Fluoreszierende silberne Färbung von Proteinen im Polyacrylamid-Gele

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll umreißt eine neue fluoreszierende Färbung Technik für Gesamt-Protein Nachweis in Polyacrylamid-Gele. Das Protokoll nutzt eine Sonde, Silber Ionen-spezifische Fluoreszenz Turn-on, die Ag⁺erkennt-Proteinkomplexe, und gewisse Einschränkungen der traditionellen chromogenen Silber Flecken beseitigt.

Zusammenfassung

Silberne Färbung ist ein kolorimetrischen Verfahren häufig verwendet, um Protein-Bands in Polyacrylamid-Gele nach Sodium Dodecyl Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) zu visualisieren. Der klassische silberne Flecken haben bestimmte Nachteile wie hoher Hintergrund Färbung, schlechte Proteingewinnung, niedrige Reproduzierbarkeit, einen schmalen linearen Dynamikbereich zur Quantifizierung und begrenzte Kompatibilität mit der Massenspektrometrie (MS). Jetzt, mit dem Einsatz einer Fluorogenic Ag⁺ Sonde, TPE-4TA, entwickelten wir eine fluoreszierende silberne Färbung Methode für die Gesamt-Protein-Visualisierung in Polyacrylamid-Gele. Dieser neue Fleck vermeidet das lästige Silber Reduktionsschritt in traditionellen silbernen Flecken. Darüber hinaus zeigt der fluoreszierende silberne Fleck gute Reproduzierbarkeit, Sensibilität und lineare Quantifizierung in Protein-Erkennung, so dass es einen nützliches und praktisches Protein Gel Fleck.

Einleitung

Viele Färbung Methoden wurden verwendet, um Proteine nach Gelelektrophorese, z. B. Verwendung von farbmetrischen Farbstoffen wie Coomassie Brilliant Blue, silbernen Fleck, Fluoreszenz zu visualisieren oder radioaktive Markierung^{1,2, 3 , 4}. silberne Färbung gilt als eines der sensibelsten Techniken für Proteindetektion erfordern einfache und billige Reagenzien. Es kann in zwei große Gruppen unterteilt werden: der ammoniakalischen Silber Fleck und das Silbernitrat Flecken^5,6. In der alkalischen ammoniakalischen Silber-Methode ist der Silber-Diamin-Komplex mit Ammoniak und Natriumhydroxid hergestellt und während der Entwicklung mit einer sauren Formaldehyd-Lösung zu metallischem Silber reduziert. Der Fleck beherbergt effizient für grundlegende Proteine aber zeigt eine kompromittierte Performance für saure und neutrale Proteine und ist darüber hinaus auf klassischen Glycin und Taurin elektrophoretischen Systemen beschränkt. Im Vergleich dazu die Silbernitrat Flecken nutzen die hohe Bio-Affinität von Silberionen an Protein, in erster Linie die Sulfhydryl Carboxylgruppen Gruppen aus den Seitenketten und tendenziell saure Proteine effizienter Fleck⁷. Nach Silberionen verbindlich, eine entwickelnde Lösung (in der Regel aus einer Metall-Karbonat-Lösung, die Formaldehyd und Natrium Thiosulphate) wird angewendet, um die Silberionen zu metallischem Silber Körner zu verringern, die eine braun-dunkel Farbe visualisieren bauen die Protein-Bänder.

Obwohl Silber Färbung bekannt für seine Vielseitigkeit und hohe Empfindlichkeit seit seiner Entwicklung in den 1970er Jahren⁸gewesen, wird die Methode häufig als schwierig angesehen. Silber-Färbung Methoden haben zeitlich begrenzte Schritte und zeigen niedrige Reproduzierbarkeit. Da die Farbe des silbernen Fleck in der Regel nicht ist einheitlich und Reduktionsschritt, die schwer zu kontrollieren ist abhängig, der silberne Fleck ist keine quantitative Methode und somit nicht für Gel Vergleich Studie und Protein Quantifizierung⁹empfohlen. Methoden in der Empfindlichkeit optimiert können Aldehyde verwenden, die auch eine gleichmäßigeren Färbung¹⁰anbieten können. Dies ist jedoch auf Kosten der weiteren nachgeschalteten Analyse durch die Vernetzung von Proteinen durch Aldehyde. Schnelle Protokolle meist kombinieren oder kürzen Sie Schritte zu verkürzen, die Reproduzierbarkeit und Einheitlichkeit der Fleck⁵zu beeinträchtigen. Infolgedessen gibt es zahlreiche Silber Färbung Varianten innerhalb Protein Gel Färbung, jeweils optimiert, um bestimmte Anforderungen zu entsprechen; zum Beispiel, Einfachheit, Sensibilität oder Peptid Verwertungsquote für nachgelagerte Analyse. Diese Attribute haben ebenfalls einen Einfluss auf einander, und erfüllt alle Anforderungen in einem Protokoll kann schwierig sein.

In dieser Arbeit stellen wir eine neue fluoreszierende silberne Färbung Methode zur Proteindetektion Polyacrylamid-Gel. Bei dieser Methode verwenden wir Fluorogenic Sonde für Silberionen, TPE-4TA (Abbildung 1), die Silber-imprägnierte Proteine¹¹zu visualisieren. TPE-4TA richtet sich nach dem Prinzip der Aggregation-induzierte Emission (AIE). Es ist nicht emissiven, in wässriger Lösung aufgelöst, jedoch höchst emissiven in Anwesenheit von Silber-Ionen. Indem die chromogene Entwicklung im traditionellen silbernen Flecken mit einer Fluorogenic Entwicklung Schritt ermöglicht die fluoreszierende silberne Methode die robuste Färbung des gesamten Proteine mit einem reduzierten Hintergrund.

Darüber hinaus zeigte die fluoreszierende silberne Fleck eine gute lineare Dynamik für Protein Quantifizierung, die vergleichbar mit den weit verbreiteten SYPRO Ruby Fleck und mit traditionellen silbernen Flecken nicht erreichbar ist. Das Gel kann auf häufig verwendete Gel-Dokumentation-Systeme mit einer UV-Lampe abgebildet (Erregung Wellenlänge: 302/365 nm Kanal; Emission: ~ 490-530 nm) bei vielen biologischen Labs.

Protokoll

1. Vorbereitung des Gels

Hinweis: Die Demonstration folgt ein standard Protokoll, um das Gel kurz nach SDS-PAGE¹²Färbung vorbereiten. Kurz gesagt, die folgenden Schritte beschreiben die Vorbereitung der Proben und gel-Elektrophorese.

1. SDS-PAGE mit 4 % - 12 % Bis-Tris Protein Gele (1 mm, 15-Brunnen) durchführen mit einem Mini-Gel Tank gefüllt mit 2-(N -Morpholino) Ethanesulfonic Säure (MES) Puffer.
2. Verdünnen Sie die Proben mit einer Mischung aus destilliertem Wasser, Lithium-Dodecyl-Sulfat (LDS)-Puffer und eine Probe-Reduktionsmittel.
3. Laden Sie die erste Spur mit doppelt so viel Lager (10 µL), gefolgt von der normalen Lager Menge (5 µL) und eine Reihe von doppelten Verdünnungen des Bestandes danach (von 2 X bis 8192 X 13 Verdünnungen).
4. Laufen Sie das Gel bei einer konstanten Spannung von 200 V für 30 min.

2. Fixierung des Gels

1. Tauchen Sie nach Elektrophorese die Gele in einer 100 mL-Lösung von 40 % ethanol/10% Essigsäure auf einem Orbitalschüttler bei 50 u/min bei Raumtemperatur 2 x (jeweils für 30 min), oder über Nacht bei 4 ° C.
2. Waschen Sie die Gele 3 x 10 min in Reinstwasser in einem sauberen Behälter. Die Waschschritt ist von entscheidender Bedeutung. Wenn die Säure aus der Festlegunglösung im dritten Schritt Fluorogenic nicht ordnungsgemäß entfernt wird, die übermäßigen TPE-4TA wird durch die Säure aktiviert werden und führen zu starken Hintergrundfluoreszenz im Gel.

3. Vorbereitung des AgNO₃Lösung und Silber Imprägnierung des Gels

1. AgNO₃ Lösung (0,0001 %) machen für die Imprägnierung zunächst lösen Sie 0,01 g von AgNO₃ in 10 mL Reinstwasser eine 0,1 % AgNO₃ Stammlösung vorbereiten auf. Als nächstes fügen Sie 100 µL der Stammlösung 0,1 % AgNO₃ in 100 mL Reinstwasser, funktionierende Lösung zu machen.
   Hinweis: Die AgNO₃ Lösung sollte in der Dunkelheit vor dem Gebrauch aufbewahrt werden.
2. Imprägnieren Sie das Gel mit 100 mL Silber arbeiten Lösung für 1 h auf einem Orbitalschüttler bei 50 u/min in einem verschlossenen Glascontainer. Es ist entscheidend für die silberne Imprägnierung unter einem Abzug, lichtgeschützt mit Alu-Folie durchführen.
3. Waschen Sie das Gel mit Reinstwasser (ca. 100 mL) in einem sauberen Behälter für 2 x 60 s.

(4) Fluorogenic Entwicklung des Gels

1. Zur Vorbereitung der Farbstoff-Stammlösung (0,1 mM) fügen Sie 3,0 mg des TPE-4TA Farbstoffs in 50 mL Reinstwasser hinzu. Beschallen Sie die Lösung für ein paar Minuten und fügen Sie einige NaOH-Lösung (z.B. 1 M) um den Farbstoff lösen zu helfen.
2. Überprüfen Sie die Fluoreszenz der Lösung unter einer 365 nm UV Lampe um sicherzustellen, dass die Farbstoff-Moleküle vollständig aufgelöst ist. Schwache oder nonemissive Lösungen immer nur volle Auflösung angegeben.
   Hinweis: Der Farbstoff war TPE-4TA synthetisiert folgendes Protokoll kürzlich von Xie Et Al. berichtete ¹⁰ die TPE-4TA -Lösung ist sehr stabil und kann monatelang im Dunkeln gehalten werden.
3. Um 100 mL der Fluorogenic entwickelnden Lösung (10 µM) vorzubereiten, fügen Sie 10 mL der TPE-4TA Vorratslösung in 90 mL Reinstwasser. Überprüfen Sie den pH-Wert der Lösung mit einem pH-Meter und tune es 7-9 mit einer Natriumhydroxid-Lösung (1 µM).
4. Übertragen Sie das Gel auf einen sauberen und verschließbaren Behälter mit 100 mL der Fluorogenic entwickelnden Lösung. Stellen Sie sicher, dass das Gel ganz in die Lösung eingetaucht ist. Verschließen Sie den Behälter. Bedecken Sie es vor Licht und schütteln Sie sie über Nacht auf einem Orbitalschüttler bei 50 u/min bei Raumtemperatur. Alternativ kann die Inkubationsschritt auch auf ca. ~ 2 h verkürzt werden, durch Vorwärmen der AIE entwickelnden Lösung auf 80 ° C zum Beizen und dann verlassen sie bei Raumtemperatur.

(5) entfärben und Imaging

1. Das Gel auf einen sauberen Behälter übertragen und in 100 mL 10 % Ethanol für 30 min destain.
   Hinweis: Wasser allein kann verwendet werden, um das Gel zu waschen. Es ist jedoch mehr Zeit-effizient zu nutzen eine 10 % ige Ethanol-Lösung für das entfärben. Dadurch wird das destaining Verfahren von Stunden auf 30 Minuten verkürzen.
2. Spülen Sie das Gel in Reinstwasser für 5 Minuten.
3. Bild das Gel auf die 365 nm oder 302 nm-Kanal von einer Gel-Dokumentation-Maschine.

Ergebnisse

Die Protein-Bands befleckt durch fluoreszierende silberne Flecken zeigen ein intensives grün fluoreszieren unter 365 nm UV-Licht. Alle 14 Protein Bänder (10-200 kDa), waren von oben nach unten, deutlich sichtbar, korreliert gut mit den 14 rote Flecken von SYPRO Ruby Farbstoff (Abbildung 2)¹⁰.

In Bezug auf quantitative Proteindetektion die Gele wurden durch ein Gel imaging-Sys...

Diskussion

Hier vorgestellten ist eine neuartige fluoreszierende silberne Färbung Methode für Proteine in Polyacrylamid-Gele. Diese Strategie integriert konventionellen Silber Flecken und fluoreszierende Flecken. Die Färbung Heldentaten die selektive Bindung von Silberionen an Proteine wie in anderen Silber Flecken aber beschäftigt eine hochempfindliche Fluorogenic Silber Sonde TPE-4TA , um die silberne gebundene Proteine Leuchten. Da die Fluorogenic Sonde TPE-4TA silberne-Ionen bei einer relativ n...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
LDS-Probenpuffer (4X)	Thermo Fisher Scientific	NP0007	Reagenz
4-12 % Bis-Tris-Proteingele, 1,0 mm, 15 Well	Thermo Fisher Scientific	NP0323BOX	Vorgefertigtes Gel
Probenreduktionsmittel (10x)	Thermo Fisher Scientific	NP0004	Reagenz
MES SDS Laufpuffer (20x)	Thermo Fisher Scientific	NP0002	Reagenz
Mini Gel Tank	Thermo Fisher Scientific	A25977	Ausrüstung
300W Netzteil (230 VAC)	Thermo Fisher Scientific	PS0301	Ausrüstung
Ungefärbtes Protein Leiter	Thermo Fisher Scientific	26614	Probe
Silbernitrat	Sigma-Aldrich	31630-25G-R	Reagenz
Ethanol	Bragg und Co.	42520J	Reagenz
Essigsäure	J.T. Baker	103201A	Reagenz
Milli-Q Synthese A10		Merk-Liefert	18,2 MΩ. cm
Wasser-Gel-Dokumentationssystem (Modell C600)	Azure Biosystems-Equipment