Listeria monocytogenes Infektion des Gehirns

Zusammenfassung

Während der Infektion kann Listeria Monocytogenes überqueren der Blut - Hirn-Schranke um das Gehirn zu besiedeln. In diesem Protokoll veranschaulichen wir die bakterielle Besiedlung der Organe nach Infektion der Mäuse zu beurteilen. Ein Verfahren zur gesamten Organ Perfusion zur spezifischen Bestimmung der bakteriellen Zahlen in der Anwesenheit von durchführen steht zur Verfügung.

Zusammenfassung

Listeria Monocytogenes ist eine intrazelluläre bakterielle Erreger, die häufig von lebensmittelbedingten Infektionen zugeordnet ist. Die Fähigkeit von L. Monocytogenes , überqueren Sie die Blut - Hirn-Schranke (BBB) ist über, wie es zu lebensbedrohlichen Meningitis und Enzephalitis führen kann. Die BBB schützt das Gehirn Mikroumgebung von verschiedenen toxischen Metaboliten und mikrobielle Krankheitserreger im Blut nach Infektion gefunden und unterstützt damit Gehirn Homöostase. Die Mechanismen, durch die L. Monocytogenes in den Blutkreislauf vorhanden überqueren die BBB verursachen Gehirn, die Infektionen nicht vollständig verstanden sind und es fehlt auch an ein stabiles Modellsystem Gehirn Infektionen von L. Monocytogeneszu studieren. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache Mausmodell Infektion zu bestimmen, ob Bakterien die BBB überquert haben und die Belastung durch Bakterien quantitate, die das Gehirn in Vivobesiedelt haben. Bei dieser Methode Tiere wurden intravenös mit L. Monocytogenes infiziert und wurden durch die Einwirkung von CO₂ gefolgt von zervikale Dislokation Human eingeschläfert. Kardiale Perfusion der Tiere erfolgte vor der Ernte infizierter Organen. Blut war vor Perfusion gesammelt und die Anzahl der Bakterien pro Organ oder mL Blut wurde bestimmt durch Ausplattieren Verdünnungen von Blut oder Orgel Homogenates auf Agarplatten und zählen die Anzahl der Kolonien gebildet. Diese Methode kann verwendet werden, um neuartige Rezeptor-Ligand-Interaktionen zu untersuchen, die Infektion des Gehirns von L. Monocytogenes und kann für die Untersuchung von mehreren bakteriellen Krankheitserregern leicht angepasst werden.

Einleitung

Das grampositive Bakterium Listeria Monocytogenes ist ein fakultativ intrazellulärer Erreger und von der meisten tödlichen lebensmittelbedingten Krankheitserregern weltweit. Einnahme von L. Monocytogenes kontaminierte Lebensmittel führen zu Listeriose beim Menschen eine schwere invasive Erkrankung gezielt vor allem Schwangere, Neugeborene, die älteren und immungeschwächten Menschen¹. L. Monocytogenes gehört zu den führenden Todesursachen durch ein Lebensmittel übertragbaren Erreger in den USA und Fall Sterberaten von Listeriose sind so hoch wie 20-30 %, die höchste für alle lebensmittelbedingten Krankheitserregern². Derzeit existiert kein Impfstoff für L. Monocytogenes und die Fähigkeit der Bakterien, für distale Organe und das Gehirn effektiv zu verbreiten, durch die Kreuzung der Blut - Hirn-Schranke (BBB) führen zu lebensbedrohlichen Hirnhautentzündung und Kolonisierung des Gehirns^{3 , 4 , 5 , 6}. bakterielle Meningitis ist in der Regel schwere; während die meisten Menschen, die Behandlung erholen, können Infektionen schwerwiegende Komplikationen, z.B., Hirnschäden, Hörverlust oder Lernbehinderungen bei Kindern verursachen. L. Monocytogenes wird vorausgesagt, um mindestens 10 % der ganzen Gemeinschaft berücksichtigen Meningitis in der US-⁷erworben.

Eine wichtige Route für bakterielle Verbreitung des Gehirns und der Hirnhäute wird durch den Blutstrom. Bakterien im Umlauf in den Blutgefäßen im Gehirn sind in der Lage die BBB zum Gehirn zu Infektionen führen zu überqueren. Die BBB ist ein stark vaskularisierte Barriere, die das Gehirn vor Fremdkörper im Blut zirkulierenden schützt. Endothelzellen bilden eine Schicht, die die innere Oberfläche der Blutgefäße^8,9Linien. Neben L. Monocytogeneskönnen mehrere bakterielle Krankheitserreger wie Neisseria Meningitidis, Streptococcus Pneumoniae, Escherichia coliund Haemophilus Influenzae Typ B (Hib) besiedeln das Gehirn durch die Kreuzung der BBB^3,4,5,6. Bakterielle Belastungen im Gehirn von infizierten Mäusen untersucht, ist es jedoch wichtig zu bestimmen, ob Bakterien die BBB überquert haben, ansonsten die bakterielle Belastung im Gehirn Bakterien darstellen kann, die noch in den Blutgefäßen des Gehirns sind. Daher ist es notwendig, die Mäuse alles Blut vor der Festlegung der koloniebildenden Einheiten (KBE) des Gehirns Homogenates durchspülen.

In dieser Studie beschreiben wir in-Vivo -Methoden um L. Monocytogenes -Infektion des Gehirns zu untersuchen. Für die hier beschriebenen Methoden verwendet wir L. Monocytogenes Stamm 10403S. L. Monocytogenes 10403S ist eines der am weitesten verbreitete laborbelastungen systemische Listeriose im Mausmodell der Infektion¹⁰zu studieren. Dieses Protokoll basiert auf standard intravenöse Injektion von L. Monocytogenes gefolgt von Perfusion der Mäuse. Abbildung 1zeigt ein schematischer Überblick über die Infektion Protokoll bei Mäusen. L. Monocytogenes-infizierten Gehirn und andere Organe von nicht durchblutet oder PERFUNDIERTEN Mäuse wurden gesammelt und die bakterielle Orgel Belastung bestimmt. Diese Methoden eignen sich für die Bestimmung nicht nur total bakteriellen Besiedelung des Gehirns bei infizierten Tieren, sondern sind auch vorteilhaft zur Feststellung, ob Bakterien die BBB in Vivo , Invasion des Gehirns zu vermitteln eingedrungen sind. Es ist wichtig hervorzuheben, dass diese Laborprotokoll durchgeführt werden sollte, nach Rücksprache mit dem relevanten institutionellen Biosafety Committee und Tier Facilitymanagement.

Protokoll

Alle Tiere sind gepflegt und behandelt mit größter Sorgfalt um Beschwerden im Verlauf des Verfahrens zu minimieren. Das Verfahren ist in Übereinstimmung mit den institutionellen Animal Care und Use Committee und alle staatlichen und lokalen Gesetze durchgeführt werden. Auch beachten Sie, dass die Labor-Experimente nach Biosafety Level 2 Richtlinien durchgeführt werden.

1. Wachstum von L. Monocytogenes für Studien an Mäusen Infektion

1. Autoklaven 500 mL Brain Heart Infusion (BHI) Agar Medium in einem 1 L-Erlenmeyer-Kolben Nährboden Platten vorbereiten. Lassen Sie die Medien im Wasserbad 56 ° C abkühlen und fügen Sie dann in einer Endkonzentration von 100 µg/mL Streptomycin.
   1. Gießen Sie 25 mL Medien/Petrischale in Petrischale Teller. Lassen Sie die Platten trocken bei Raumtemperatur (22 ^oc-25 ° C). Bei Bedarf können die Platten bei 37 ° C, bis es komplett trocken getrocknet werden.
2. Mit einem sterilen Impfkeimen Schleife und aseptische Technik, erhalten eine volle Schleife von gefrorenen L. Monocytogenes Stamm 10403S^11,12 aus einem Lager Kultur eingefroren in der BHI Medien plus 30 % Glycerin und pflegen in einem-80 ° C Gefrierschrank.
   1. Streifen der L. Monocytogenes auf einer BHI Agar/Streptomycin Platte, so dass einzelne Bakterienkolonien isoliert werden können. Legen Sie die Platten in einem 37 ° C über Nacht Inkubator (18 h bis 24 h), um L. Monocytogenes Kolonien wachsen.
   2. Mit einer sterilen Impfkeimen Schleife, wählen Sie ein einzelnes L. Monocytogenes Kolonie von der BHI-Agar-Platte und die Kolonie in ein steriles Röhrchen mit 5 mL BHI-Bouillon mit 100 µg/mL Streptomycin impfen.
3. Inkubieren Sie L. Monocytogenes Kultur Rohr leicht geneigt, bei 30 Grad über Nacht in einem statischen Inkubator.
   1. Überprüfen Sie am folgenden Tag, die L. Monocytogenes Kultur für Wachstum (die BHI-Medien werden trübe) und Vortex kurz darauf eine homogene Suspension der Kultur.
   2. Aseptisch entfernen Sie eine 1 mL Aliquot der bakteriellen Kultur und messen die Extinktion bei 600 nm (OD₆₀₀) mit einem Spektralphotometer.
      Hinweis: Sterile BHI-Bouillon dient als Rohling für das Spektrophotometer vor der Messung der optischen Dichte von L. Monocytogenes Kultur lesen. L. Monocytogenes Kultur kann auch verdünnt werden (zwei zu fünffache) im BHI vor dem Lesen der optischen Dichte.
   3. Bestimmen Sie die Anzahl von L. Monocytogenes Kolonie bildende Einheiten (KBE) pro mL BHI Kultur durch Ausplattieren 10-divisibel serielle Verdünnungen der Kultur. Dies ist nützlich, um eine Beziehung zwischen der optischen Dichte von L. Monocytogenes Kultur und die Anzahl der Bakterien pro mL Kultur zu etablieren. In der Regel entspricht ein OD₆₀₀ von 1.0 für eine L. Monocytogenes Kultur ca. 1 x 10⁹ KBE Bakterien pro mL.

2. Vorbereitung von L. Monocytogenes für Infektion der Mäuse

1. Achtzehn bis vierundzwanzig Stunden vor tierischen Infektion wachsen L. Monocytogenes Kulturen im BHI-Bouillon mit 100 µg/mL Streptomycin und bestimmen die OD₆₀₀/ ~ KBE pro mL wie in Schritt 1 angegeben.
   Hinweis: Mäuse sind in der Regel eine Woche vor Infektion bestellt und sind an der Tierhaltung vor der Infektion, die Untersuchungen müssen eingewöhnt. In dieser Studie 6 – 8 Wochen alten weibliche Mäusen BALB/c (5 Mäusen pro Gruppe) wurden in einer Barriere-Umgebung in der Harvard Medical School BSL2-Niveau tierisches Containment Anlage untergebracht und versorgt Nahrung und Wasser Ad Libitum.
2. Bestimmung der Höhe der L. Monocytogenes Kultur verpflichtet, jede Maus basierend auf infizieren die ~ KBE pro mL Bakterienkultur. Nehmen Sie eine Verdünnung der L. Monocytogenes Kultur in sterilen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung pH 7,2 (PBS) an die entsprechende Konzentration von Bakterien. Mäuse sind in der Regel intravenös mit 200 µL PBS mit 1 – 2 × 10⁴ KBE von Bakterien/Tier infiziert.
3. Überprüfen Sie die Anzahl von L. Monocytogenes in das Inokulum durch Ausplattieren 10-divisibel Verdünnungsreihen auf BHI Agarplatten mit 100 µg/mL Streptomycin. Inkubieren Sie die Platten in einem Inkubator 37 ° C über Nacht die Anzahl von L. Monocytogenes geimpft per Mausklick wie folgt bestimmen:
   Inokulum (CFU) = (Anzahl der Kolonien x Verdünnungsfaktor) / mL verchromt x Volumen (mL) injiziert

3. Infektion von Mäusen mit L. Monocytogenes über intravenöse Tail Vene Injektion

1. Entfernen Sie die Deckel und Lebensmittel-Behälter aus dem Käfig mit den Mäusen zu, und legen Sie den Käfig unter einer 250 W Infrarot-Wärmelampe für 5 min.
   Hinweis: Diese Methode ermöglicht die Rute Venen zu erweitern, um sicherzustellen, dass Injektionen leichter durchzuführen sind.
   1. Legen Sie das Tier vorsichtig in eine entsprechend dimensionierte Maus bewegungseinschränkende Gerät um sicher das Tier während der Schweif Vene Spritzen zurückzuhalten.
2. Mischen Sie das L. Monocytogenes Inokulum (Schritt 2.2) und laden Sie das Inokulum in eine 1 mL Spritze mit einer 26 G-Nadel ausgestattet.
3. Suchen Sie eine seitliche Schweif Vene der Maus und Reinigen der Einstichstelle mit einem Alkoholtupfer oder ein Spray 75 % Ethanol.
4. Spritzen Sie sanft die Maus mit 200 µL der L. Monocytogenes Suspension in eine seitliche Schweif Vene mit der Spritze mit der Nadel 26 G.
   1. Verwenden Sie Baumwolle Gaze kurz Druck auf die Injektionsstelle, eine Blutung zu stoppen, und das Tier in einen neuen Käfig.
      Hinweis: Führen Sie diesen Vorgang für alle Mäuse injiziert werden und markieren Sie den Käfig mit entsprechenden Beschriftungen. Um festzustellen, die nach der Injektion Konzentration des Inokulums L. Monocytogenes , wiederholen Sie Schritt 2.3 mit der Restbetrag des Inokulums. Die intravenöse L. Monocytogenes -Infektion Inokulum pro Maus wird berichtet, wie die durchschnittliche KBE aus den vor- und nach der Injektion Inokulum Proben gemessen.
5. Die infizierten Tiere täglich zu überwachen, und notieren Sie offensichtlichen Anzeichen von Krankheit (z. B. gekräuselte Fell, Buckliger Haltung, träge Bewegung, Gewichtsabnahme). Entfernen Sie Tiere, die anscheinend deutlich moribund vor 72 Stunden nach der Infektion (z. B. 24, 48 Stunden nach der Infektion) aus der Studie und menschlich zu opfern. Weiterhin täglich bis zu 72 Stunden nach der Infektion alle verbleibenden Tiere geopfert werden.
   Hinweis: Die 50 % letale Dosis (LD₅₀) für L. Monocytogenes Stamm 10403S bei Mäusen BALB/c ist ~ 1 – 2 x 10⁴ KBE/Tier. Mäuse infiziert mit LD₅₀ Dosen von L. Monocytogenes unter Verwendung dieses Protokolls können Anzeichen einer Krankheit aufweisen, wie oben angegeben, und Ermittler könnte erwarten, dass die Mäuse zu erliegen, die Infektion nach 72 h nach der Infektion.

4. Präparation und kardiale Perfusion der Mäuse infiziert mit L. monocytogenes

1. Bei 72 h nach der Infektion (oder an eine zuvor gewünschten Zeitpunkt) einschläfern Sie die infizierte Mäuse mit einem Protokoll genehmigt durch die institutionelle Tier-Ethik-Kommission, wie CO₂ Erstickung durch zervikale Dislokation gefolgt.
   Hinweis: Wenn die Blutentnahme durchgeführt werden soll, minimieren Sie zerreißen der Blutgefäße während der Durchführung zervikale Dislokation.
   1. Bestätigen Sie, dass Mäuse durch das Fehlen einer Pfote zuckenden Antwort eingeschläfert worden sind.
      Hinweis: Wenn kardiale Perfusion durchgeführt werden soll, richten Sie eine automatische Pumpe/Perfusion System mit einer Durchflussrate von 4 mL Volumen/min.
2. Legen Sie das Tier auf dem Rücken in einer Dissektion Pfanne und tragen Sie 75 % Ethanol auf die Bauchhaut Fell Oberfläche auf.
3. Mit Schere, machen Sie einen Schnitt in der Bauchdecke und erweitern Sie den Schnitt knapp unterhalb des Brustkorbs zu.
4. Setzen Sie die Membran und viszeralen Organe.
   Hinweis: Achten Sie darauf, alle viszeralen Organe zu zerfleischen.
5. Öffnen Sie der Brusthöhle durch die Membrane schneiden und schneiden Sie den Brustkorb auf bilateraler Ebene um den linken Ventrikel des Herzens verfügbar zu machen.
6. Mit stumpfen Pinzette, sanft zu erfassen, das Herz und legen Sie eine Nadel 21 G Schmetterling in den linken Ventrikel auf Perfusion System angeschlossen und dann schneiden Sie vorsichtig den rechten Vorhof sammeln das Blut (~0.2 mL) in ein 2 mL Röhrchen mit 10 mM ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA), Gerinnung zu verhindern. Eine schematische Darstellung der kardialen Perfusion in der Maus ist in Abbildung 2dargestellt.
   Hinweis: Wenn die Durchblutung nicht durchgeführt werden soll, Blut erfasst durch Herzpunktion mit einer 1 mL Spritze und schnell übertragen in eine 2 mL-Röhrchen mit 10 mM EDTA, Gerinnung zu verhindern. L. Monocytogenes -infizierte Organe sind dann wie beschrieben (Schritt 5.1) geerntet.
7. Perfusion beginnen und das Tier 4 min mit 15 – 20 mL PBS mit 10 mM EDTA durchspülen.
   Hinweis: Bewerten Sie Perfusion durch Beobachtung der Blut und PBS-EDTA Lösung fließt durch den rechten Vorhof und in die Pfanne, Dissektion. Das Gehirn und Leber erscheint nach kompletten Perfusion sicherzustellen, dass die verbleibende Bakterien aus den geernteten Organe und nicht das zirkulierende Blut sind blanchiert.

5. Organraub und Bestimmung der bakteriellen Belastungen

1. Folgenden Perfusion, Ernte Organe (z.B. Leber, Milz) indem Sie sorgfältig jede Gefäßsystem und Bänder befestigt und die Organe separat in ein steriles 15 mL konische Röhrchen mit 5 mL sterilem kalt (4 ° C) PBS zu platzieren. Speichern Sie Proben auf Eis, bis weitere Verarbeitung erfolgt.
2. Um das Gehirn zu ernten, enthaupten Sie den Kopf hinter den Ohren mit einer Schere und schneiden Sie die Kopfhaut Haut dazwischen das Tier Augen hinunter die Mittellinie. Bei Bedarf schneiden Sie überschüssiges Gewebe der Schere gegen den Schädel gedrückt zu halten.
   1. Sanft legen Sie eine Spitze der Schere in das Foramen Magnum (die Öffnung in der Schädelbasis, durch den das Rückenmark verläuft) und seitlich in den Schädel auf beiden Seiten schneiden.
   2. Schneiden Sie sanft dem Schädel dazwischen das Nagetier Augen hinunter die Mittellinie, wobei Sie auf seitlichen Druck ausüben. Vermeiden Sie Störung des Gehirns und erhalten Sie minimalen Kontakt zwischen Hirngewebe und die Schere zu.
   3. Mit feiner Spitze Pinzette, öffnen Sie den Schädel um das Gehirn und legen Sie einen Spachtel zwischen der Unterseite des Gehirns und der Schädelbasis, das Gehirn zu entfernen.
      Hinweis: Dadurch reißen des Gehirns Nervenfasern.
   4. Übertragen Sie sorgfältig das Gehirn auf eine 15 mL konische Röhrchen mit 5 mL sterilem kaltem PBS.
   5. Verwerfen Sie die Maus Kadaver zu, und wiederholen Sie diese Schritte für die verbleibenden Tiere.
      Hinweis: Sobald alle Organe geerntet worden sind, reinigen Sie die Prozedur und bereiten auf die Orgel Homogenisierung bakterielle Belastungen zu bestimmen.
3. Reinigen Sie und Sterilisieren Sie die Spitze des einen Gewebe-Homogenisator gelegt in eine biologische Kabinett durch Einfügen von der Spitze und läuft den Homogenisator für 10 s sequenziell in 5 % Chlorid, steriles Wasser, 75 % Ethanol, steriles Wasser in einem separaten 15 mL konische Röhrchen enthalten.
4. Homogenisieren der infizierten Gehirn (~ 20 s auf Einstellung 6, max. u/min) in der 15 mL konische Röhre bis keine sichtbaren gewebefragmente bleiben.
   1. Sauber Homogenisator wie unter Punkt 5.3 beschrieben, Bakterien zu verhindern Kontamination der nächsten Orgel-Probe übertragen.
   2. Führen Sie den Prozess der Homogenisierung für alle anderen Organe (z.B. Leber, Milz).
   3. Sobald die Homogenisierung abgeschlossen ist, Reinigen der Homogenisator wie im Schritt 5.3 und Store bis zur weiteren Verwendung beschrieben.
5. 10-divisibel serielle Verdünnungen der Orgel Homogenates in sterilen PBS vorzubereiten und Platte die Verdünnungen auf BHI Agar/Streptomycin Platten zu ermitteln, die KBE pro Organ.
   Hinweis: Eine ähnliche Methode wird durchgeführt, um festzustellen, die KBE pro mL Blut.
   1. Nachdem alle Verdünnungen überzogen sind, übertragen Sie die Platten in einem Inkubator 37 ° C über Nacht.
   2. Am folgenden Tag, die Anzahl der Kolonien auf jeder Platte, die Gesamtzahl der Bakterien pro Organ oder mL Blut wie folgt zu bestimmen:
      KBE/Orgel = (Anzahl der Kolonien x Verdünnungsfaktor) / mL Homogenat vernickelt X 5
      KBE/mL Blut = (Anzahl der Kolonien x Verdünnungsfaktor) / mL Blut überzogen

Ergebnisse

Das Gehirn ist stark durchblutet und L. Monocytogenes ist bekanntermaßen Zelltypen im Blut^3,13infizieren. Das beschriebene Protokoll wird verwendet, um die Fähigkeit von L. Monocytogenes , überqueren Sie die Blut - Hirn-Schranke (BBB) führt zur Infektion des Gehirns bei Mäusen zeigen. Um festzustellen, ob Bakterien die BBB in Vivoüberquert haben, erfolgt die Perfusion des Blutes in die Maus vor der Festl...

Diskussion

L. Monocytogenes kann lebensbedrohliche Meningoenzephalitis beim Menschen verursachen. Vorherige Studien belegen die Fähigkeit von Bakterien, die Blut-Hirn-Schranke (BBB) zu überqueren und um das Gehirn zu kolonisieren. Drei Strecken der Gehirn-Invasion wurden vorgeschlagen, während der Infektion: direkte Penetration des BBB durch Bakterien, Stealth-Transport durch Bakterien in mononukleären Zellen³und axonalen Migration von L. Monocytogenes Stämme, die dazu führen, dass Rhombenc...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Gehirn Herz Infusionsmedium	Becton Dickinson	237200
Streptomycinsulfat	Amresco	0382-50G
Petrischalen	VWR	25384-342
Glycerin	VWR	97062-832
IKA T18 ULTRA-TURRAX Basic Homogenisator	IKA	3352109	Modell: T18BS1
Spektralphotometer	Beckman Coulter	DU 800 Serie
BALB/c Mäuse	Jackson Laboratory	Modell #000651
1 mL Spritzen	Becton Dickinson	309659
26 G Nadeln	Becton Dickinson	305115
21 G Schmetterlingsnadeln	Becton Dickinson	367281
Ethylendiamintetraessigsäure	Sigma-Aldrich	60004
15 mL konische Röhrchen	VWR	21008-918
Reagenzgläser mit rundem Boden	VWR	60819-546
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Corning	46-013-CM
Edelstahl-Spatel	VWR	82027-520
Edelstahl-Schere (6,5 Zoll)	VWR	82027-592
Edelstahl-Schere (4,5 Zoll)	VWR	82027-578
Edelstahl-Abstumpfzange  (4,5 Zoll)	VWR	82027-440
Edelstahl-Zange mit feiner Spitze  (6 Zoll)	VWR	82027-406