Mit grünen Fluoreszenz Protein exprimierenden verbessert Escherichia Coli Maus peritonealen Makrophagen Phagozytose bewerten

Makrophagen Phagozytose Assays werden häufig verwendet, um die angeborene immune Funktion zu studieren. Die angeborene Immunantwort kann Anfälligkeit zur Infektion hindeuten. Makrophagen-Zelllinien sind weit verbreitet in Immunologie Studien. Jedoch kann die längere Passage Genverlust und Immunfunktionen in diesen Zelllinien in Frage gestellt. So sind die primären peritonealen Makrophagen das ideale Objekt, um die Zelle Funktion¹zu studieren.

Obwohl die angeborene Immunantwort im gealterten Körper intakt zu sein gedacht war, kann die phagocytic Fähigkeit im Vergleich zu verringern, dass in den jüngeren^{2,3 Körper}. Hier zeigen wir eine Methode zur Bestimmung der Phagozytose von peritonealen Makrophagen von jung (acht-Woche-alten) und Alter (16-Monate-alten) Maus mit EGFP exprimierenden E. Coli, die bequem, schnell und wirtschaftlich machbar ist.

Die Verwendung von einem EGFP exprimierenden E. Coli -Stamm ist einer der Vorteile des Assays weil diese Bakterien stabil sind und zeigen eine starke Fluoreszenz-Signal, auch nach der Makrophagen durch 4 % (w/V) Paraformaldehyd fixiert sind. Darüber hinaus durch die Verwendung der EGFP exprimierenden E. Coli, Forscher müssen nicht weiter Färbung nach Phagozytose, was Zeit spart. Darüber hinaus sind Makrophagen Immunoresponsive für E. Coli Oberflächenantigen, so dass E. Coli für die Phagozytose-Assay als mit EGFP exprimierenden Pilze oder Fluorescein-markierten Perlen.

Mit EGFP exprimierenden E. Coliein Phagozytose-Assay problemlos in 2 h erreicht und durch beide Flow Cytometry und Fluoreszenz-Mikroskopie, je nach Zweck des Forschers gemessen. Da diese Methode direkt die phagocytic Fähigkeit misst, sind die Ergebnisse mehr als andere indirekte Methoden reproduzierbar.

Diese Methode wurde auch in einer RAW264.7 Zelllinie validiert und Menschenblut peripheren mononukleären Zellen⁴. Der folgende Text bietet detaillierte schrittweisen Anleitungen für die Durchführung dieses Assays und unterstreicht die entscheidenden Schritte, die die Forscher ändern können, um die Bedürfnisse ihrer Experimente.

Alle Verfahren wurden unter den nationalen Instituten der Gesundheitsrichtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt, und die Protokolle vom Animal Care und Nutzung Ausschuss der Dalian Medical University angenommen wurden. 16-Monate-alten (mit einem Körpergewicht von 30-35 g) und acht-Woche-alten (20-25 g) SPF (spezifische-Pathogen-freies) männliche C57BL/6 Mäusen stammen aus der SPF Tiere Mitte der Dalian Medical University. Alle Mäuse wurden in Tierhaltung mit Zugang zu Nahrung und Wasser Ad Libitumgehalten. Die Temperatur blieb bei 20-24 ° C, Luftfeuchtigkeit betrug 40 % - 70 %, und Beleuchtung war 12 h Licht/12 h dunkel. Tiere durften für mindestens 7 Tage vor dem Experiment an die Umgebung gewöhnen.

1. Aufbau der Haustier-SUMO-EGFP Plasmid und Induktion von EGFP Ausdruck

1. EGFP gen Fragment zu synthetisieren (eine 717 bp-Sequenz synthetisiert durch einen benutzerdefinierten gen Synthese Service, siehe Tabelle der Werkstoffe und ergänzende Datei 1 für die Sequenz) und das Fragment mit dem forward Primer (zu verstärken 5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3 ") und reverse Primer (5'-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3"), mit hoher Wiedergabetreue Taq-DNA-Polymerase.
2. Um sicherzustellen, dass die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Produkte einzelne 3' Adenin Überhängen zum TA Klonen im nächsten Schritt haben, verwenden Sie eine Erweiterung 30 min bei 72 ° C, nachdem die letzte Zyklus (siehe ergänzende Datei 1 für PCR-Zustände). Überprüfen Sie das PCR-Produkt von Agarose-Gelelektrophorese.
3. Das PCR-Produkt in den pET-SUMO-Vektor klonen (siehe Tabelle der Materialien) mit der TA Klonen Methode⁵ mit T4 DNA-Ligase. Inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur (20-25 ° C) für 30 min. Der Vektor wird zwischen Nukleotiden 653 und 654 mit einer 1 bp 5′ T-Überhang auf jedem Strang linearisiert.
4. Verwandeln die Ligatur Produkt in chemisch kompetente BL21(DE) E. Coli -Stamm wie folgt: 5 µL hinzufügen (100 ng) PCR-Produktes zu 100 µL kompetente Zellen BL21(DE) über Hitzeschock bei 42 ° C für 90 s; halten Sie die Mischung für 3 min auf Eis, und fügen Sie 400 µL Lysogeny Brühe (LB) Medium bei 37 ° C für 1 h bei 37 ° C und 120 u/min schütteln vorgewärmt.
5. 100 µL der Bakterien auf der Oberfläche eines LB-Kanamycin (100 µg/mL) Platte mit dem Induktor Laktose (0,5 Mmol/L), die EGFP Ausdruck Belastung nachgeben zu impfen. Über Nacht inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C.
   Hinweis: Wenn die EGFP erfolgreich ausgedrückt wird, können einige Kolonien als leuchtend grünes Licht in der Dunkelheit beobachtet werden.
   1. Wählen Sie optional, Kolonien, das eingefügte EGFP-Fragment durch DNA-Sequenzierung zu überzeugen. Der Primer für die DNA-Sequenzierung sind: vorwärts, 5'-AGATTCTTGTACGACGGTATTAG-3 "; Revers, 5'-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3 ".
6. Eine positive Kolonie in 5 mL LB-Medium mit 100 µg/mL Kanamycin immun. Brüten in einem 37 ° C Inkubator bei 120 u/min für 2 h, schütteln und dann, eine Endkonzentration von 0,5 Mmol/L der Induktor Laktose hinzu und schütteln für 6 h, induzierende EGFP Ausdruck auch weiterhin. Empirisch, beim Schütteln für 6 h, die Extinktion bei 600 nm (OD600) erreichen 0.7 oder höher.
7. 10 µL des Mediums bakterielle Kultur auf einer Folie hinzufügen, mit einem Deckglas abgedeckt und die Expression von EGFP unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop zu untersuchen. Die EGFP exprimierenden Bakterien können in das Medium bei 2 bis 8 ° C für mehrere Wochen gespeichert werden.

(2) Maus peritonealen Makrophagen Isolation und Primärkultur

1. 100 mL destilliertes Wasser und Autoklaven die Mischung zu Sterilität vor Gebrauch 3,5 g Thioglykolat hinzufügen. Pumpen Sie das Thioglykolat Medium in 1 mL sterile Spritze in der Haube für die Maus peritonealen Injektion. Verwenden Sie eine Maus pro Spritze, um Infektion zu vermeiden. Die Verwendung von Thioglykolat kann die Anzahl von Makrophagen erhöhen. Die ansässigen peritonealen Makrophagen können isoliert werden ohne Thioglykolat aber mit niedrigeren Renditen Makrophagen.
2. Betäuben Sie die Maus mit einer Methode, die von den lokalen Tierpflege und Verwendung Ausschuss genehmigt. Injizieren Sie mit der 1 mL Spritze mit einer Nadel 23 G 1 mL 3,5 % Thioglykolat Medium in der Maus Bauchhöhle.
   Hinweis: Durch Induktion der Anästhesie, die peritoneale Injektion kann leicht durchgeführt werden und reduziert das Risiko von Verletzungen zu den inneren Organen verursacht durch Injektion.
3. Halten Sie die Maus mit Wasser und Nahrung Ad Libitum für 3 Tage. Jeden Tag den Körper Gewicht und Nahrungsaufnahme des Tieres zu überwachen. Wenn der Körper Gewichtsverlust innerhalb von 3 Tagen mehr als 10 % ist, schließen Sie aus, das Tier aus dem Experiment.
4. Nach 3 Tagen einschläfern der Maus durch zervikale Dislokation nach Induktion schnell Anästhesie von Sevofluran in einem geschlossenen Kasten. Alternativ können Sie eine Methode, die von Tier Pflege und Verwendung Lokalkomitees an die Maus einschläfern genehmigt wurde.
5. Setzen Sie die Maus in eine Schale (mit einem Durchmesser von 10 cm) mit 75 % Ethanol zu sterilisieren, und übertragen Sie es schnell auf der Motorhaube. Platzieren Sie den Mauszeiger auf einen Teller und pin die Vorderpfote auf dem Brett, um die Maus Position zu fixieren.
6. Mit einer 5 mL Spritze befestigt auf 20 G injizieren Nadel, Platzierung der Nadel Abschrägung oben in einem Winkel von 30° - 40° 5 mL kalt (4-10 ° C) Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) am Unterbauch in der Maus Bauchhöhle, Punktion des Darms zu vermeiden. Wenn der Darm (oder jedes andere Organ) punktiert wird, können die Maus und ihre Zellen nicht mehr werden für Experimente, verwendet wie diese Zellen aktivieren kann, die nicht zur primären Zellkulturen eignen.
7. Führen Sie eine sanfte Massage auf beiden Seiten der Maus Abdomen. Dann abzusaugen Sie die Flüssigkeit sanft und langsam. Die peritoneale Flüssigkeit in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen zu verzichten. Wiederholen Sie diese Schritte, 2 X oder 3 X.
8. Zentrifugieren Sie die suspendierten Zellen für 10 min bei 400 X g in einer gekühlten Zentrifuge (4-8 ° C). Den Überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zelle Pellet in RPMI 1640 Medium mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS). Zählen der Zellen. Die Zelldichte ist empirisch, 5 x 10⁶ Zellen/mL annähernd gleich, wenn die Zellen in 10 mL Medium Nukleinsäuretablette sind.
9. 5 x 10⁶ Zellen in jede Vertiefung eine 6-Well-Platte für die Flow Cytometry Assay und 5 x 10⁵ Zellen pro Bohrloch in einer 24-Well-Platte für ein Fluoreszenzmikroskop hinzufügen. Kulturzellen Sie die bei 37 ° C in einem 5 % CO₂ Inkubator über Nacht. Das Kulturmedium kann aktualisiert werden, nach 3 h nonadherent Zellen zu entfernen, weil die meisten davon Lymphozyten sind. Adhärenten Zellen sind vor allem die Makrophagen, und sie können gut auf Gewebe-Kultur behandelt Kunststoff halten.

(3) Makrophagen Phagozytose Assay mit dem Fluoreszenzmikroskop

1. Beobachten Sie die Zellen unter dem Hellfeld Mikroskop, Zellviabilität und Zelldichte zu bewerten.
2. Entfernen Sie das Kulturmedium aus 24-Well-Platte. Fügen Sie 100 µL frisches Nährmedium und 10 µL Bakteriensuspension (ca. 2 x 10⁷ Zellen) in jedem Brunnen wie in Tabelle 1beschrieben. 1 h in einem 37 ° C, 5 % CO₂ Inkubator inkubieren.
3. Waschen Sie vorsichtig 3 x-5 x mit kaltem PBS 500 µL pro Bohrloch zum Auswaschen von noninternalized Bakterien.
4. Inkubieren Sie die Zellen mit 4 % Formaldehyd in PBS bei Raumtemperatur für 30 min.
5. Waschen Sie die festen Zellen 3 X mit PBS (500 µL/Well).
6. Fügen Sie 200 µL Phalloidin 633 Fluoreszenz färben konjugierten Arbeitslösung (siehe Tabelle der Materialien), die F-Aktin zu beflecken. An einem dunklen, feuchten Ort (60-80 %) bei Raumtemperatur für 60 min. Spülen die Zellen 3 X mit PBS (500 µL/Well), überschüssige Phalloidin zu entfernen. Durch Färbung der F-Aktin, Zytoplasma kann beschrieben werden und dazu beitragen, die internalisierten Bakterien unterscheiden.
7. Fügen Sie 200 µL Arbeitslösung DAPI (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole) (1 µg/mL) zu färben den Zellkern und 5 min in einem dunklen, feuchten Ort bei Raumtemperatur inkubieren. Spülen mit PBS 1 X (500 µL/Well) und 1 X mit dem gleichen Volumen von destilliertem Wasser. Dann werden die Zellen bereit für die Beobachtung unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop.

(4) Makrophagen Phagozytose Assay mit Durchflusszytometrie

1. Die experimentellen Fehler zu minimieren und machen eine korrekte Interpretation der Ergebnisse, die Gruppen und Rohre für das Experiment zu steuern, wie in Tabelle 2aufgeführt.
   1. Für die Kontrollgruppe, die auf dem Eis (Gruppe 4 in Tabelle 2) platziert werden, entfernen Sie das Medium aus der 6-Well-Platte und waschen Sie es 1 X mit PBS. Fügen Sie 1 mL kaltem 70 mM EDTA in den Brunnen zu lösen die Zellen und übertragen Sie sie auf das Durchflussrohr Zytometrie. Fügen Sie 50 µL Bakteriensuspension in das Rohr und legen Sie es auf dem Eis für 1 h.
   2. Entfernen Sie für die anderen Gruppen das Kulturmedium. Fügen Sie 1 mL frisches Medium in jede Vertiefung. Fügen Sie 50 µL Bakteriensuspension in die Vertiefungen je nach Gruppeneinstellung, wie in Tabelle 2beschrieben. Dann setzen Sie die 6-Well-Platte in das 37 ° C, 5 % CO₂ Inkubator für 1 h.
2. Um die Fluoreszenz des noninternalized E. Colizu stillen, fügen Sie 200 µL von 0,8 % Kristallviolett (CV)-Wasser-Lösung in den Brunnen und wiegen kurz, wodurch ein falsch-positives Ergebnis durch die EGFP exprimierenden E. Coli -Bindung an die Oberfläche von der Makrophagen aber nicht verinnerlicht. Waschen Sie die Zellen 3 X mit PBS, passives Lebenslauf zu entfernen.
3. Fügen Sie 1 mL kaltem 70 mM EDTA in den Brunnen zu lösen die Zellen und übertragen Sie sie auf das Durchflussrohr Zytometrie.
4. Die Rohre bei 400 X g für 5 min Zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
5. Fügen Sie 100 µL PBS, die Zellen erneut hinzu. Fügen Sie 5 µL von F4/80-PE-konjugierten Antikörpern (ein Oberflächenantigen ausgedrückt auf Maus Makrophagen hinzu) in den Rohren oder Verwendung IgG2a-PE Isotype, entsprechend der Gruppeneinstellung. Vortex kurz und die Proben auf Eis für 5-10 Minuten im Dunkeln inkubieren.
6. Fügen Sie 1 mL PBS in jedes Rohr und Zentrifuge bei 400 X g für 5 min. Überstands verwerfen. Die Zelle-Pellets mit 200-300 µL PBS für Flow-Zytometrie Analyse aufzuwirbeln. Führen Sie jedes Rohr und Erfassung von Daten für mindestens 10.000 Veranstaltungen von F4/80⁺ Zellen.

Der Haustier-SUMO-Vektor nutzt eine kleine Ubiquitin-ähnliche Modifikator "um die Expression von nativen Proteinen in E. Colizu ermöglichen. SUMO-Fusion kann erheblich verbessern die EGFP Löslichkeit, so dass sie leicht erkannt werden. Wenn der Ausdruck EGFP erfolgreich durch Laktose induziert wird, können grüne Kolonien im Dunkeln (Abbildung 1A) beobachtet werden. Grüne Punkte, die EGFP exprimierenden E. Colidarstellen, können unter dem Fluoreszenzmikroskop mit einem 40 X Objektiv (Abbildung 1 b) beobachtet werden.

Mikroskopie-Analyse zeigt Fluoreszenzbilder (Abbildung 1) von peritonealen Makrophagen aus den jungen und alten Gruppen. Abbildung 1 zeigt die rote Fluoreszenz der F-Aktin, die grünen Fluoreszenz von EGFP exprimierenden E. Coli, die blaue Fluoreszenz des DAPI nuklearen Färbung und das zusammengefügte Bild aller drei Fluoreszenz-Kanäle. Die 16 Monate alte Mäuse, die als die gealterte Mäuse galten, wurden Äquivalent von 60 auf 65 Jahre alten Menschen. Diese Bilder zeigen, dass Makrophagen von jungen Mäusen eine stärkere Phagozytose Fähigkeit als diejenigen aus den alten Mäusen vorgestellt.

Durchflusszytometrie (Abbildung 2) wurde zur Quantifizierung und Makrophagen Phagozytose aus der Gruppe junger und Alter zu vergleichen. Abbildung 2A zeigt eine repräsentative Flow Cytometry Analyse der jungen, im Alter und Kontrollgruppen. Die F4/80-PE Antikörper wurde verwendet, um zu identifizieren und die Makrophagen gate und EGFP-Positive Signale zeigen die Makrophagen, die E. Coliphagozytiertes. Der Anteil der F4/80+ und EGFP+ Zellen zeigen die phagocytic Fähigkeit der Makrophagen. Das Ergebnis (Abb. 2 b) die junge Gruppe war 62,7 % ± 5,1 % (Mittelwert ± SEM), das war deutlich höher als die 35,2 % ± 2,9 % (Mittelwert ± SEM) der alten Gruppe. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit dem Trend der Fluoreszenz-Mikroskopie-Ergebnisse.

Abbildung 1 : EGFP exprimierenden E. Coli und die Phagozytose durch Makrophagen. (A) EGFP exprimierenden E. Coli Kolonien. Das Haustier-SUMO-EGFP-Plasmid verwandelte sich in BL21(DE) Zellen; die Bakterien wurden auf einer LB-Kanamycin (100 µg/mL) Platte geimpft. Eine Beschichtung von 0,5 Mmol/L Laktose auf der Plattenoberfläche LB diente als Induktor, nachgiebig EGFP Ausdruck. Wenn die EGFP erfolgreich zum Ausdruck kommt, sind gelbliche grüne Kolonien beobachtet mit UV-Licht in der Dunkelheit. (B) Fluoreszenz-Mikroskopie von EGFP exprimierenden E. Coli. Das grüne Signal darstellt EGFP exprimierenden E. Coli. Maßstabsleiste = 50 µm. (C) Multichannel Fluoreszenzbilder von Makrophagen, die E. Coliphagocytosing waren. Die Zellen wurden mit EGFP exprimierenden E. Coli (grün) für 1 h, gefolgt von einem waschen mit PBS, Fixierung mit 4 % Paraformaldehyd und Färbung für F-Aktin inkubiert mit Phalloidin 633 conjugate Arbeitslösung (rot) und DAPI (blau). Maßstabsleiste = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 : Flow Cytometry Ergebnisse. (A) repräsentative Flow Cytometry-Analyse der jungen, im Alter und Kontrollgruppen. Die peritonealen Makrophagen waren voller Flecken mit F4/80-PE nach Coincubation mit EGFP exprimierenden E. Coli. F4/80+ und EGFP+ Zellen waren selten in der negativen Kontrolle und Steuerung (Gruppe 4: junge Gruppe auf Eis) Gruppen. Die jungen und alten Fluss durchflusszytometrischen Grundstücke repräsentieren Gruppen 5 und 6. (B) die Ergebnisse aus dem Flow-Zytometrie-Analyse der Gruppen jungen und Alter. Ein Mann-Whitney-Test wurde verwendet, um den Unterschied zwischen diesen beiden Gruppen zu untersuchen. Der Anteil der F4/80+ und EGFP+ Zellen in der jungen Gruppe war signifikant höher als in der alten Gruppe (*P < 0,05). Die Fehlerbalken repräsentieren den Standardfehler des Mittelwertes (SEM). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Tabelle 1: Gruppe Einstellung für Fluoreszenzmikroskopie. Zwei Gruppen, die im Alter von Gruppe (16 Monate alten C57BL/6, n = 3) und die junge Gruppe (8 Wochen alten C57BL/6, n = 3), wurden zur peritoneale Makrophagen vorzubereiten. Die peritonealen Makrophagen jede Maus wurden hinzugefügt, um Brunnen zu trennen. Ca. 2 x 105 Zellen in einem Volumen von 100 µL wurden hinzugefügt in jede Vertiefung; Anschließend wurden ca. 2 x 107 EGFP exprimierenden E. Coli Zellen in einem Volumen von 10 µL jeder gut und coincubated für 1 h bei 37 ° c hinzugefügt

Tabelle 2: Gruppe Einstellung für Durchflusszytometrie. Die primären peritonealen Makrophagen von den jungen und alten Mäusen wurden als sechs Gruppen festgelegt. Gruppe 1 wurde als Isotype Steuerelement festzulegen; Gruppen 2 und 3 wurden als einzelne Positivkontrolle für den PE oder EGFP Kanal bzw. festgelegt. Um sicherzustellen, dass die verinnerlichte Fluoreszenz spezifisch für die Phagozytose ist, wurde die Gruppe 4 auf Eis inkubiert. Die Phagozytose wird wegen der niedrigen Temperatur auf Eis gestoppt. Die Inkubationszeit betrug 1 h für alle Gruppen.

Die Autoren haben nichts preisgeben.