Methodenartikel

Hoher Durchsatz In Vitro Bewertung der Latenz Umkehrung Agenten auf HIV Transkription und Spleißen

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DOI:

10.3791/58753

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22. Januar 2019

 , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Melbourne

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ein hoher Durchsatz-Protokoll für funktionale Bewertung von HIV effiziente Reaktivierung und Clearance von latenten Proviruses ist beschrieben und durch die Auswirkungen von Interventionen auf die Transkription von HIV-Tests und Spleißen angewendet. Repräsentative Ergebnisse des Effekts der Latenz Umkehrung Agenten auf LTR-driven Transkription und Spleißen stehen zur Verfügung.

Zusammenfassung

HIV bleibt aufgrund der Existenz eines Reservoirs von Zellen, die stabil und latente Form des Virus, birgt für das Immunsystem unsichtbar bleibt und nicht durch die aktuelle antiretrovirale Therapie (cART) unheilbar. Transkription und Spleißen wurden gezeigt, HIV-1 Latenzzeiten in ruhenden CD4 + T-Zellen zu verstärken. Umkehrung der Latenz durch den Einsatz von Latenz Umkehr Agenten (Gebietskörperschaften) in der "Shock and Kill" Ansatz wurde ausgiebig untersucht, in dem Versuch, dieses Reservoir zu bereinigen, aber keinen Erfolg in klinischen Studien wegen mangelnder Entwicklung von angemessenen kleinen bisher nicht nachgewiesen Moleküle, die effizient dieses Reservoir durcheinanderbringen können. Die hier vorgestellten Protokoll stellt eine Methode zur zuverlässig und effizient Bewertung Latenz Umkehr Agents (Gebietskörperschaften) auf HIV Transkription und Spleißen. Dieser Ansatz basiert auf der Verwendung von ein LTR-gesteuerte dual Color-Reporter, der gleichzeitig die Wirkung von einem LRA auf Transkription und Spleißen messen kann durch Durchflusszytometrie. Das hier beschriebene Protokoll ist ausreichend für adhärente Zellen als auch die Zellen in der Suspension. Es eignet sich für eine große Anzahl von Drogen in einem hohen Durchsatz-System testen. Die Methode ist technisch einfach zu implementieren und kostengünstig. Darüber hinaus ist die Verwendung der Durchflusszytometrie ermöglicht die Beurteilung der Zellviabilität und somit Drogen Toxizität zur gleichen Zeit.

Einleitung

Trotz wirksame langfristige antiretrovirale Therapie besteht HIV in einem latenten Zustand als eine integrierte Provirus im Speicher CD4 + T-Zellen-1. Das Chromatinstruktur des HIV-1-5 "lange terminal Repeat (LTR) Promoter und epigenetische Modifikationen wie Histon-Methylierung und Deacetylation durch DNA-Methyltransferasen (DNMT) und Histon Deacetylases (HDAC) sind wichtige Mechanismen, die transcriptional Repression und damit nach Integration Latenz2,3. Eine Vielzahl von Latenz Umkehr Agenten (Gebietskörperschaften) wurde untersucht, auf ihre Wirksamkeit induzieren Virus Produktion in-vitro- und in-vivo von latent infizierten ruhenden CD4 + T Zellen4,5,6,7 ,8. Unter den lokalen und regionalen Gebietskörperschaften getestet, HDACi (HDAC-Inhibitoren) und BET Bromodomain-Hemmer (BETis) induzieren Chromatin Enttauung und Freisetzung von positiven Transkription Dehnung Faktor b (P-TEFb) bzw., was zu nachfolgenden entlasten die transkriptionelle Repression auf die 5' LTR und Aktivierung von HIV Ausdruck9,10,11,12,13. Das Ausmaß der Reaktivierung durch diese Gebietskörperschaften erreicht war jedoch begrenzt, da nur ein mäßiger Anstieg der Zelle-assoziierten unspliced HIV mRNA (uns RNA), bezeichnend für virale Transkription, ex Vivo14,15beobachtet wurde. Wichtig ist, versäumt diese lokalen und regionalen Gebietskörperschaften auch, eine Verringerung der Häufigkeit von latent infizierten Zellen induzieren.

HIV-Ausdruck kann weiter durch ineffiziente Spleißen16 sowie Mängel im nuklearen Export mehrfach gespleißte HIV-RNA (MS-RNA)17beschränkt sein. Daher sind zur Identifizierung neue Klassen von lokalen und regionalen Gebietskörperschaften, die sind stärker und können Einfluss auf verschiedene Aspekte der Virus Produktion Post-Integration erforderlich. Darüber hinaus ist die Entwicklung von neuartigen Assays, die helfen, definieren die optimale Verbindungen effizient Latenz umzukehren erforderlich.

Hier ist ein Protokoll präsentiert, was nutzt einen Hochdurchsatz-Ansatz für funktionale Bewertung der Auswirkungen von Interventionen auf die HIV-LTR-driven Transkription und Spleißen. Kurz gesagt, eine neue LTR-gesteuerte Dual color Reporter System pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (Abbildung 1) wird zur Durchflusszytometrie HIV Reaktivierung zu beurteilen. In dieser fluoreszierende Reporter führt die Expression des unspliced mRNA HIV (4 kb), verbesserte grün fluoreszierendes Protein (EGFP) Ausdruck, während der Begriff der gespleißten mRNA (2 kb) Discosoma SP. rote (DsRed) fluoreszierendes Protein-Expression führen würde. Kurz gesagt, haben wir eine fluoreszierende Env-EGFP Schmelzverfahren Protein, gp140unc verwendet. EGFP, wo die kodierende Sequenz des EGFP in Frame mit einer UN-gespalten und verkürzten Form des Umschlags (Env) platziert wurde. Änderungen wurden eingeführt, um die Spaltstelle verhindern die Dissoziation der Env in gp120 und gp41-EGFP abtragen und zum Abschneiden der gp160-Protein vor der transmembrane Domäne erstellen eine lösliche Env analog, das erleichtert die korrekte Faltung und Ausdruck von EGFP. Auf den Ausdruck innerhalb einer Zelle, Rev lokalisiert in den Zellkern, wo es den nuklearen zytoplasmatischen Export von 4 kb Env vermittelt, mRNA über die Interaktion mit der Rev-responsive Element (RRE). Abschneiden der Env beeinträchtigt nicht die RRE liegt zwischen gp120 und gp41 und der A7 3' Splice Site. In diesem System Spleißen bei HIV-1 splice Geber 4 (SD4) und Spleiß-Akzeptor 7 (SA7) Ergebnisse bei der Herstellung von 2 kb mRNA Kodierung ein nichtfunktionaler Rev-Protein bei Aminosäure 38 abgeschnitten mit DsRed fluoreszierendes Protein, RevΔ38-DsRed verschmolzen. Kurz gesagt, war das Exon 2Nd von Rev an Aminosäure 38 durch Überlappung Erweiterung18DsRed eingefügt. Um den nuklearen Export von unspliced mRNA zu erleichtern, wurde ein Säugetier Expressionsvektor Codierung Rev (pCMV-RevNL4.3) gemeinsam mit dem fluoreszierenden Reporter Konstrukt (Abbildung 2) transfiziert. Dieses einzigartige Reporter Konstrukt hier beschriebenen eignet sich im Hochdurchsatz-Bewertung der HIV-Übertragung und Spleißen, ohne die Notwendigkeit, virale Vektoren verwenden.

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Protokoll

Hinweis: Verfahren zum Klonen, Transformation und Sequenzierung sind an anderer Stelle erläutert18,19. Die Protokolle hier beginnt die Transfektion von Säugetieren Expressionsvektoren (Abbildung 3).

1. die Transfektion von HEK293T Zellen mit Dual Color Reporter zu konstruieren

  1. Pflegen Sie HEK293T Zellen in Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 10 % (V/V) fetalen bovine Serum (FBS), Penicillin (100 U/mL) und Streptomycin (100 μg/mL) in einem 5 % CO2 Inkubator bei 37 ° C. Nach dem Auftauen Durchgang HEK293T Zellen 2-3 Mal vor der Verwendung in Transfektion experimentiert. Dies würde die Zellen Zeit wieder aus dem tauenden Verfahren geben.
    Vorsicht: Mykoplasmen Kontamination von Zellkulturen bleibt ein ernstes Problem. Gute Laborpraxis und Routineuntersuchung von Zellkulturen sind wesentlich verringern das Risiko einer Kontamination der Mykoplasmen und Verbreitung20vermeiden.
  2. Teilen Sie die Zellen, 1:2 einen Tag vor der Aussaat und in frische DMEM Medium überführen. Pflegen Sie die Zellen für 24 h in einem 5 % CO2 Inkubator bei 37 ° C.
  3. Am Vortag Transfektion, entfernen Sie das Medium aus der Flasche durch Absaugen und waschen Sie die Zellen mit Dulbeccos Phosphat gepuffert (DPBS) Kochsalzlösung frei von Kalzium (Ca2 +) und Magnesium (Mg2 +) um Spuren von Serum zu entfernen.
  4. 5 mL Trypsin-EDTA-Lösung (0,05 % - 10 mM mit PBS-Puffer) in das Kulturgefäß und legen Sie sie bei 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator für 2 bis 5 min.
  5. Wenn die Zellen getrennt sind, fügen Sie 5 mL DMEM mit 10 % (V/V) FBS ergänzt, weiter die Trypsin-Aktivität zu hemmen, die Zellen schädigen können.
  6. Aufschwemmen Sie sanft durch Pipettieren der Zellsuspension rauf und runter, bis die Klumpen zu brechen.
  7. Verdünnen Sie die Zellen 01:10 in Trypan blau Fleck (0,4 %).
  8. Zählen Sie die lebenden Zellen, die keinen Trypan blau mit einem Mikroskop (10 X-Objektiv) und eine Zählkammern belegen.
  9. Berechnen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen pro Milliliter zu, indem man den Durchschnitt der die Zellzahl und mit 10.000 multipliziert und durch den Verdünnungsfaktor (01:10) aus der Trypan blau zu färben.
  10. Platte 2 x 104 Zellen in 100 μL DMEM Medium ergänzt mit 10 % FBS ohne Antibiotika in einer 96-Well-Wohnung-Bodenplatte für 24 h.
  11. Für jedes gut verdünnen 400 ng von pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRed, 20 ng pCMV-RevNL4.3 und 100 ng pCMV-Tat101AD8-Flagge DNA in 50 μL Serum freie Medium. Mischen Sie vorsichtig. Verwenden Sie für Experimente ohne Tat eine abgestimmte leer Tat-Vektor-pcDNA3.1 (-).
    Hinweis: Die Verwendung von Endotoxin-freie DNA wird dringend empfohlen. Dafür bereiten Sie Endotoxin-freie DNA mit Hilfe einer Nukleinsäure Reinigung Kit MIDI- oder Maxiprep. Bestimmen Sie die DNA Reinheit durch die Messung der 260/280 AD-Verhältnis, das zwischen 1,7 und 1,9 sein sollte.
  12. Mischen Sie der Lipid-Reagenz gemischt, dann verdünnen Sie 0,65 μL in 50 μL Serum freie Medium. Vorsichtig mischen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  13. Kombinieren Sie die verdünnte DNA mit dem verdünnten Lipid-Reagenz.
  14. Vorsichtig mischen und 20 min bei Raumtemperatur inkubieren. Die Lösung erscheinen trüb.
    Hinweis: Fahren Sie mit Schritt 1.15. innerhalb von 30 Minuten.
  15. 100 μL pro Well der Lipid-Reagenz-DNA-komplexe tropfenweise auf die Zellen zu verzichten.
  16. Mischen Sie leicht von der Platte hin und her schaukeln.
  17. Inkubieren Sie die Platte für 5 h in einem 5 % CO2 befeuchteten Inkubator bei 37 ° c
    1. Jede Reaktion Mischung reicht für einen einzigen Brunnen (96-Well) Transfection. Passen Sie die Höhe und Volumen der Komponenten entsprechend der Anzahl der Droge und Kombination, die getestet werden würde und Konten für Pipettier Variationen. Alle Bedingungen werden in der Regel in Triplicates getestet.
    2. Transfizieren weitere Brunnen mit 100 ng von CMV-driven EGFP und DsRed-Express DNA Plasmid zwecks Entschädigung.

2. Behandlung von transfizierten HEK293T Zellen mit Latenz Umkehrung Agenten

Hinweis: Bestimmen Sie vor jedem Test den physiologischen Zustand der jede LRA durch Messung der Lebensfähigkeit der Zellen nach der Exposition auf hohe und niedrige Dosis des Medikaments mit Cell Proliferation Assay.

  1. Jede LRA auf die entsprechenden Arbeiten Konzentration mit Wachstumsmedium verdünnen (z. B., 1 μM für JQ1(+)).
    Vorsicht: Bereiten Sie die lyophilisierten Medikamente mit dem entsprechenden Lösungsmittel zu einer Konzentration von 10 mM. Aufbewahren Sie alle Lager Gebietskörperschaften bei-80 ° C in einer einmaligen Gebrauch aliquoten (5 μl), um wiederholte Einfrieren Auftauen Zyklen zu vermeiden.
  2. Vorsichtig aspirieren Sie Transfektion Medium mit einem Mehrkanal- und ersetzen Sie mit 100 μl Medium mit entsprechenden LRA (Tabelle 1). Fügen Sie Medium sehr sanft entlang der Mauer des Brunnens zu vermeiden, trennen die transfizierten HEK293T Zellen, die bekannt sind, leicht zu trennen von der Kultur Plattenoberfläche.
  3. Inkubieren Sie die Platte für 48 h in einem 5 % CO2 befeuchteten Inkubator bei 37 ° c

3. Färbung von transfizierten Zellen mit fixierbar Lebensfähigkeit Farbstoff für Flow Cytometry Analysis

Vorsicht: Entfernen abgestorbene Zellen und Schutt ist erforderlich, um Fehlalarme zu beseitigen und Ergebnisse von höchster Qualität zu erhalten.

  1. Lösen Sie die Zellen in den Medien mit 100 μL der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) pro Bohrloch und sanft Pipettieren wechselvollen (~ 5 Mal) mit einer Mehrkanal Aufschäumen der Medien zu vermeiden. Falls erforderlich, lösen Sie die Zellen von der Platte mit 35 µL pro Bohrloch Trypsin-EDTA-Lösung (0,05 % - 10 mM mit PBS-Puffer) und Inkubation 5 min bei 37 ° C, vor Neutralisierung mit Serum-haltigem Medium.
  2. Übertragen Sie die Zellen auf eine 96-Well-V-Boden-Platte.
  3. Drehen Sie die Zellen für 5 min bei 500 X g bei 4 ° C, dann aspirieren Sie vorsichtig Medium/PBS ohne die Zellen zu berühren.
  4. Waschen Sie die Zellen mindestens 1 Mal mit 200 μl Protein/Serum frei PBS.
  5. 500 X g für 5 min bei 4 ° C zentrifugiert, dann verwerfen des Überstands durch Kippen der Plattenrandes und der Waschpuffer ohne die Zellen zu entfernen.
  6. Bereiten Sie eine funktionierende Lösung des Farbstoffes fixierbar Lebensfähigkeit durch die Lebensfähigkeit Farbstoff 1: 1000 in Protein/Serum frei PBS verdünnen. Bereiten Sie 50 µL des verdünnten Flecks pro Bohrloch.
    Hinweis: Lebensfähigkeit Farbstoffe sind in einer Palette von Farben geeignet für den Einsatz mit blauen, roten und violetten Lasern zur Verfügung. Bereiten Sie eine Stammlösung fixierbar Lebensfähigkeit Farbstoff durch resuspending ein Fläschchen des lyophilisierten Farbstoffs (Komponente A) mit 50 μL wasserfreiem DMSO (Komponente B). Shop bei-20 ° C in einen einzigen Verwendungszweck aliquoten (1 μl), vor Licht geschützt.
  7. 50 μL der verdünnten Lebensfähigkeit Farbstoff in jede Vertiefung und mischen Sie die Zellen von oben und unten mit einer Mehrkanal pipettieren.
  8. Fleck für 10-15 min bei 4 ° C, vor Licht geschützt.
  9. 1-bis 2-Mal mit 150 μl Waschpuffer (PBS mit 1 % bovine Serum Albumin und 2 mM EDTA) waschen.
  10. Zentrifuge bei 500 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
  11. Befestigen Sie die Zellen mit 100 μL der frisch zubereiteten 1 % Formaldehyd in Waschpuffer für 10-15 min bei 4 ° C im Dunkeln.
    Vorsicht: Formaldehyd ist sehr giftig. Bereiten Sie 1 % Formaldehyd-Lösung in einer Dampfhaube, Einatmen beim Tragen von Handschuhen und Schutzbrille zum Schutz zu vermeiden.
  12. Waschen Sie die Zellen 1-2 Mal mit 100 μl Waschpuffer.
  13. Zentrifuge bei 500 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
  14. Die Zelle Pellet in 70 μl Waschpuffer aufzuwirbeln.
    Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Fixe Zellen könnten bei 4 ° C im Dunkeln für die Analyse am nächsten Tag auf das Durchflusszytometer gespeichert werden.

4. EGFP und DsRed Messungen durch Durchflusszytometrie und Datenanalyse

Hinweis: HIV-Übertragung (% EGFP) und Spleißen (% DsRed) auf einem Durchflusszytometer analysieren. Filtern Sie die Probe vor dem Lauf mit einem 70 μm Zelle-Sieb oder 100 μm-Nylon-Mesh zu vermeiden, die Düse verstopfen.

  1. Starten Sie die Cytometer und Computer mindestens 10 min vor mithilfe von Lasern aufwärmen zu gewährleisten.
  2. Füllen Sie vor Beispiele ausführen und Beginn der Datenerfassung den Mantel Tank mit 0,9 % Kochsalzlösung und sicherstellen Sie, dass der Fäkalientank Natriumhypochlorit Tablet hinzugefügt wird.
  3. Überprüfen Sie die Messzelle für Luftblasen.
  4. Stellen Sie sicher, dass die Melder und Filter für das Experiment geeignet sind.
    Hinweis: Für EGFP, Nutzung der blauen Laser (488 nm) und 530/30 Bandpass, während DsRed Express optimal erkannt wird mit dem gelben Laser (561 nm) und 610/20 Bandpass. Ein blauer Laser (488 nm) und 610/20 Bandpass kann auch verwendet werden, um DsRed Ausdruck zu erkennen.
  5. Überprüfen Sie die Cytometer Leistung und Empfindlichkeit über Detektoren durch Kalibrierung Perlen ausführen.
  6. Passen Sie den vorwärts (FSC-A) und Side Scatter (SSC-A) Spannungen mit ungefärbten Probe, so dass die Bevölkerung auf dem Bildschirm ist und klar erkennbar.
    Hinweis: FSC (Forward verteilt Licht) ist eine Messung des Lichts Beugung in einem flachen Winkel, die abhängig von dem Volumen der Zelle (Zelle Oberfläche oder Größe), beim SSC (Seite-Streulicht) ist eine Messung der Lichtbeugung im rechten Winkel, die proportional zur Zelle Granularität und interne Komplexität.
  7. Führen Sie manuelle oder automatische Kompensation mithilfe der Einzel-gefärbten Proben gewährleistet minimale Spillover EGFP + Bevölkerung in die DsRed Detektor und umgekehrt aus.
    Vorsicht: Verwenden Sie für Entschädigung Zwecke eine Probe von Zellen ausdrückt jede einzelne Farbe fluoreszierendes Protein und die Zellen einzeln mit dem fixierbar Lebensfähigkeit Farbstoff gefärbt. Verwenden Sie FITC und PE Entschädigung Perlen nicht für EGFP und DsRed fluoreszierende Proteine Entschädigungen aufgrund der unterschiedlichen spektralen Eigenschaften. Vergütung Kontrollen sollte hell genug, um positive und negative Bevölkerung zu lösen.
  8. Erstellen Sie Grundstücke und legen Sie die Tore mit Fluoreszenz minus 1 (FMO) Kontrollen.
  9. Erwerben Sie und notieren Sie ein Minimum von 10.000 lebensfähigen Zelle Ereignisse pro Probe. Ausführen von Beispielen mit mittlerer oder niedriger Geschwindigkeit, Dubletten, die durch den Laser abfangen zu vermeiden. Verwenden Sie Puls Geometrie gating wie SSC-A vs. SSC-H, Dubletten zu beseitigen. Überprüfen Sie die Stabilität des Laufs durch Plotten Zeit gegen SSC-A um zu sehen, wie auch die Strömung ist während des Laufs.
  10. Am Ende des Laufs Flow Cytometry Fluidik mit konzentrierten Reinigungsmitteln zu reinigen, dann Wasser für 5 Minuten.
  11. Herunterfahren des Systems die Abfälle entsorgen und neu auftanken Scheide nach Erwerb.
  12. Analysieren Sie die Daten mit Hilfe einer Flow Cytometry Datenanalyse-Software. Zellenrückstand und Klumpen (Dubletten) basierend auf vorwärts- und seitliche Streuung ausschließen, dann beseitigen abgestorbene Zellen mit der Lebensfähigkeit Farbstoff Fleck (negative Bevölkerung = lebende Zellen). Identifizieren Sie die Zellen mit dem Ausdruck EGFP und DsRed (Abbildung 4), sowie der Prozentsatz der gespleißten Produkt DsRed /(DsRed + EGFP) (Abbildung 5).
  13. Bestimmen Sie die Wirkung der LRA auf HIV Transkription und Spleißen durch Vergleich von unbehandelten Zellen und den Zellen, einzelnen oder einer Kombination aus lokalen und regionalen Gebietskörperschaften (Abbildung 5).

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Ergebnisse

Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 5 gezeigt, die Expression von HIV-1 unspliced (EGFP) und gespleißt (DsRed) Produkte, die nach der Behandlung mit Bromodomain-Hemmer JQ1. JQ1(+) und Tat deutlich stieg der Anteil der Zellen mit dem Ausdruck EGFP (2,18 und 4.13 FC über DMSO bzw.; n = 3) bezeichnend für unspliced Transkripte. Darüber hinaus JQ1(+) deutlich stieg der Anteil der Zellen mit dem Ausdruck DsRed (46,6 FC über DMSO) sowie der Anteil der gespl...

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Diskussion

Angesichts der Schwierigkeiten bei der Messung der Virus-Reaktivierung ex Vivo, infiziert eine Vielzahl von in-vitro-Modelle im Laufe der Zeit entwickelt wurden, um HIV-Latenz einschließlich latent studieren T-Zell-Linien (J-Lats, ACH2, U1), primäre Modelle der latenten Infektion ruhen ( O' Doherty, Lewin, Greene und Spina-Modelle) oder pre-activated CD4 + T-Zellen (Sahu, Marini, Planelles, Siliciano, Karn Modelle) mit einzelnen Runde oder Replikation zuständigen Reporter Viren22. Um die physiolog...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von Projekt Grant APP1129320 und Programm APP1052979 Stipendium der NHMRC Australia unterstützt. Wir danken Dr. Adam Wheatley, Dr. Marina Alexander, Dr. Jenny L. Anderson und Michelle Y. Lee für die wesentlichen Konstrukte und Beratung für den erfolgreichen Abschluss dieser Arbeit. Wir danken auch das DMI-Flow-Anlage Personal für ihre Ratschläge und großzügige Unterstützung bei der Aufrechterhaltung der in dieser Studie verwendeten Durchflusszytometer.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Zellkultur
HEK293T Zellen (humane embryonale Nierenzellen)ATCCCRL-3216repliziert Vektoren, die die SV40-Replikationsregion tragen.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I)Gibco10569-010+ 4,5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Natriumpyruvat
Fötales RinderserumGibco10099-141Herkunft Australien
Penicillin-StreptomycinSigmaP4458
Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS), kein Calcium, kein MagnesiumGibco14190-136
Trypanblau Färbung, 0,4%Gibco15250
Trypsin-EDTA (0,05%), PhenolrotGibco25300054
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-019Lipidtransfektionsreagenz
Opti-MEM I (1x) reduziertes SerummediumGibco31985-070Serum freies Medium
NucleoBond Xtra MaxiMarcherey-Nagel740414.50
pEGFP-N1-PlasmidClontech (TaKaRa)6085-1Expression von EGFP in Säugetierzellen, CMVIEPromotor.
pDsRed-Express-N1Clontech (TaKaRa)632429Expression von DsRed-Express in Säugetierzellen, CMVIEPromotor.
pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRedAddgene115775
pCMV-RevNL4.3Addgene115776
pCMV-Tat101AD8-FlagAddgene115777
Dimethylsulfoxid (DMSO)Millipore67-68-5
JQ1(+)Cayman Chemical11187Bestand bei 10 mM in DMSO; Arbeitskonzentration 1 μ M
JQ1(-)Cayman Chemical11232Bestand bei 10 mM in DMSO; Arbeitskonzentration 1 μ M
Phorbol Myristatacetat (PMA)Sigma-Aldrich16561-29-8Bestand à 100 μ g/ml in DMSO; Arbeitskonzentration 10 nM
Phytohämagglutinin (PHA)RemelHA15/R30852701Lagerbestand bei 1 μ g/μ L in PBS; Arbeitskonzentration 10 μ g/mL
Vorinostat (VOR)Cayman Chemical10009929Lagerbestand bei 10 mM in DMSO; Arbeitskonzentration 0,5 μ M
Panobinostat (PAN)TRCP180500Bestand bei 10 mM in DMSO; Arbeitskonzentration 30 nM
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation AssayPromega63581
Venor GeM ClassicMinerva Biolabs11-1100Mycoplasma Detection Kit, PCR-based
NameCompanyKatalognummerKommentare
Durchflusszytometrie-Reagenzien
LSR FortessaBD BiosciencesDurchflusszytometer (4 Laser - blau, rot, violett und gelb)
LSR IIBD BiosciencesDurchflusszytometer (3 Laser - blau, rot und violett)
LIVE/DEAD Fixierbar Nah-IR tot Cell Stain KitLife TechnologiesL34976Viabilitätsfarbstoff: für 633 oder 635 nm Anregung, 400 Assays. Komponente A und B sind beide im Kit enthalten.
Rinderserum AlbuminSigmaA2153
EDTA 0,5M pH8Gibco15575-038
Formaldehyd Lösung 37/10 (37%)Chem-SupplyFA010
BD FACS Diva CS& T Research BeadsBD Biosciences655050Kalibrierkugeln
Sphero Rainbow Calibration Particles (8 Peaks)BD Biosciences5591233,0 - 3,4 mm
MantellösungChem-SupplySA04690 g NaCl in 10 L Wasser
HAZ-TabsGuest MedicalH8801Chlortabletten zur Desinfektion
Decon 90Decon Laboratories LimitedN/AKonzentrierte Reinigungsmittel für Durchflusszytometer. Arbeitslösung Decon 90 5%.
Natriumhypochlorit (12-13% ige Lösung)LabcoSODHYPO-5LKonzentrierte Reinigungsmittel für Durchflusszytometer. Arbeitslösung Bleiche 1%.
7xMPBioIM76670Konzentrierte Reinigungsmittel für Durchflusszytometer. Arbeitslösung 7x 1%.
Name<>UnternehmenKatalognummer<strong>Kommentare
Materials
Gewebekulturflaschen (75 cm2, schräger Hals, Kappe belüftet)Corning430641U
Gewebekulturplatten (96 Well flacher Boden mit Deckel)Costar3599
Gewebekulturplatten (96 Well V-Boden ohne Deckel)Costar3896
Zentrifugenröhrchen (10 mL)SARSTEDT62.9924.284100x16 mm
Zentrifugenröhrchen (50 mL)CellStar22726130x115 mm
Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 mL)Corning AxygenMCT-150-C
Serologisch Pipette (25 mL), sterileCorningCLS4489-200EA
Serologische Pipette (10 mL), sterileCorningCLS4488-200EA
Serologische Pipette (5 mL), sterileCorningCLS4487-200EA
Reagenzreservoire (50 mL),sterile CorningCLS4470-200EA
5 mL Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden, mit ZellsiebkappeCorning35223512 x 75 mm Stil, 70 mm
Nylon MeshSEFAR03-100/32100 mm
Titerröhrchen Mikro-Reagenzgläser, BulkBIO-RAD2239391Microfacs Röhrchen
5 mL Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden, ohne KappeCorning35200812x75 mm Stil
Schnappverschlüsse für 12x75 mm ReagenzgläserCorning352032
Zählkammer, Neubauer verbesserte Doppelnetzlineatur, Bright-Line (Hämozytometer, LO-Laboroptik)ProSciTechSVZ4NIOU3x3 große Quadrate von 1 mm2; Tiefe 0.100 mm; Volumen 0,1 ml; Fläche mindestens 0,0025 mm2
Deckgläser (Menzel-Glä ser)Grale ScientificHCS202620 x 26 mm
MikroskopNikon TMS310528
Zentrifuge 5810R gekühltEppendorf5811000487mit Rotor A-4-81 inkl. Adapter für 15/50 mL konische Röhrchen
FLUOstar Omega Mikroplatten-ReaderBMG LabtechN/APlatten-Reader für Zellproliferationsassays. Filter 490 nm.
NameUnternehmenKatalognummer<strong>Kommentare
Softwares
FACS DivaBD BiosciencesDurchflusszytometer-Datenerfassungs- und Analyseprogramm, Version 8.0.1
FlowJoFlowJoFlowJo 10.4.2Datenanalyseprogramm für Durchflusszytometer, FlowJo Engine v3.05481
OmegaBMG LabtechFLUOstar Multi-User-Reader-Steuerung, Version 5.11
Omega - DatenanalyseBMG LabtechMARSFLUOstar Datenanalyse, Version 3.20R2
Microsoft ExcelMicrosoftExcel:mac 2011Version 14.0.0
PrismGraphPadPrism 7Version 7.0c

Referenzen

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