Polyethyleneimine beschichteten Eisenoxid-Nanopartikeln als Vehikel für die Lieferung von kleinen interferierende RNA an Makrophagen In Vitro und In Vivo

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Methode der Verwendung von Polyethyleneimine (PEI)-superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln für transfecting Makrophagen mit SiRNA beschichtet. Diese Nanopartikel können effizient SiRNA zu Makrophagen in Vitro und in Vivo und Stille Ziel Genexpression liefern.

Zusammenfassung

Wegen ihre entscheidende Rolle bei der Regulation der Immunantwort Makrophagen kontinuierlich Gegenstand intensiver Forschung und stellen eine vielversprechende therapeutische Ziel bei vielen Erkrankungen wie Autoimmunerkrankungen, Arteriosklerose und Krebs. RNAi vermittelte Gen-silencing ist ein wertvoller Ansatz, Sonde und Makrophagen Funktion zu manipulieren; jedoch die Transfektion von Makrophagen mit SiRNA wird oft als technisch anspruchsvoll, und zur Zeit gibt es einige Methoden, die die SiRNA-Übertragung auf Makrophagen gewidmet. Hier präsentieren wir ein Protokoll mit Polyethyleneimine beschichteten superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln (PEI-Mondfotos) als Vehikel für die gezielte Bereitstellung von SiRNA zu Makrophagen. PEI-Mondfotos sind in der Lage, verbindliche und vollständig kondensiert SiRNA erreicht die Fe: SiRNA-Gewichts-Verhältnis 4 und vor. In-vitro-, diese Nanopartikel können effizient SiRNA liefern, in primären Makrophagen sowie in die Makrophagen-wie RAW 264,7 Zell-Linie, ohne kompromittierende Zellviabilität an die optimale Dosis für Transfection und, letztlich, sie induzieren SiRNA-vermittelten Ziel Gen-silencing. Neben für in-vitro- SiRNA Transfection verwendet, sind PEI-Mondfotos auch ein viel versprechendes Instrument für die Bereitstellung von SiRNA zu Makrophagen in Vivo. Angesichts seiner kombinierten Funktionen der magnetische Eigenschaft und Gen-silencing Fähigkeit dürften systemisch verabreichten PEI-SPION/SiRNA-Partikel nicht nur zu modulieren, Makrophagen-Funktion, sondern auch aktivieren Makrophagen abgebildet und nachverfolgt werden. PEI-Mondfotos repräsentieren im Wesentlichen eine einfache, sichere und wirksame nonviral Plattform für SiRNA Lieferung an Makrophagen in Vitro und in Vivo.

Einleitung

Makrophagen sind eine Art von angeborenen immunen Zellen verteilt in allen Körpergeweben, wenn auch in unterschiedlichen Mengen. Durch die Herstellung einer Vielzahl von Zytokinen und anderer Vermittler, spielen sie wichtige Rollen in der Wirt Verteidigung gegen eindringende mikrobielle Krankheitserreger, in Reparatur von Gewebe nach Verletzungen und bei der Aufrechterhaltung der Homöostase-Gewebe¹. Aufgrund ihrer Bedeutung waren Makrophagen kontinuierlich Gegenstand intensiver Forschung. Jedoch trotz der Prävalenz in der Genregulation und Funktionsstudien, SiRNA-vermittelten Gen-silencing ist weniger wahrscheinlich, da in Makrophagen erfolgrei....

Protokoll

Alle Methoden, die mit lebenden Tieren, im Einklang mit dem Tier durchgeführt wurden kümmern und Richtlinien der Southeast University, China.

1. Vorbereitung des PEI-Mondfotos

1. Vorbereitung der Ölsäure geändert Mondfotos
   1. Lösen sich FeCl₃•6H₂O und FeSO₄•7H₂O in Wasser unter dem Schutz der N₂.
      1. Hinzufügen von FeCl₃•6H₂O 28 g und 20 g FeSO₄•7H₂O in 80 mL entionisiertem Wasser in ein Becherglas. Führen Sie N₂ in das Wasser durch eine Glas-Leitung ein und rühren Sie, bis die feste Materie aufge....

Ergebnisse

Die Größe und Zeta Potential der PEI-Mondfotos vorbereitet mit diesem Protokoll wurden im Bereich von 29-48 nm (Polydispersität Index: 0,12 - 0,23) und 30-48 mV, beziehungsweise. Sie waren seit über 12 Monaten ohne offensichtliche Aggregation im Wasser bei 4 ° C stabil. Um ihre SiRNA verbindliche Fähigkeit zu bewerten, wurden PEI-Mondfotos mit SiRNA bei verschiedenen Fe: SiRNA-Gewichts-Verhältnis gemischt. Abbildung 1 zeigt, dass erreicht die Fe: SiRNA-Gewich.......

Diskussion

Makrophagen sind refraktär gegenüber von häufig verwendeten nonviral Ansätze wie Elektroporation, kationische Liposomen und Lipid Arten transfizieren. Hier haben wir eine zuverlässige und effiziente Methode, um Makrophagen mit SiRNA transfizieren. Mit Hilfe dieses Protokolls, werden über 90 % der Makrophagen-wie RAW 264,7 Zellen (Abb. 2 b) und Ratte peritonealen Makrophagen¹⁸ mit SiRNA ohne wesentliche Beeinträchtigung des die Zellviabilität transfiziert können. Diese.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DMEM	Gibco	C11995500BT	Warm in 37° C Wasserbad vor Gebrauch
Fötales Rinderserum	Gibco	A31608-02
Penicillin/Streptomycin (1,5 ml)	Gibco	15140122
Tetrazolium-basiertes MTS-Assay-Kit	Promega	G3582	Für die Zytotoxizitätsanalyse
RAW 264.7 Zelllinie	Zellbank der Chinesischen Akademie der Wissenschaften, Shanghai, China	TCM13
Gewebekulturplatten (6-Well)	Corning	3516
Gewebekulturschalen (10 cm)	Corning	430167
RNasefreie Röhrchen (1,5 ml)	AXYGEN	MCT-150-C
Zentrifugenröhrchen (15 ml)	Corning	430791
Trypsin	Gibco	25200-056
Wistar Ratten	Shanghai Experimental Animal Center of Chinese Academy of Wissenschaften
Bacillus Calmette– Gué gefriergetrocknetes Pulver	National Institutes for Food and Drug Control, China		zur Induktion von adjuvanter Arthritis bei Ratten
siRNA	GenePharma (Shanghai, China)
Cy3-siRNA	RiboBio (Guangzhou, China)
Polyethylenimin (10 kDa)	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.
Ammoniakwasser	Aladdin Chemisches Reagenz Co., Ltd.
Ölsäure	Aladdin Chemisches Reagenz Co., Ltd.
Dimethylsulfoxid	Aladdin Chemisches Reagenz Co., Ltd.
FeSO4• 7H2O	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10012118
FeCl3• 6H2O	Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd	10011918
Dimercaptobernsteinsäure	Aladdin Chemisches Reagenz Co., Ltd.
Ultrafiltrationsröhrchen	Millipore	UFC910096
Tetramethylammoniumhydroxidlösung	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.
Partikelgrößen- und Zetapotenzial-Analysator	Malvern, England	Nano ZS90

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