, M., Zanoni, I., Granucci, F. Drug nanocarriers to treat autoimmunity and chronis inflammatory diseases. Seminars in Immunology. 34, 61-67 (2017).
  9. Höbel, S., Aigner, A. Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (5), 484-501 (2013).
  10. Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (2), 129(2009).
  11. Liu, G., et al. N-Alkyl-PEI-functionalized iron oxide nanoclusters for efficient siRNA delivery. Small. 7 (19), 2742-2749 (2011).
  12. Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J. Imaging macrophages with nanoparticles. Nature Materials. 13 (2), 125(2014).
  13. Magro, M., et al. Covalently bound DNA on naked iron oxide nanoparticles: Intelligent colloidal nano-vector for cell transfection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1861 (11), 2802-2810 (2017).
  14. Abdelrahman, M., et al. siRNA delivery system based on magnetic nanovectors: Characterization and stability evaluation. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 106, 287-293 (2017).
  15. Zhang, H., Lee, M. -Y., Hogg, M. G., Dordick, J. S., Sharfstein, S. T. Gene delivery in three-dimensional cell cultures by superparamagnetic nanoparticles. ACS Nano. 4 (8), 4733-4743 (2010).
  16. Moghimi, S. M., Hunter, A. C., Murray, J. C. Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice. Pharmacological Reviews. 53 (2), 283-318 (2001).
  17. Harvey, A. E. Jr, Smart, J. A., Amis, E. Simultaneous spectrophotometric determination of iron (II) and total iron with 1, 10-phenanthroline. Analytical Chemistry. 27 (1), 26-29 (1955).
  18. Duan, J., et al. Polyethyleneimine-functionalized iron oxide nanoparticles for systemic siRNA delivery in experimental arthritis. Nanomedicine. 9 (6), 789-801 (2014).
  19. Fröhlich, E. The role of surface charge in cellular uptake and cytotoxicity of medical nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 7, 5577(2012).
  20. Wu, Y., et al. Ultra-small particles of iron oxide as peroxidase for immunohistochemical detection. Nanotechnology. 22 (22), 225703(2011).
  21. Xia, T., et al. Polyethyleneimine coating enhances the cellular uptake of mesoporous silica nanoparticles and allows safe delivery of siRNA and DNA constructs. ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).
  22. Mocellin, S., Provenzano, M. RNA interference: learning gene knock-down from cell physiology. Journal of Translational Medicine. 2 (1), 39(2004).
  23. Courties, G., et al. et al.In vivo RNAi-mediated silencing of TAK1 decreases inflammatory Th1 and Th17 cells through targeting of myeloid cells. Blood. 116 (18), 3505-3516 (2010).
  24. Zolnik, B. S., Gonzalez-Fernandez, A., Sadrieh, N., Dobrovolskaia, M. A. Minireview: nanoparticles and the immune system. Endocrinology. 151 (2), 458-465 (2010).
  25. Mulens-Arias, V., Rojas, J. M., Pérez-Yagüe, S., Morales, M. P., Barber, D. F. Polyethylenimine-coated SPIONs trigger macrophage activation through TLR-4 signaling and ROS production and modulate podosome dynamics. Biomaterials. 52, 494-506 (2015).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

Übertragung kleiner interferierender RNAMakrophagen-TransfektionIn-vitro-siRNA-ÜbertragungIn-vivo-siRNA-ÜbertragungNanopartikelsyntheseMagnetische SeparationDurchflusszytometrie-AnalyseGene-Silencing-AssayZellviabilitätsprüfung
Polyethyleneimine beschichteten Eisenoxid-Nanopartikeln als Vehikel für die Lieferung von kleinen interferierende RNA an Makrophagen In Vitro und In Vivo
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.