Her presenterer vi en protokoll for ex vivo kvalitativ påvisning av antigen-spesifikke CD8+ T celler. Analyse er mulig med enkeltcelle suspensjoner fra organer eller små mengder blod. En rekke studier krever analyse av cytotoxic T celle svar (vaksinasjon og kreft immunterapi studier).
Ved virusinfeksjon, antigen-spesifikke CD8+ cytotoxic T-celler (CTLer) oppstår og bidra til eliminering av infiserte celler å hindre spredning av patogener. Hyppigheten av antigen-spesifikke CTLer er derfor indikasjon på styrken av T celle respons mot en bestemt antigen. Slike analyser er viktig i grunnleggende immunologi, vaksineutvikling, kreft immunobiology og det adaptive immunologi. I feltet vaksine bestemmer CTL svaret rettet mot komponentene i en viral vektor co hvor effektiv generasjonen av antigen-spesifikke celler mot antigen rundt (dvs., transgene) er. Antigen-spesifikke CTLer angis enten ved stimulering med bestemte peptider etterfulgt av intracellulær cytokin flekker eller ved den direkte flekker av antigen-spesifikke T celle reseptorer (TCRs) og analyse av flowcytometri. Den første metoden er ganske tidkrevende siden det krever å ofre dyr å isolere celler fra organer. Dessuten krever det isolering av blod fra små dyr som er vanskelig å utføre. Sistnevnte er ganske rask, kan enkelt gjøres med små mengder blod og er ikke avhengig av spesifikke effektor funksjoner som cytolytic aktivitet. MHC tetramers er et ideelt verktøy for å oppdage antigen-spesifikke TCRs.
Her beskriver vi en protokoll for samtidig oppdage antigen-spesifikke sertifikatklareringslister for immunodominant peptidene av viral vektoren VSV-GP (LCMV-GP, VSV-NP) og effekter av transgener (OVA, HPV 16 E7, eGFP) av MHC jeg tetramer flekker og flyt cytometri. Flekker er mulig direkte fra blod eller fra enkelt celle suspensjoner av organer, som milten. Blod eller enkeltcelle suspensjoner organer er ruges med tetramers. Etter med antistoffer mot CD3 og CD8 er antigen-spesifikke CTLer kvantifisert av flowcytometri. Eventuelt antistoffer mot CD43, CD44, CD62L eller andre kan være med å bestemme aktiviseringen rang av antigen-spesifikke CD8+T celler og å forskjellsbehandle naiv og Effektor celler.
Målet med denne metoden er å vurdere svarfrekvensen cytotoksisk T lymfocytt (CTL) mot (flere) antigener i musen flyt cytometric analysen uten behov for tidkrevende peptid stimulering. Denne metoden analyserer fenotypen og antigen spesifisitet av CTL undergrupper, i en enkelt flekker. Vi optimalisert Major Histocompatibility Complex jeg (MHC jeg) tetramer flekker protokollen for å analysere effekten av ny vaksine tilnærminger, slik som VSV-GP, en ny variant av vesicular stomatitt viruset (VSV), der glykoprotein G av VSV har blitt erstattet av den glykoprotein GP av lymfatisk choriomeningitis virus (LCMV)1,2. Humoral respons er en viktig avlesing av effektiviteten av en vaksine induksjon av en CTL reaksjon mot én eller flere antigener. Som konsekvent og holdbarhet av cellulær respons er viktig i denne sammenheng, er det gunstig å overvåke kinetics CTL svar fra samme dyret. Dette vil også føre til en reduksjon av dyr tall, et viktig aspekt om prinsippene i “3Rs”3. Dermed er analyse fra så lite som 20 µL av blod optimal for dette formålet.
Tetramers ble utviklet sent på 90-tallet4 og ble et viktig verktøy i T celle immunologi. Tetramers er fluorescently-merket komplekser av fire MHC jeg / peptid molekyler, som binder seg til TCRs, spesifikk for en enkelt peptid. I dag kan enten kjøpes ferdige5, tilpasset bestilt gratis på NIH Tetramer Core anlegget ved Emory University6 eller produsert i laboratoriet7. MHC jeg og II tetramers er tilgjengelig, dvs. for CD8+ og CD4+ T celler, henholdsvis. Styrken på tetramer flekker ligger i tidsbesparelser, ganske enkel og lett å standardisere8 protokoller og følsomhet9. Også, hvis arbeider med blod, dyr trenger ikke å bli ofret og minimale mengder eksempel kreves. Ett mål er ikke begrenset til en enkelt antigen, men flere antigener kan analyseres på en flekker når kombinere tetramers konjugert med ulike fluorophores. Nyoppdagede antigener, for eksempel fra peptid skjermer, kan enkelt innarbeides i tetramers og brukes for kvantifisering av T-celle delsett.
Tetramer flekker vil ikke gi informasjon om CTL-funksjonalitet (i.e., cytokin produksjon, funksjoner effektor), men bare spesifisitet. Få informasjon om T celle funksjonalitet, intracellulær cytokin flekker (ICS) eller enzym koblede Immuno sted (ELISpot) analysen må utføres8,10. Tetramer flekker og ICS/ELISpot, men er ikke redundant, men heller utfyller hverandre. In vitro stimulering å indusere cytokin produksjon for ICS/ELISpot vil endre opprinnelige T celle fenotypen. Tetramer flekker, i motsetning forlater T cellen urørt; opprinnelige fenotypen beholdes og kan analyseres. En annen stor fordel av tetramers er også at flekker kan kombineres med magnetiske sortering og berikelse av antigen-spesifikke celler11. Dette gir analyse av sjeldne befolkninger, samt dyrking av sorterte celler med definerte antigen-særegenheter – en funksjon som er ikke mulig med andre metoder.
Ved hjelp av protokollen beskrevet her tetramer flekker, samt ICS/ELISpot kan utføres fra ett organ, fordi bare svært lite materiale (blod: 20 µL, milt: 1 x 106 celler) kreves for tetramer flekker. Imidlertid avhengig av frekvensen av antigen-spesifikke cellene rundt styrken til de respektive TCR og eksperimentelle sammenheng, hvor mye celler kreves må skaleres eller magnetiske berikelse må brukes.
Tetramers er mye brukt, for eksempel å vurdere effektiviteten av (antitumor) vaksiner12,13,14,15 eller immunterapi16,17, fenotypiske analyse og romlig lokalisering av antigen-spesifikke T-celle delsett18,19,20,21,22,23. Metoden beskrevet her er egnet for studier som mål å inkludere kvantifisering og fenotypiske analyse av murine antigen-spesifikke CD8+ T celler i sine analyser på en rask og enkel måte.
Tetramer flekker er en ganske enkel og ukomplisert protokoll analysere fenotypen og peptid spesifisitet av en T lymfocytt. Bruken av blod for analyse, som beskrevet her, er minimalt invasiv og tillater kontinuerlig overvåking, for eksempel i vaksinasjon studier. I feltet vaksinasjon er kvantifisering av vektor – og antigen-spesifikke tiltak av interesse, som vektor-spesifikke tiltak kan hindre en effektiv immunrespons mot vaksine antigen28. Merk er at med protokollen beskrevet her, populasjonene kan kvantifiseres samtidig i en enkelt tetramer flekker, og dermed redusere flekker variasjon og utvalg beløp. Noen skritt må imidlertid være forsiktig måling og pålitelige data. Hvis bruker blod fra halen venen for analyse, burde en sikre å forvarme dyrene å indusere vasodilatasjon24. Dermed tilstrekkelig blod kan samles på kort tid og stress på dyrene reduseres for å analysen er mye bedre sammenlignet hvis blod samles sakte. Etter prøvetakingen (blod eller organer) anbefales direkte flekker også å unngå falske negative resultater på grunn av TCR downregulation. Det samme gjelder for alle påfølgende trinnene: prosedyren skal ikke avbrytes og alle vask trinnene redusert til færrest (som nevnt i protokollen). For å sikre riktig flekker, bør omsorg tas til vortex alle løsninger og prøver før og etter inkubasjon. Dette er spesielt viktig før fikse prøvene for å unngå klumper av celler.
Når det gjelder å endre protokollen, kan andre overflate markører og tetramers brukes, avhengig av formålet med analysen. Reagenser så må imidlertid være titreres, optimalt i kombinasjon med hele flekker panelet. For noen av tetramers som er angitt her, optimalisering avslørte at vi kan øke fortynning anbefalt av produsenten (1:10 anbefalt, optimalisert 1:25) (tabell 1). For å kompensere spectral overlapping, kan kompensasjon perler brukes i stedet for farget celler. Angående valg av tetramer-kombinert fluorochrome, en skal forestille seg for å bruke lys fluorochromes, som dette forenkler detection – spesielt når signalet er lav. Som Dolton og kolleger29, vil vi bruke PE – eller APC-kombinert tetramers, som kan kombineres i en enkelt flekker og CD8 perfekt+ T celler med en enkelt antigen spesifisitet kan være pent oppdaget (figur 2). Om temperatur og inkubasjon ganger, en rekke tetramer flekker forhold eksisterer. I vår optimaliseringsprosessen, vi løst problemet og utført tetramer flekker på ulike forhold (f.eks 4 ° C, romtemperatur eller 37 ° C). Fra resultatene, anbefaler vi stain etter 20 min på 37 ° C, som er i samsvar med litteratur30,31. Langvarig inkubasjon bør unngås, da dette kan føre til internalization tetramer30 og falske negative resultater.
Valg av rett antistoffer for påvisning av CD8+ celler er en annen viktig sak, som må nøye vurdert (og potensielt tilpasset). Dette oppstår fra faktum at enkelte anti-CD8 antistoff kloner blokk binding av tetramers til TCR, menneskelige32 samt mus33 prøver. For våre tetramer flekker protokollen, vi valgte klone 53-6,7 stain for murine CD8+ celler – en klone som blokkerer ikke, men heller forbedrer tetramer flekker.
Tetramer flekker er ganske ukomplisert når analysere fremtredende immunreaksjoner på toppen av T celle svaret, for eksempel. Det kan imidlertid være populasjoner som er litt mer ‘problematisk’. Slike eksempler celler spesifikke for lav affinitet antigener (svulst, selv), nylig aktivert celler som senere ned-regulert deres reseptorer eller sjeldne celle undergrupper (f.eks. naiv forløper eller minne celle populasjoner). I disse tilfellene kan det klassisk tetramer flekker protokollen må forbedret eller kombinert med andre metoder. For eksempel protein kinase inhibitor (PKI) dasatinib hemmer TCR internalisering og inkluderes før tetramer flekker. Tetramers kan også bli stabilisert av inkludert anti-fluorochrome unconjugated primære Abs etter tetramer flekker. I tillegg kan du øke fluorescens intensitet med tillegg av en andre anti-Ab fluorochrome-konjugerte Ab29,34,35,36. Vi optimalisert betingelsene selektivt for tetramers angitt i denne protokollen og inkluderte ikke PKI eller ekstra Abs. For alle andre tetramer har imidlertid optimale forhold justeres individuelt. Når det gjelder sjeldne befolkninger må tetramer flekker kombineres med magnetiske berikelse11.
For å lette og validere FACS analyse av tetramer flekker, skal negative og positive kontroller inkluderes. Som en negativ kontroll flekken vi alltid celler med en naiv mus på den samme stammen med våre tetramer rundt. Alternativt kan eksempler være farget med tetramers med irrelevante peptider, men med den samme fluorochrome som tetramer av interesse. Slike kontroller er avgjørende å ekskludere falske positive signaler, f.eks., fra døende celler. I tillegg er det anbefalt å inkludere en live/dead flekk, som propidium iodide (PI). Dette er av spesiell betydning hvis cellene ikke er flekket rett etter isolasjon. En annen strategi for å fjerne autofluorescence bakgrunnen kan være å inkludere flere T celle markører i én kanal. Ved å ekskludere celler positivt i denne kanalen, kan T celle populasjoner utelukkes. Som en positiv, kan et utvalg fra en OT-1 musen brukes for OVA tetramer, for eksempel. For andre tetramers, har dette velges individuelt (f.eks., eksempel fra en mus, som var vaksineres flere ganger). Både andre37, vi også ser en ned-regulering av CD8 reseptoren under CTL aktivering på dag 7 av effektor T celle respons. For å unngå tap av aktivert tetramer+ effektor T celler, anbefaler vi derfor for å inkludere CD8lav cellene i analysen (minst hvis måle i effektor fase).
Kvaliteten og mengde informasjon en kan hente fra denne protokollen er avhengig av kunnskap om antigen studier, tilgjengelighet og spesifisitet av tetramer og kvaliteten på FACS maskinen (antall lasere og tilgjengelig detektorer). Hvis arbeider med dyr prøver, er variant i immunforsvaret naturlige og uunngåelige. Derfor, for å få meningsfulle resultater fra tetramer flekker, minst 3-5 dyr skal analyseres. Hvis gjort det, gir protokollen beskrevet her pålitelig og reproduserbar resultater (eksemplarisk resultatet av et eksperiment kan bli funnet i Tilleggstabellen 1). Som nevnt før, denne metoden er perfekt å kvantifisere fenotypen og antigen spesifisitet av CD8+ T celler (Figur 3, 4; Supplerende figur 1), ikke bare i musen men også hos mennesker. Men analysere CD8 fungerer+ T-celler effektor som granzyme-indusert celledød, ICS og/eller ELISpot må utføres. Imidlertid bør man huske på at T celle funksjoner, målt ved i vitro stimulering ikke kanskje representerer den faktiske situasjonen i vivo. In vivo, et undertrykkende miljø kan hindre T celle-funksjoner som er målt i vitro.
På sin egen tetramer flekker ikke gir all informasjon, men det utfoldet for å bli en viktig metode for å beskrive T celle svar og kvantifisere T-celle delsett i vitro i en svært følsom måte38. Tetramers kan bare brukes å kvantifisere visse undergrupper, men også for å isolere de39, lokalisere dem av i situ hybridisering19,20 og studere lav-affinitet antigener, slik som tumor-assosiert40, 41. siden oppdagelsen av tetramer teknologi4, tetramer flekker har blitt et uunnværlig verktøy i T-celle analyse og utvalget av programmer.
The authors have nothing to disclose.
Dette prosjektet ble finansiert av FWF østerrikske Science Fund (prosjektnummeret P 25499-B13) og EUs horisonten 2020 forskning og innovasjon programmet under gi avtalen nr. 681032. Følgende reagensen var oppnådd gjennom NIH Tetramer Core anlegget: klasse I MHC Tetramer for vesicular stomatitt virus nucleoprotein (RGYVYQGL).
Safety cabinet class 2 | VWR | LBCP302411030 | |
Flow cytometer (e.g. FACSCanto II) | BD | 338962 | |
Analysis platform for flow cytometry analysis (e.g. FlowJo) | Fisher Scientific Co. L.L.C. | NC0887833 | |
Binocular microscopes, VisiScope 100 | VWR | 630-1553 | |
Vortex mixer | Phoenix Instrument | RS-VA 10 | |
Centrifuge suitable for FACS tubes (e.g. Rotanta 460R) | Hettich | 5660 | |
Sterile Scalpel Blades Nr. 10 | Braun | BB510 | |
Cell strainer 40 µm | Sigma | CLS431750 | |
Cell strainer 70 µm | Sigma | CLS431751 | |
Neubauer counting chamber | VWR | 630-1506 | |
Pipettes (20 μL, 200 µL and 1000 μL) | Eppendorf | 4924000037, 4924000061, 4924000088 | |
Pipette tips, sterile (20 µL, 200 µL, 1000 µL) | Biozym | 770050, 770200, 770400 | |
Pipet Boy | Integra | 155 000 | |
Sterile pipettes (5 mL, 10 mL, 25 mL) | Sarstedt | 86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001 | |
Multistep Pipette, HandyStep S | BRAND | 705110 | |
12.5 ml Combitips for Multistep Pipette | BrandTech Scientific | 702378 | |
Microvette CB 300 K2E | Sarstedt | 16.444 | |
Sterile reaction tubes (1.5 mL, 50 mL) | Sarstedt | 72.692.005, 62.547.254 | |
FACS tubes (non-sterile) | Szabo Scandic | BDL352008 | |
PBS | Lonza | LONBE17-516F | |
Heat-inactivated FCS | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
Formaldehyde | Roth | 4979.1 | |
Sodium azide | Roth | K305.1 | |
PE-Cy7 Rat Anti-Mouse CD3 Molecular Complex | BD | 560591 | Clone 17A2; Lot # 7235504 |
Pacific Blu Rat Anti-Mouse CD8a | BD | 558106 | Clone 53-6.7; Lot # 5058904 |
V450 Rat anti-Mouse CD8a | BD | 560469 | Clone 53-6.7; Lot # 5205945 |
FITC anti-mouse CD43 | BioLegend | 121206 | Clone 1B11; Lot # B233778 |
PE-Cy5 Rat Anti-Mouse CD44 | BD | 553135 | Clone IM7; Lot # 85660 |
APC-Cy7 Rat Anti-Mouse CD62L | BD | 560514 | Clone MEL-14; Lot # 7215801 |
OVA-tetramer/APC | MBL | TB-5001-2 | SIINFEKL, H-2Kb; Lot # T1702008 |
VSV NP-tetramer/PE | MBL | TS-M529-1 | RGYVYQGL, H-2Kb; Lot # 007 |
EGFP-tetramer/PE | MBL | TS-M525-1 | HYLSTQSAL, H-2Kd; Lot # 004 |
LCMV-GP-tetramer/APC | MBL | TB-5002-2 | KAVYNFATC, H-2Db; Lot # T1412006 |
HPV 16 E7-tetramer/APC | MBL | TB-5008-2 | RAHYNIVTF, H-2Db; Lot # T1804003 |