Hier stellen wir Ihnen ein Protokoll zur Untersuchung der Wirkung von der Aufhebung der Verkos-Genen auf Immunreaktionen eine Dextran Sulfat Natrium (DSS)-induzierte entzündliche Darm-Krankheit (IBD)-Maus-Modell.
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Methodenartikel
Auswirkungen des Geschmacks Signalisierung Protein Abschaffung auf Darm-Entzündung in eine entzündliche Darm-Krankheit-Maus-Modell
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Chronisch entzündliche Darmerkrankungen (IBD) gehört zu den immunvermittelte Magen-Darm-Störungen, einschließlich Colitis ulcerosa und Morbus Crohn, die die Lebensqualität von Millionen von Menschen weltweit betrifft. IBD Symptome sind Bauchschmerzen, Durchfall und rektale Blutungen, die sich aus den Wechselwirkungen zwischen Darm Microbiota, Nahrungsbestandteile, intestinale Epithelzellen und Immunzellen. Es ist von besonderer Bedeutung zu beurteilen, wie jeder Schlüssel-Gen in intestinalen epithelialen und Immun-Zellen exprimiert Entzündung im Dickdarm betrifft. G-Protein-gekoppelten Geschmacksrezeptoren, einschließlich G-Protein-Untereinheit α-Gustducin und andere Signalproteine wurden im Darm gefunden. Hier verwenden wir α-Gustducin als Vertreter und beschreiben eine Dextran Sulfat Sodium (DSS)-induzierte IBD-Modell zur Bewertung der Wirkung der gustatorischen Genmutationen auf Darm-Schleimhaut-Immunität und Entzündungen. Diese Methode verbindet gen Ko-Technologie mit dem chemisch induzierten IBD-Modell und kann so angewendet werden, um das Ergebnis der gustatorischen gen Aufhebung sowie andere Gene, die exuberate oder dämpfen die DSS-induzierte Immunantwort im Dickdarm zu beurteilen. Mutierte Mäuse sind mit DSS für einen bestimmten Zeitraum verabreicht, während, die Körpergewicht, Hocker und rektale Blutungen überwacht und aufgezeichnet werden. An verschiedenen Zeitpunkten während der Verabreichung, einige Mäuse eingeschläfert werden, dann die Maße und Gewichte der Milz und Doppelpunkte werden gemessen und Darm Gewebe werden gesammelt und bearbeitet für histologische und Genexpressionsanalysen. Die Daten zeigen, dass die α-Gustducin Ko-Ergebnisse in übermäßiger Gewichtsverlust, Durchfall, Darmblutungen, Gewebeschäden und Entzündungen vs. Wildtyp Mäusen. Da die Schwere der induzierten Entzündung durch Mausstämme, Häuslichkeit und Ernährung beeinflusst wird, ist die Optimierung der DSS Konzentration und Verwaltung Dauer in einem Pilotversuch besonders wichtig. Durch die Anpassung dieser Faktors, kann diese Methode angewendet werden, um beide Anti - und Pro-inflammatorische Effekte zu beurteilen.
Einleitung
Die zwei Hauptformen von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) Morbus Crohn (CD) und Colitis ulcerosa (UC) zeichnen sich durch chronische remittent oder progredient entzündlichen Erkrankungen des Darms mit multifaktoriellen Ätiologie1,2 . Die Entwicklung der IBD hängt von genetischen als auch bestimmte Umweltfaktoren wie Ernährung, Einsatz von Antibiotika, und allem pathogenen Infektionen. Die Ätiologie und molekularen Regulationsmechanismen, die zugrunde liegenden IBD sind jedoch noch unklar. Daher wurden zahlreiche chemisch induzierte IBD-Tiermodellen aufgebaut und angewendet, um abzugrenzen, die Pathogenese und Regulationsmechanismen und die Wirksamkeit der menschlichen Therapeutika3.
Geschmacksrezeptoren sind G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) und sind als zwei Haupttypen klassifiziert: Typ I (T1Rs) und Typ II (T2Rs), die süß, Umami und Bitterstoffe erkennen. Geschmack Signalisierung Kaskaden sind initiierten tastant Bindung an T1Rs oder T2Rs, Aktivierung der Heterotrimeric G-Proteine, bestehend aus α-Gustducin und ein Gβγ-Dimer und führt zur Freisetzung von Gβγ-Untereinheiten. Die Gβγ glyko-stimuliert wiederum die nachgeschaltete Effektor Enzym Phospholipase C-β2 (PLC-β2). Aktivierte PLC-β2 dann hydrolysiert Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate in zwei intrazellulären sekundären boten [Inositol-1,4,5-Trisphosphate (IP3) und Diacylglycerol] und IP-3 bindet an und öffnen Sie die Kanal-Rezeptor-IP3 R3, Freigabe von Calcium-Ionen aus dem endoplasmatischen Retikulum. Dies führt schließlich zu der Eröffnung des Transienten Rezeptor potenzielle Ionenkanal Trpm5 und Freisetzung der Neurotransmitter ATP auf die geschmackliche Nerven4,5,6,7. Die Signalwege der salzig und sauer Geschmack sind jedoch verschiedene, voneinander unabhängige aus süß, Umami und bitter schmeckt8. Darüber hinaus gibt es die Komponenten des Geschmacks GPCRs und nachgeschalteten Proteinen in verschiedenen extraoralen Geweben. Jüngste Studien gezeigt, dass α-Gustducin, die wichtigste Komponente der Geschmack Signalisierung, findet sich in der Darmschleimhaut ausgedrückt werden. Weitere Studien sind notwendig, um die Funktionen dieser Komponenten im extraoralen Gewebe9,10-Signalisierung Geschmack zu verstehen.
Die hier beschriebene Methode wird verwendet, um Funktionen der gustatorischen Signalproteine in extraoralen Geweben ausgedrückt zu charakterisieren. Wir kombinieren eine transgene Mauslinie für die Abgrenzung der Signalisierung Kaskaden in Geschmacksknospen mit chemisch induzierten Kolitis-Modell entwickelt. Weitgehend wegen seiner prozessualen Einfachheit und pathologischen Ähnlichkeiten zum menschlichen Colitis ulcerosa, die Dextran Sulfat Natrium (DSS)-induzierte IBD-Modell wird am häufigsten unter den verschiedenen chemisch induzierten Kolitis Modelle11. In dieser Studie haben wir α-Gustducin-defizienten Mäusen als eine repräsentative Mauslinie um neuartige Funktionen von α-Gustducin Darm-Schleimhaut-Immunität und Entzündungen zu enthüllen, indem er (1) Analyse der morphologische Veränderungen im Gewebe und (2) prüfen Unterschiede in der Expression von Zytokine, die im Zusammenhang mit Entzündungen im Dickdarm. Diese Methode lässt sich quantitativ und qualitativ die Beiträge der gustatorischen Signalproteine (und andere Proteine im Darm) bestimmen zu Gewebeschäden und Darmentzündungen, wenn gentechnisch veränderte Maus für die Gene der Linien Interesse stehen zur Verfügung. Vorteile dieser Methode ermöglichen es Benutzern, integrierte Daten, die aus Handlungen der chemischen DSS und Mangel an das gen des Interesses zu erhalten. Diese Methode kann weiter verbessert werden, um die Empfindlichkeit zu erhöhen und feine Darm Veränderungen auf zellulärer und molekularer Ebene zu offenbaren.
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Protokoll
Alle Experimente mit Mäusen wurden überprüft und genehmigt durch die institutionelle Animal Care und Nutzung Ausschüsse der Zhejiang-Universität. Es wird empfohlen, vor der Durchführung dieses Protokolls geeigneten persönlichen Schutzausrüstung zu tragen.
1. Vorbereitung von Mäusen und DSS
- Halten Sie die (α-Gustducin- / -)-Knockout-Mäusen und Alter, Geschlecht, und Gewicht abgestimmt Wildtyp Körperbeherrschung (α-Gustducin+ / +) C57BL/6 Mäusen einzeln in sauberen Käfigen.
Hinweis: Die Knockout-Mäusen haben seit mehr als 20 Generationen mit C57BL/6 Mäusen backcrossed worden und haben einen fast 100 % C57BL/6 genetischen Hintergrund. - 30 g Dextran Sulfat Natrium (DSS) Pulver in 1 L autoklaviert Wasser auflösen. Mischen Sie, bis die Lösung klar um sicherzustellen, dass die Endkonzentration arbeiten 3 % (w/V).
Hinweis: Die DSS-Lösung kann bei Raumtemperatur bis zu 1 Woche oder bei 4 ° C bis zum Gebrauch gespeichert werden.
(2) Induktion und Bewertung der DSS Kolitis bei Mäusen
- Weigh und nimmt jede Maus ursprünglichen Körpergewichts. Legen Sie die Mäuse einzeln in Kunststoff Standardkäfige und beschriften Sie die Käfige.
- Ersetzen Sie regelmäßige Trinkwasser mit 3 % DSS-Lösung für insgesamt 7 Tage beide Gruppen von Mäusen Zugang Ad Libitum müssen.
- Der Maus Körpergewicht messen, aufzeichnen DSS Lösung Verbrauch, und sammeln und untersuchen des Hockers jede Maus täglich während der DSS-Administration. Beobachten Sie die schwere Durchfall und rektale Blutungen zu und wandeln Sie diese an die DSS-induzierte Krankheit Index12.
- Während des Experiments der Gewichtsverlust im Vergleich zum ursprünglichen Gewichts und der Krankheit-Index sind berechnet, um die Symptome der Colitis zu bewerten.
Hinweis: Die Krankheit-Index wird erzielt durch die Kombination von Beobachtungen von Durchfall und rektale Blutungen und sind wie folgt definiert: 0 (normalen Stuhlgang, kein Blut), 1 (weicher Stuhl, kein Blut), 2 (weicher Stuhl, wenig Blut), 3 (sehr weicher Stuhl, bescheidene Blutungen), und 4 (wässriger Stuhl, bedeutende Blutung)12. Die Krankheit-Index wird täglich für jede Maus analysiert. - Bis zum Ende der 7-Tages-DSS-Therapie Opfern Sie die Mäuse durch zervikale Dislokation zu und fahren Sie mit den restlichen Experimenten.
3. Vorbereitung von Gewebeproben
- Platzieren Sie den Mauszeiger in die Rückenlage und reinigen Sie die Haut des Bauches mit 70 % Ethanol. Machen Sie einen 3 cm langen Mittellinie Schnitt in den Bauch mit einer kleinen Schere, die Bauchhöhle verfügbar zu machen.
- Verwenden Sie ein paar Pinzette sorgfältig trennen die Milz aus anderen Geweben, dann die Milz zu entfernen und ihre Größe zu messen.
- Identifizieren Sie und heben Sie den Doppelpunkt mit Zange und trennen Sie ihn von den umliegenden Mesenterium. Ziehen Sie den gesamten Dickdarm bis Blinddarm und Rektum sichtbar sind.
- Isolieren des Dickdarms vor, am Rand Colonocecal und tief in das Becken, die proximalen und distalen Colon, bzw. zu befreien. Dann messen Sie und notieren Sie die Länge des Dickdarms isoliert. Achten Sie darauf, dass nicht das Kolon Gewebe während der sezierenden Verfahren beschädigt werden.
- Spülen Sie den Doppelpunkt mit 10 mL eiskaltes Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit einer 10 mL Spritze mit einer Magensonde Nadel ausgestattet, um den Kot und Blut zu entfernen, bis das Eluat völlig klar ist.
- Zur histologischen Identifikation, teilen die Gewebeproben gleich in drei Teile: mittleren proximalen und distalen. Dann befestigen Sie das Gewebe mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) über Nacht bei 4 ° C.
- Für die Analyse der Cytokine Ausdruck den gesamten Dickdarm schnell mit flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-80 ° C bis zur Verwendung speichern.
4. histologische Beurteilung des Schweregrades der DSS-induzierte Kolitis
- Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung
- Tauchen Sie nach der Fixierung dem Gewebe in einer Lösung von 30 % Saccharose in 1 X PBS über Nacht in einer 15 mL Tube, Cryoprotect Proben.
- Betten Sie das Gewebe in optimale Arbeitstemperatur (OCT) zusammengesetzte ein und legen Sie sie bei-20 ° C, bis das Office-Anpassungstool härtet.
- Übertragen des OCT-Blocks enthält das Gewebe zu einem Kryostaten, Dicke Stellrad im Kryostaten, 12 µm, und in Scheiben schneiden und 12 µm dicken Gefrierschnitte zu sammeln.
- Erhitzen Sie die gesammelten Gewebeschnitte aus einem Kryostaten bei 65 ° C für 20 min auf einer heißen Platte.
- Waschen Sie die Abschnitte kurz in destilliertem Wasser. Färben sie mit Hämatoxylin Färbelösung für 5 min und anschließend mit fließendem Leitungswasser für 5 min spülen.
- Die Abschnitte mit 0,5 % Salzsäure-Ethanol für 30 s und spülen sie in laufenden Wasserhahn für 1 min zu unterscheiden. Dann führen Sie die Wäsche mit 1 X PBS-Puffer für 1 min und anschließend mit fließendem Leitungswasser für 5 min spülen.
- Führen Sie waschen die Gewebeschnitte in 70 %, 75 %, 80 % und 95 % Alkohol, jeweils für 10 S. Gegenfärbung in Eosin Färbelösung 2 min. lang.
- Führen Sie Austrocknung durch 95 % Alkohol und 2 Änderungen des absoluten Alkohols für 5 min jedes Mal. Klar in 2 Änderungen von Xylol für 5 Minuten.
- Partitur Gewebeschäden des mittleren proximalen und distalen Colon jede Maus für die gen-Knockout und Wildtyp Gruppen anhand der Ergebnisse der oben genannten H & E Färbung.
Hinweis: Die Krankheit-Index ist eine kombinierte Kerbe von epithelialen Schäden und Entzündungen in der Schleimhaut, Submukosa, Muscularis und Darmhaut Regionen, die wie folgt definiert ist: 0 (keine Gewebeschäden und Entzündungen), 1 (fokale Gewebeschäden und Entzündungen), 2 (lückenhaft Gewebeschäden und Entzündungen) und 3 (diffuse Gewebeschäden und Entzündungen)12,13. Drei Punkte per Mausklick für die mittleren proximalen und distalen Teile des Dickdarms werden dann addiert, um ein Gesamtergebnis für jedes Tier zu erhalten. Die Durchschnittswerte für jede Gruppe werden dann berechnet.
- Immunohistochemistry14
- Erhitzen Sie die gesammelten Gewebeschnitte aus einem Kryostaten bei 65 ° C für 20 min auf einer heißen Platte. Waschen Sie die Abschnitte in 1 X PBS 3 Mal für 10 min. Inkubieren Sie die Gewebeschnitte in 3 % Wasserstoffperoxid für 10 min, endogene Peroxidase zu beseitigen. Waschen Sie die Abschnitte 3 weitere Male. Blockieren Sie das Gewebe mit Puffer (3 % BSA, 0,3 % nicht-ionische Waschmittel, 2 % Ziegenserum, 0,1 % Natriumazid in 1 X PBS) bei Raumtemperatur 1 Stunde oder mehr zu blockieren.
- Ersetzen den blockierenden Puffer mit einer Lösung, die folgende Immunzelle Typ-spezifischen primären Antikörper enthält: CD45 für Leukozyten CD3 für T-Zellen, B220 für B-Zellen, CD11b für Makrophagen und Ly6G für die Neutrophilen. Über Nacht bei 4 ° C inkubieren.
- Entfernen Sie die primären Antikörper aus Gewebeschnitten durch Absaugen. Waschen Sie die Abschnitte mit 1 X PBS 3 Mal für 10 Minuten. Inkubieren Sie die Abschnitte mit biotinylierte Sekundärantikörper gefolgt von Inkubation mit Streptavidin-HRP-Komplex bei Raumtemperatur.
- Inkubieren Sie die Abschnitte mit 3, 3'-Diaminobenziding (DAB) Lösung für ein Licht oder dunkel-braunen Farbe zu entwickeln und visualisieren die immunreaktiven Zellen.
- Die Abschnitte mit Hämatoxylin und 0,3 % (V/V) verdünnt Ammoniak counterstain. Hellfeld Bilder bei 10facher Vergrößerung unter dem Mikroskop zu nehmen.
- Verwenden Sie ein Bildbearbeitungsprogramm zu identifizieren und quantifizieren die Bevölkerung von den markierten Immunzellen in das Epithel und Lamina Propria (unter dem Epithel) durch Einstellung 2 Masken: die erste Maske in der Farbe-Cube-basierten-Funktion verwenden, um eine Farberkennung festzulegen Schwelle und messen die DAB-reaktive Farbflächen; Verwenden Sie die zweite Maske Gesamtfläche des Epithels und laminar Propria im untersuchten Bereich bestimmen. Ausdruck der immunreaktiven Zellpopulation als Verhältnis des Bereichs Färbung der infiltrierten Zellen auf die Gesamtfläche des untersuchten Gewebes.
5. gen Ausdruck Bewertung der DSS-induzierte Kolitis
- Rufen Sie der Doppelpunkt-Gewebe aus der DSS-behandelten gen Knockout und Wildtyp Mäusen aus einem-80 ° C Gefrierschrank ab und fügen Sie 0,6 mL Lyse-Puffer auf 25 mg des Gewebes, dann in einem Homogenisator zu homogenisieren.
- Folgen Sie dem RNA-Extraktion-Kit Protokoll zum Extrahieren der Gesamt-RNS und DNase I verwendet, kontaminierenden genomischen DNA zu beseitigen.
- Führen Sie eine Agarosegel um die Qualität der extrahierten RNA zu überprüfen. Wenn seine 28 s RNA Band heller als 18 Band ist, ist es verwendbar. Nehmen Sie 1 µL RNA-Probe die RNA-Konzentration auf einen Microspectrophotometer zu bestimmen.
- Mix 1 µg von Gesamt-RNS mit 2,5 µL 20 mM Oligo (dT)12,13,14,15,16,17,18 Zündkapseln und 1 µL Moloney murine Leukämie Virus (MMLV) Reverse Transkriptase. Inkubieren Sie bei 42 ° C für 60 min, die cDNA vorzubereiten.
- Richten Sie Echtzeit-PCR-Reaktionen durch das Mischen von 1µL die cDNA mit 0,5 µL vorwärts und rückwärts qPCR Zündkapseln für TNF, IFN-γ, IL-5, IL-13, IL-10 und TGF-β1 β-Actin als Kontrolle zusätzlich 2 x grünen Fluoreszenzfarbstoff.
- Die qPCR mit den folgenden Parametern ausführen: 95 ° C für 10 min, gefolgt von 45 Zyklen von 95 ° C für 10 s, 50 ° C für 25 s und 72 ° C für 20 s.
- Berechnen Sie die relative Quantifizierung der Genexpression mit Hilfe der 2–ΔΔCt Methode15. Analysieren Sie vergleichsweise gen Ausdruck Niveaus in der Ko- Vs. Wildtyp Mäusen.
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Ergebnisse
Ein DSS-induzierte IBD-Verfahren wurde von 3 % administrieren DSS im Trinkwasser zu α-Gustducin-Knockout (KO) und Wildtyp (WT) Mäuse. Im Vergleich zu WT Mäuse, stellte die Knockout-Mäusen schwerer Kolitis mit übermäßiger Gewichtsverlust, Durchfall und Darmblutungen (Abbildung 1). Nach einer 7-Tage-DSS-Verwaltung die Unterschiede im Gewebe Integrität wurden mit H & E Färbung als die histologische Methode analysiert und mehr schwere Gewebeschäden fand sich ...
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Diskussion
Diese Methode kann eingesetzt werden, um quantitativ bestimmen die Wirkung von Mutationen bestimmter Gene geschmackliche auf Entzündung in einem Mausmodell der DSS-induzierte IBD. Um alle Vorteile nutzen, ist optimale Induktion von IBD ein wichtiger Schritt. Die Entwicklung des ulcerosa ist von mehreren Faktoren ab, einschließlich Maus Stamm, Häuslichkeit, Darmflora, sowie die Gene von Interesse beeinträchtigt. Es wird empfohlen, einen Pilotversuch mit eine kleine Anzahl von Mäusen testen Sie verschiedene Dosierungen und...
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Danksagungen
Diese Arbeit wird durch Zuschüsse aus dem National Natural Sciences Foundation of China (81671016, 31471008 und 31661143030) und die National Institutes of Health (DC010012, DC015819) und die Siyuan Stiftung unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Antibody | |||
| CD45 | BD Biosciences | 550539 | |
| CD3 | BD Biosciences | 555273 | |
| B220 | BD Biosciences | 550286 | |
| CD11b | BD Biosciences | 550282 | |
| Ly6G | BD Biosciences | 551459 | |
| < strong>Reagenz | |||
| Dextransulfat-Natriumsalz (DSS) | MP Biomedicals | 2160110 | |
| Streptavidin-HRP-Komplex | BD Pharmingen | 551011 | |
| H& E Färbekit | BBI Life Sciences | E607318 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Sangon Biotech | B548117 | |
| FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) | Roche | 4913850001 | |
| MMLV Reverse Transkriptase, GPR | Clontech, TaKaRa | 639574 | |
| TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraktionskit | TaKaRa | 9767 | |
| BD 10 mL Spritze | BD Biosciences | 309604 | |
| Instrumente und Geräte | |||
| balance | |||
| Schere | |||
| Pinzettenzentrifuge | |||
| qPCR-Maschine | |||
| zum Färben von Gläsern | |||
| Software | |||
| Imag-Pro Plus | Medien Kybernetik, Inc. |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
