Methodenartikel

In Vivo Gezielte Expression von optogenetische Proteinen mit Seide/AAV Filme

DOI:

10.3791/58728

⸱

26. Februar 2019

 ,  , 
1Vollum Institute, Oregon Health and Science University, 2Harvard Medical School

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode für die Bereitstellung von viralen Expressionsvektoren in das Gehirn mit Seide Fibroin Filme. Diese Methode ermöglicht die gezielte Bereitstellung von Expressionsvektoren mit beschichteten Glasfasern Seide/AAV, konische Lichtleitfasern und kranialen Fenster.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Streben zu verstehen, wie neuronale Schaltkreise Prozessinformationen zu Verhaltensstörungen Antriebsleistung stark durch vor kurzem entwickelte optische Methoden zur Manipulation und Kontrolle der Tätigkeit der Neuronen in Vivounterstützt worden ist. Diese Art von Experimenten setzen auf zwei Hauptkomponenten: 1) implantierbare Geräte, die optischen Zugriff auf das Gehirn und (2) lichtempfindliche Proteine, die neuronale Erregbarkeit zu ändern oder eine Auslesen der neuronalen Aktivität. Es gibt eine Reihe von Möglichkeiten, lichtempfindliche Proteine auszudrücken, aber stereotaktischen Injektion von viralen Vektoren ist derzeit die flexibelste Ansatz, da Ausdruck mit genetischen, anatomische und zeitliche Präzision gesteuert werden kann. Trotz der großen Nutzen von viralen Vektoren liefert dem Virus auf der Website von optischen Implantate stellt zahlreiche Herausforderungen. Stereotaktischen Virus-Injektionen fordern Operationen, die OP-Dauer zu erhöhen, erhöhen die Kosten des Studiums und eine Gefahr für die Gesundheit des Tieres. Das umliegende Gewebe kann körperlich durch die Injektionsspritze und immunogen Entzündung verursacht durch die abrupte Lieferung eines Bolus von hoher Titer Virus beschädigt werden. Ausrichten von Injektionen mit optischen Implantate ist besonders schwierig, wenn Sie auf kleine Regionen tief im Gehirn. Um diese Herausforderungen zu bewältigen, beschreiben wir eine Methode zur Beschichtung von mehreren Arten von optischen Implantate mit Filmen aus Seide Fibroin und Adeno-assoziierte Virus (AAV) Vektoren. Fibroin, ein Polymer, abgeleitet aus dem Kokon der Bombyx Mori, kann Kapseln schützen Biomoleküle und kann in Form von löslichen Filme bis hin zu Keramik verarbeitet werden. Seide/AAV Beschichtungen lassen, wenn in das Gehirn implantiert, Virus an der Schnittstelle zwischen optischen Elementen und dem umliegenden Gehirn fahren Ausdruck genau da, wo es gebraucht wird. Diese Methode ist leicht umgesetzt und verspricht, in Vivo Studien der neuralen Schaltkreis-Funktion erheblich erleichtern.

Einleitung

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Im vergangene Jahrzehnt hat eine Explosion von veränderter lichtempfindliche Proteine für die Überwachung und Manipulation neuronale Aktivität1produziert. Viren bieten unvergleichlichen Flexibilität für den Ausdruck dieser optogenetische Werkzeuge im Gehirn. Im Vergleich zu transgenen Tieren, sind Viren viel einfacher zu produzieren, zu transportieren und zu speichern, ermöglicht die schnelle Umsetzung der neuesten optogenetische Werkzeuge. Ausdruck kann auf unterschiedlichen neuronalen Populationen genetisch ausgerichtet sein, und Viren entwickelt für die retrograder Transport können auch Ausdruck basiert auf neuronalen Verbindungen2Ziel verwendet werden.

Viren sind in der Regel mit stereotaktischen Injektionen eingeführt, die zeitaufwändig und anspruchsvoll sein können. Präzise Ausrichtung auf kleine Regionen kann schwierig sein, während Ausdruck oft über weite Bereiche fahren viele Injektionen erfordert. Außerdem, wenn ein optisches Gerät anschließend in das Gehirn, um Licht in Vivoliefern implantiert ist, muss das Implantat richtig mit der viralen Injektion ausgerichtet sein. Hier beschreiben wir eine leicht implementiert Methode für die Bereitstellung von viraler Vektoren des Gewebes um eine implantierte Gerät mit Seide Fibroin Filme3. Seide Fibroin ist im Handel erhältlich, gut verträglich durch neuronale Gewebe und kann verwendet werden, um Materialien mit unterschiedlichen Eigenschaften zu produzieren. Seide Filme können auch auf Implantate mit gemeinsamen Laborgeräte wie Mikroinjektion Pipetten oder hand Pipetten. Seide/AAV Filme beseitigen die Forderung nach zwei chirurgische Eingriffe und sicherzustellen, dass Virus-vermittelten Expression mit dem optischen Implantat richtig ausgerichtet ist. Der resultierende Ausdruck wird auf die Spitze der Fasern und führt zu weniger unerwünschten Ausdruck entlang der Faser-Strecke als stereotaktischen Injektionen beschränkt.

Neben der Produktion von gezielten Ausdruck an der Spitze der kleinen Fasern, Seide/AAV Filme können verwendet werden, um weit verbreitete fahren (> 3 mm Durchmesser) kortikale Ausdruck unter kranialen Fenster. In Vivo 2-Photonen-Bildgebung von fluoreszierenden Bewegungssensoren ist ein unverzichtbares Instrument für die Bewertung der Rolle der neuronalen Aktivität im sensorischen und kognitiven Verarbeitung fahren geworden. Jedoch um einheitliche fahren Ausdruck über die kortikalen Bereichen Experimentatoren häufig mehrere Injektionen durchführen. Diese Injektionen können sehr zeitaufwändig sein und können zu inkonsistenten Ausdruck in das Sichtfeld führen. Im Gegensatz dazu sind Seide/AAV-beschichtete kranialen Fenster extrem einfach zu fertigen, erheblich reduzieren den Zeitaufwand für Operationen und fahren am bemerkenswertesten Ausdruck Hunderte von µm unterhalb der kortikalen Oberfläche.

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Protokoll

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Alle Experimente mit Tieren wurden gemäß Protokollen vom Harvard ständigen Ausschusses Animal Care folgende Leitlinien im US NIH Führer für die Pflege und Verwendung von Labortierenbeschrieben durchgeführt. Erwachsene C57BL/6 Mäusen beiderlei Geschlechts (6-15 Wochen alt) wurden für alle Experimente verwendet.

1. besorgen Sie wässrigen Seide Fibroin

  1. Vorbereiten oder wässrige Seide Fibroin (5-7,5 % w/V) zu erwerben.

2. Mischen Sie wässrigen Seide mit AAV Expressionsvektoren

  1. Wählen Sie ein AAV Expressionsvektor optogenetische Protein oder fluoreszierenden Indikator für Wahl zu fahren.
    Hinweis: Um das Volumen der Seide/AAV zu minimieren, die Implantate während der Fahrt noch robuste Ausdruck angewendet werden muss, empfiehlt Lager-Titer AAV (Lager sind Titer von Vektor-Kerne in der Regel erhalten um ~ 1013 gc/mL).
  2. Unmittelbar vor der Beschichtung Implantate tauen Sie ein Aliquot der AAV auf und kombinieren Sie mit 5-7,5 % wässrige Seide Fibroin (diese Mischung wird als Seide/AAV bezeichnet werden). Mischen Sie in einem 200 µL PCR-Röhrchen wässrigen Fibroin und AAV im Verhältnis 1:1 (für cranial Windows verwenden Sie 1:4) unmittelbar vor dem Auftragen. Die Lösung pipette vorsichtig ein-und mehrfach Fibroin und AAV gründlich mischen.
  3. Halten Sie Seide/AAV-Mischung auf dem Eis vor dem Gebrauch.

3. bereiten Sie Anlagen zur Herstellung und Lagerung von Seide/AAV-beschichtete Geräte

  1. Ausrüstung für Beschichtung optische Fasern und Gradienten-Index (Grinsen) Linsen (Abbildungen 1, 2) beschaffen.
    1. Inhaber eines stabilen zwinge zu konstruieren. Keramische Aderendhülsen halten, Bohrungen Sie 1,25 mm, in einem Block von ¼" Blatt Acryl. Tippen Sie auf Löcher um Schrauben von der Seite, Aderendhülsen festzuhalten einzufügen.
      Hinweis: Jede Klammer kann für diesen Zweck verwendet werden.
    2. Positionieren Sie einen Manipulator mit Sub-Millimeter Präzision, die Lichtleitfasern (stereotaktischen Apparat oder andere Präzision Mikromanipulator) zu bewegen.
    3. Montieren Sie eine stabile Halterung um die Microinjector zu positionieren.
    4. Verwenden Sie ein Stereoskop, um optische Fasern und Seide Tröpfchen zu visualisieren.
    5. Positionieren Sie eine Lichtquelle zur Beleuchtung der optischen Fasern.
  2. Bereiten Sie die Ausrüstung für die Beschichtung von kranialen Fenster (Abbildung 3).
    1. Wählen Sie jede P10-Pipette.
    2. Erhalten Sie einen Behälter mit Deckel.
      Hinweis: Alle Behälter mit einem Silikon-Boden wird vorgeschlagen – die weichen Unterseite erleichtert kranialen Fenster anheben.
  3. Bereiten Sie Ausrüstung, fertige Implantate (Abbildung 4) zu speichern.
    1. Erhalten Sie eine kleinen (1-5 L) Vakuumkammer.
    2. Stellen Sie sicher, dass gibt es Platz zum Aufbewahren im Kühlschrank 4 ° C Implantate.

4. tragen Sie Seide/AAV Film, Geräte

  1. Beschichtung von optischen Fasern auf Laufwerk fokale Ausdruck an der Faserspitze
    1. Chronische Faser Implantate als zuvor beschriebenen4vorbereiten.
    2. Vor dem Gebrauch spülen Implantate mit Ethanol, dann mit Reinstwasser um sicherzustellen, dass die Glasfasern sind sauber.
      Hinweis: Silk Folien haften, zuverlässiger um Glasflächen reinigen.
    3. Bereiten Sie ein Gerät Faser Aderendhülsen zu halten. Für typische 1,25 mm Durchmesser Aderendhülsen verwenden Sie einen Block ¼ Zoll klaren Acryl, mit ~1.3 mm Löcher, und tippte Stellschrauben auf Loch Implantate fest im Ort (Abbildung 1A) von der Seite eingeben.
    4. Berg die Endhülse Halter in einem stereotaktischen Apparat (oder Manipulation Lösung mit Submillimeter Präzision) mit einer Microinjector ausgestattet. Setzen Sie die Zwinge Halterung oberhalb der Microinjector und wenden Sie die Seide/AAV-Mischung von unten an.
      Hinweis: Dies ist, da Seide/AAV Anwendungen großer Mengen von oben geführt, die nicht auf die Spitze beschränkt war. Allerdings kann die Anwendung von vielen sequenziellen Kleinmengen von oben oder unten AAV/Seide-Einlagen führen, die an der Spitze beschränkt sind (obwohl wir lieber von unten anwenden).
    5. Ziehen Sie eine standard intrakraniellen Injektion Pipette aus Borosilikatglas Kapillare.
      1. Um es einfacher zu
      2. Um eine Injektion Tipp mit einer sauberen flachen Spitze des gewünschten Durchmessers zu produzieren, halten Sie eine Pipette in jeder Hand zu und verwenden Sie den dickeren Teil des Kegels auf einer Pipette, um die andere Pipette an der gewünschten Position zu erzielen.
      3. Reiben Sie vorsichtig hin und her in einer Sägen Bewegung (der Glas-scoring-Methode).
      4. Üben Sie nach der Wertung der Pipette sanften Druck auf die erzielte Pipettenspitze mit dem Körper der Pipette, einen sauberen Schnitt zu erreichen.
    6. Positionieren Sie ein Stereoskop um einen klaren Überblick über die LWL-Gesichter zu geben.
      Hinweis: Vergrößerung sollte ausreichen, um die Injektion Pipette über das Gesicht von optischen Fasern genau zu positionieren.
    7. Einsetzen Sie Faser-Implantate in Halter mit der Gehirn-Seite des Lichtleiters nach unten.
    8. Laden Sie die Injektion-Pipette mit Seide/AAV-Lösung für alle standard intrakraniellen Injektion5. Laden Sie die Füllmenge für die Anzahl der Implantate gemacht, plus ~ 30 % zusätzliche Verluste aufgrund von Pipetten Verstopfung unterzubringen. Beispielsweise wenn 10 Implantate gemacht werden, dann laden mit 100 nL Einlagen und ~1.3 µL zurückzuziehen.
      Hinweis: Seide/AAV kann bei der Pipettenspitze zwischen Ejections, trocknen die Pipette verstopfen können. Großem Durchmesser Pipetten (50-100 µm) sind weniger wahrscheinlich zu verstopfen. Clogs können durch sanfte Bürsten Sie die Pipettenspitze mit einem feuchten Papier wischen oder Alkohol-Tupfer verdrängt werden.
    9. Die Injektion Pipette zu manövrieren, bis es berühren oder beinahe berührt die Mitte der LWL-Oberfläche. Werfen Sie 10-20 nL Seide/AAV-Lösung. Die Pipette zurückziehen.
      Hinweis: Der Preis der Lieferung ist nicht kritisch, aber typische Preise sind 5-20 nL/s.
    10. Beobachten der Bolus von Seide/AAV auf der flachen Oberfläche erscheint wie eine flüssige Kuppel, das trocknet zu einem flachen Film innerhalb von ~ 1 min (Abbildung 1 b).
    11. Wiederholen Sie die Schritte 4.1.9-4.1.10, bis die gewünschte Menge an Seide/AAV ist hinterlegt (insgesamt 20-200 nL für die meisten Anwendungen). Wenn Sie mehrere Implantate vorbereiten, gelten Seide/AAV für ein Implantat und fahren Sie dann mit anderen Implantaten vor der Rückkehr zu beschichten, die erste.
    12. Ermöglichen Sie 1 h zum Trocknen vor dem Umzug Implantate.
    13. Vakuum desiccate Übernachtung im ~ 125 mm Hg (-25 in. (Hg), 4 ° C. Dies, indem der gesamte zwinge Inhaber in eine Vakuumkammer tun.
    14. Die Form und Position der daraus resultierenden Seide Film unter einem Hochleistungs-Mikroskop zu bewerten. Sicherzustellen, dass die Filme auf der Spitze der LWL-Oberfläche beschränkt sind, relativ dünn sein (> 100 µm), und symmetrisch (Abbildung 1).
      Hinweis: Große oder asymmetrisch Seide/AAV-Filme können von der Faser während der Implantation (Abbildung 1) verdrängen. Die häufigste Ursache von Problemen ergibt sich aus der Anwendung der einzelnen große Mengen anstatt der sequentiellen Anwendung von vielen kleinen Mengen.
  2. Beschichtung konisch Lichtleitfasern Laufwerk Ausdruck entlang der Faser-Achse
    1. Erhalten Sie konische LWL-Implantate und führen Sie Schritte 4.1.2-4.1.8, außer dass die konische Faser seitlich positioniert ist, so dass es senkrecht zum Injektor (Abbildung 2A). Positionieren Sie den Injektor über die konischen Faser.
      Hinweis: Laden Flüssigkeitströpfchen auf konischen Fasern Posen Herausforderungen, hinzugefügt, weil Oberflächenspannung tendenziell dazu führen, dass Tröpfchen springt wieder auf die Injektion Pipette oder Migrieren der konischen Faser. Kleinere Injektion Pipetten (30-50 µm Durchmesser) dazu beitragen, dieses Problem zu überwinden, sondern erhöhen das Risiko, das die Injektion Pipette verstopfen. Aufgrund der Oberflächenspannung Tropfen sind in der Regel auf den Bereich der größten Fläche zu halten, so dass die optimale Einspritzung pipette Größe ist abhängig von der Größe der konischen Faser und die Toleranz für die gelegentliche Verstopfung.
    2. Positionieren Sie die Seide/AAV Injektion Pipette gegen die Seite des Lichtleiters am Anfang der Verjüngung. Stellen Sie sicher, dass die Injektion Pipette die optische Faser berührt.
    3. Auswerfen 20 nL von Seide/AAV um die Beschichtung zu starten. Sicherstellen Sie, dass das Tröpfchen hält sich an die optische Faser und an der Schnittstelle von der Faser/Pipette bleibt. Sanft Docht Tropfen gegen Ende der Faserspitze wie Seide/AAV trocknet (~ 45 s). Halten Sie die Injektion Pipette in Kontakt mit der Trocknung Tropfen zu vermeiden, verstopfen die Pipettenspitze.
      Hinweis: Jede Einzahlung sollte ca. 400 µm der konischen Faser (Abb. 2 b) bestreichen.
    4. Wenn der erste Bolus fast vollständig getrocknet ist, werfen Sie noch 20 nL und weiter Feuchtigkeitstransport des Tropfens entlang der Verjüngung.
      Hinweis: Die flüssige Seide die getrockneten Seide haften an Verankerung ein Ende der Tropfen als die Pipette bewegt sich entlang der Verjüngung.
    5. Wiederholen Sie Schritt 4.2.4 durch Auswerfen geringe Mengen an Seide/AAV, und allmählich zeichnen die Lösung an der Seite des Kegels. 5-6 Ejections sind ausreichend, um die Oberfläche von 2,5 mm Konus zu durchqueren.
    6. Um mehr einheitliche Ausdruck um alle Seiten der Faser zu fahren, drehen Sie die Faser und wiederholen Sie Schritte 4.2.2-4.2.5, bis die gewünschte Menge an Seide/AAV niedergelegt worden ist.
    7. Wenn eine hängen der Aktionsbereich getrocknete Seide/AAV erstreckt sich über die Faserspitze, sorgfältig den Strang mit einer Schere geschnitten oder verwenden die Auswurf-Pipette auf den Strang zurück zu biegen und die Verjüngung der Faser einhalten.
    8. Ermöglichen Sie 1 h zum Trocknen vor dem Umzug Implantate.
    9. Vakuum desiccate über Nacht bei 4 ° C. Der gesamte zwinge-Inhaber kann in eine Vakuumkammer platziert werden.
    10. Die Form und Position der daraus resultierenden Seide Film unter einem Hochleistungs-Mikroskop zu bewerten.
      Hinweis: Filme müssen nicht völlig einheitlich sein sollte, nicht jedoch Unebenheiten, die mehr als 100 µm über die Oberfläche der Faser, Beschädigung der umgebenden Gewebe während der Implantation (Abbildung 3) zu minimieren erweitern. Um Filmgröße zu minimieren, ist es wichtig, dass jeder Tropfen vollständig trocken ist, bevor nachfolgende Einzahlungen getätigt werden.
  3. Beschichtung Grinsen Objektiv Implantate
    1. Erhalten Sie GRIN-Linsen-6,-7 , und wiederholen Sie die Schritte 4.1.2-4.1.8. Der Injektor kann oben montiert werden.
    2. Seide/AAV in einem einzigen Auswurf (1 µL für eine 1,0 mm Durchmesser Objektiv) einzahlen.
      Hinweis: Dies wird eine Kuppel aus Flüssigkeit hervorbringen, die hält sich an das Gesicht des Objektivs und trocknet um ein gleichmäßiger Film (100-200 µm dick) zu produzieren. Jedoch den Fall, dass eine einzelne große Auswurf ungleichmäßig trocknet und produziert einen Film, der am Rand der Linse Grinsen dicker ist, versuchen Sie mehrere kleinere Tröpfchen (100-200 nL) Hinterlegung in der Mitte der Oberfläche der Linse (so dass jeder Tropfen vor Hinterlegung trocknen die nächste) um sicherzustellen, dass der Film in der Mitte des Sichtfeldes Ausdruck fahren wird.
    3. Ermöglichen Sie 1 h zum Trocknen vor dem Umzug Implantate.
    4. Bewerten Sie die Form und Position der resultierenden Seide Film unter einem Hochleistungs-Mikroskop um sicherzustellen, dass der Film die Linsenoberfläche deckt.
  4. Kranialen Fenster Beschichtung
    1. Bereiten Sie Glas kranialen Fenster von anhaftenden zwei 3 mm Durchmesser Runde Deckgläsern (Nr. 1-Dicke) auf einem 5 mm Durchmesser Fenster mit optischen Kleber (Näheres siehe Goldey Et Al. 20148).
    2. Mischen Sie Seide: Virus in einem Verhältnis von 1:4, den Gesamtbetrag der Seide in den Film zu reduzieren. Übermäßige Mengen an Seide auflösen unter kranialen Fenster nach der Implantation nicht. Titration Experimente müssen gegebenenfalls bestimmen das Verhältnis und die Lautstärke, die das gewünschten Profil gibt.
    3. Hand pipette 5 µL Tröpfchen auf der Oberfläche von 3 mm (Gehirn-Einfassung) Deckglas. Die Tropfen sollten zur Deckung der gesamten Glasfläche (Abbildung 3) verteilt.
    4. 2-3 h zum Trocknen vor dem Verschieben von Fenstern zu ermöglichen.

5. Speicherung von Seide/AAV-beschichtete Implantate

  1. Speichern Sie Seide/AAV-beschichtete Glasfasern in einem gekühlten Vakuum Exsikkator (~ 125 Torr, 4 ° C) vor der Verwendung (Abb. 4A).
  2. Speichern Sie keine kranialen Fenster und GRIN-Linsen unter Vakuum, wie große Seide Filme gespeichert unter Vakuum nicht vollständig nach der Implantation zu lösen. Implantat-kranialen Fenster und GRIN-Linsen sofort nach dem Trocknen oder innerhalb eines Tages der Herstellung wenn bei atmosphärischem Druck und 4 ° c gelagert

6. implantiert die Geräte

  1. Implantat-Chirurgie Tiere als zuvor beschriebenen4vorbereiten.
    1. Kurz gesagt, betäuben Sie Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin/Xylazin (100/10 mg/kg) zu und prüfen Sie die Tiefe der Narkose mit einer sanften Zehe-Klemme. Den Schädel in der Umgebung des Implantats zu rasieren und Reinigen der Kopfhaut mit Jod und Alkohol.
    2. Tiere in einem stereotaktischen Gerät montieren und Narkose mit einem Gemisch aus Sauerstoff und Isofluran (1-2 %) zu ergänzen. Machen Sie einen Einschnitt in der Kopfhaut über den gewünschten Bereich zu, und führen Sie eine Kraniotomie groß genug für das Implantat.
  2. Implantat Lichtleitfasern9 und Microendoscope Linsen10 gemäß den zuvor veröffentlichten Verfahren. Griff-Implantate mit Sorgfalt, wie die Seide/AAV Kaution durch eine unvollkommene Kraniotomie oder durch das Implantat fangen am Rande des Schädels abgeschlagen kann. Senken Sie das Implantat in das Gehirn langsam (~ 2 mm/min).
  3. Implantat kranialen Fenster wie bisher8beschrieben. Berühren Sie die beschichtete Seite des Fensters nicht und vermeiden Sie das Fenster mit Flüssigkeit spülen, falls Magensonde, durchführen, wie dies das Virus wegwaschen kann. Um maximalen Ausdruck zu erreichen, führen Sie eine Durotomy.

7. Auswertung des Ausdrucks und Fehlerbehebung

  1. Um Expression von Proteinen Viral ausgedrückt zu bewerten, lassen ~ 2-3 Wochen für das Virus zu Ausdruck zu fahren, dann führen Sie Intracardial Perfusion mit 4 % Paraformaldehyd in Phosphat gepufferte Salzlösung11 und Prozess Hirngewebe für Leuchtstofflampen Mikroskopie-12.
  2. Werten Sie den Ausdruck mithilfe von Fluoreszenz-Mikroskopie, die Muster des Ausdrucks der Fluorophor-Tags optogenetische Proteine Bild.
  3. Wenn die Ebene des Ausdrucks nicht ausreicht, erhöhen Sie der Virusmenge in Beschichtungen indem man entweder das Gesamtvolumen der Seide/AAV Beschichtung, oder vorzugsweise mit einem höheren Titer-Virus.

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Ergebnisse

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Um den Erfolg der Seide/AAV Filme in Fahrt Ausdruck zu beurteilen, wir Tiere 2 bis 3 Wochen nach der Implantation durchblutet und bereiteten Gehirnscheiben aus der Region von Interesse. Fluoreszenzbilder Fluorophor-Tags optogenetische Proteine (ChR2-YFP) zur Verfügung gestellt ein Maß für den Umfang des Ausdrucks (Abbildung 1). Typische optische Fasern (230 µm Durchmesser) können ohne weiteres Platz für 200 nL Seide/AAV. Mit etwas Übung können Experimentatore...

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Diskussion

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Die Verwendung von Seide/AAV, die Expression von Optogentic Proteinen Ziel überwindet Grenzen von Ansätzen, die derzeit im Einsatz sind. Obwohl viele Studien erfolgreich AAV Injektionen verwenden optogenetische Proteine zum Ausdruck zu bringen, ist es schwierig, Ausdruck bis zur Spitze von optischen Fasern, Regionen rund um die Länge der konischen Fasern und ein Grinsen Objektiv betrachten und Umgebung auszurichten. Wegen der Fehlstellung zwischen optischer Komponenten und optogenetische Ausdruck stereotaktischen Injekti...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren wollen J. Vazquez für Illustrationen, D. Kaplan und C. Preda für Reagenzien und hilfreiche Hinweise und den Labors von B. Sabatini und C. Harvey für in-Vivo Bildgebung zu danken. Mikroskopie wurde ermöglicht durch M. Ocana und Neurobiologie Imaging Center, teilweise unterstützt durch die neuralen Imaging Center als Teil einer National Institute of Neurological Disorders und Schlaganfall (NINDS) P30 Kernzentrum gewähren (NS072030). Diese Arbeit wurde durch die GVR Khodadad Familienstiftung, die Nancy Lurie Marks Foundation und NIH-Stipendien, NINDS R21NS093498, U01NS108177 und NINDS R35NS097284, W.G.R, und ein NIH postdoctoral Fellowship F32NS101889, C.H.C. unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Wässriges SeidenfibroinSigma5154-20MLWässriges Seidenfibroin (5% w/v) zur Herstellung von Filmen
Mikroinjektor zur Abscheidung von Seide/AAVDrummond3-000-207Nanoject III Nanoliter-Injektor
Manipulator zum Halten von ImplantatenNarashigeMM-33Mikromanipulator
Stereoskop zur Visualisierung von SeidenablagerungenAmScopeSM-6TX-FRL3,5X-45X Trinokulares Gelenk-Zoom-Mikroskop mit Ringlicht
Vakuumkammer zur Aufbewahrung von ImplantatenAblazeN/A3,5 Quart Vakuum-Vakuum-Entgasungskammer
Optional, Implantathalter zur AufbewahrungN/AN/AUm vorgefertigte optische Fasern zu lagern, bohren Sie ein Gitter aus ~4 mm tiefen Löchern mit einem Durchmesser, der etwas größer als der Ferrule-Durchmesser ist, in einen Kunststoffblock.
Optische FaserThorlabsFT200EMTØ 200 & Mikro; m Core Multimode Optische Faser für Faserimplantate
AderendhülsenKientecFZI-LC-230LC Zirkonoxid-Ferrule für Faserimplantate
Verschiedene Materialien für die Herstellung chronischer FaserimplantateVerschiedenes N/AFür eine detaillierte Vorgehensweise siehe Ung K, Arenkiel BR. Faseroptische Implantation zur chronischen optogenetischen Stimulation von Hirngewebe. Zeitschrift für visualisierte Experimente: JoVE. 2012(68).
Konische FaserimplantateOptogenixLambda-BKonische Faserimplantate
GRIN-LinsenGoFotonCLH-100-WD002-002-SSI-GF3GRIN-Linsen
Kleine GlasschädelfensterWarner64-0726 (CS-3R-0)Kleines rundes Deckglas, #0 Dicke
Große GlasschädelfensterWarner64-0731 (CS-5R-0)Kleines rundes Deckglas, #0 Dicke
Verschiedene Materialien für die Herstellung von SchädelfensternVerschiedenesN/AFür eine detaillierte Vorgehensweise siehe Goldey GJ et al. Removable cranial windows for longtime imaging in awake mice. Natur-Protokolle. November 2014; 9(11):2515.

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Schlagwörter

In vivo ExpressionBeschichtung von viralen VektorenBeschichtung optischer Implantatestereotaktischer ApparatFluoreszenzbildgebungVakuumtrocknungfaseroptische ImplantateGRIN Linsenbeschichtung

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