Verwenden eine bakterielle Erreger, Sonde für zelluläre und organismische Ebene Host Antworten

Zusammenfassung

Wir beschreiben beide in vitro und in vivo Infektion-Assays, die verwendet werden können, um die Aktivitäten des Host-Codierung Faktoren zu analysieren.

Zusammenfassung

Es gibt eine Vielzahl von Strategien, die bakterielle Krankheitserreger zu beschäftigen, um zu überleben und vermehren sich einmal im Inneren der eukaryotischen Zelle. Die so genannte "cytosolischen" Erreger (Listeria Monocytogenes, Shigella Flexneri Burkholderia Pseudomallei, Francisella Tularensisund Rickettsien spp.) erhalten Sie Zugriff auf die infizierte Zelle Zytosol durch physisch und enzymatisch erniedrigender die primäre Vacuolar-Membran. Einmal in das Zytosol, diese Erreger sowohl vermehren sowie generieren ausreichende mechanische Kräfte, die Plasmamembran der Wirtszelle zu durchdringen, um neue Zellen zu infizieren. Hier zeigen wir, wie dieses terminal Schritt von den zellulären Infektionszyklus von L. Monocytogenes (Lm) von koloniebildenden Einheit Assays und Durchflusszytometrie quantifiziert werden kann und geben Beispiele dafür, wie die beiden Erreger - und Host-codierte Faktoren Auswirkungen dieses Prozesses. Wir zeigen auch eine enge Übereinstimmung von Lm -Infektion Dynamik der kultivierten Zellen infiziert in-vitro- und denen der hepatischen Zellen aus Mäusen infiziert in-vivo. Diese Funktion basierende Assays sind relativ einfach und können leicht für Entdeckung-basierte Hochdurchsatz-Bildschirme für Modulatoren der eukaryotic Zelle Funktion skaliert werden.

Einleitung

Infektion-basierte experimentelle Modelle sind von Natur aus schwierig wegen ihrer Abhängigkeit von der Staat Startbedingungen der Host und Erreger, die verschiedenen Erreger Infektion Strategien und die Schwierigkeiten bei der Zuschreibung von Erreger und Wirt-gesteuerte Prozesse anhand der Ergebnisse. Das Bakterium Listeria Monocytogenes (Lm) ist eine ideale Erreger, Wirt Verteidigung Antworten wegen seine genetische und mikrobiologische Lenkbarkeit, seine schnelle und prozessualen zelluläre Infektion Strategie und relativ klar Sonde geworden. Beziehung zwischen der zellulären und organismische Ebene Infektion Phänotypen. Die zelluläre Infektion von Lm durchläuft vier Phasen¹: (i) zellulären Invasion, die mit Lm wird eingeschlossen in einer Vakuole; schließt (Ii) Lm-Regie Auflösung der Vakuole Membran und Freisetzung von Lm in das Zytosol; (Iii) Intracytosolic Replikation; und (iv) körperliche Penetration der Plasmamembran, das ergibt sich entweder die Infektion der direkt benachbarten Zellen (z. B. in einem epithelialen Blatt) oder in einsamen Zellen, Freisetzung von Lm in das extrazelluläre Milieu. Jede dieser Phasen werden gefördert durch spezifische Lm-Faktoren (bezeichnet als "Virulenzfaktoren") kodiert, wenn gelöscht, verursachen Infektion Mängel in zellulären und tierischen Modellen. Diese Allgemeininfektion Strategie hat unabhängig von einer Reihe von sogenannten "cytosolischen" Krankheitserreger²entwickelt worden.

Koloniebildenden Einheit (KBE) Assays werden häufig eingesetzt, um sowohl in-vitro-bewerten (d. h. zellulären) als auch in vivo (d. h. Organismische) Infektion Ergebnisse. Neben ihrer hohen Empfindlichkeit, besonders für in-vivo-Infektionen bieten KBE-Assays eine eindeutige Anzeige für Erreger Invasion und intrazelluläre überleben/Verbreitung. KBE-Assays wurden ausgiebig zur Lm und Host Zelle Determinanten zu analysieren, die Infektion auswirken. So informativ, wie diese früheren Studien gewesen, zellulären Invasion und Intracytosolic Replikation zu analysieren, KBE-Assays nicht, nach bestem Wissen und Gewissen, wurden verwendet, um die vierte Phase des Lm -Infektion-Prozesses zu verfolgen: zelluläre entkommen. Hier beschreiben wir relativ einfach, wie zelluläre Fluchtwege (nachfolgend "Entstehung") lässt sich durch KBE-Assay (sowie durch Durchflusszytometrie) und zeigen Beispiele wie die beiden Erreger - und Host-codierte Faktoren regulieren diese Phase der Lm Infektionszyklus. Die Analyse der terminalen Phase des zellulären Lm -Infektionszyklus besteht dann die Möglichkeit, zusätzliche Erreger und Wirt Zelle Infektion-spezifische Faktoren und Aktivitäten zu identifizieren.

Protokoll

Mäuse wurden in Übereinstimmung mit allen zuständigen staatlichen Richtlinien für die Pflege menschlich behandelt und verwenden von Versuchstieren von den National Institutes of Health und deren Verwendung für die gesamte Studie von der University of Miami institutionelle Tierbetreuung genehmigt wurde und Use Committee (16-053-Protokoll).

1. vorbereiten Infektion Zellen

1. Propagieren Maus Makrophagen-ähnliche Zelllinie RAW 264,7 in DMEM Gewebe Kulturmedien mit 10 % fetalen Kälberserum (im folgenden als DMEM/FCS bezeichnet) ergänzt mit einer 125 mL Flasche und einer Gewebekultur Inkubator bei 37 °C/5% CO₂beibehalten.
2. Verwenden Sie am Tag vor der Infektion Schabeisen Zelle Zellen aus den Ausbau Kolben entfernen und sammeln Sie in einem 15 mL Schraubverschluss konische Rohr. Zellen bei 800 X g für 10 min Zentrifugieren, überstand abgießen und Aussetzen der Zelle Pellet in 1 mL DMEM/FCS (ohne Antibiotika) und bestimmen die Titer mit einem Hemocytometer oder einem automatisierten Zelle Zähler.
3. Passen Sie Titer bis 2 x 10⁶ Zellen/mL und Brunnen ein 48-Well-Zellkultur-Gericht fügen Sie 0,10 mL (2 x 10⁵ Zellen hinzu). Sicherstellen Sie, dass die Zellsuspension die gesamte Oberfläche des Brunnens deckt.
   1. Platte Zellen in zusätzliche Brunnen für eine spätere Quelle der konditionierten Medien. Auch Platz 0,10 mL DMEM/FCS in drei zusätzliche Brunnen als eine "keine Zellkontrolle" dienen.
4. Brüten Sie über Nacht in einer Gewebekultur Inkubator bei 37 °C/5% CO₂. Am nächsten Tag nicht entfernen von Inkubator bis das Bakterium Inokulum vorbereitet und einsatzbereit ist.

2. Vorbereitung Infektion mit Listeria Monocytogenes (Lm)

1. 2 mL der Hirn-Herz-Infusion (BHI) mit einer einzigen Kolonie von frisch gestreift Nährbodenplatte impfen (< 2 Tage) LM und über Nacht bei 37 ° C mit Schütteln bei 130 Umdrehungen/min inkubieren.
2. Fügen Sie am nächsten Tag 0,10 mL über Nacht Kultur bis 2 mL BHI vorgewärmt und weiter Inkubation bei 37 ° C mit schütteln, bis die optische Dichte (OD₆₀₀) zwischen 0,4 und 0,6 ist hinzu.
3. Ungefähre bakterielle Titer unter Verwendung einer empirisch abgeleitete Umrechnungsformel zu bestimmen. In unserem Labor eine exponentiell wachsende Lm -Kultur im BHI ist ca. 1,3 x 10⁹ Koloniebildenden Einheiten (KBE) /OD₆₀₀. Minimieren Sie die Zeit, die Bakterienkulturen Raumtemperatur ausgesetzt sind.
4. Kurz vor der Infektion anpassen der Titer auf 5 x 10⁷ KBE/mL vorgewärmten DMEM/FCS als Verdünnungsmittel verwenden.

3. Infektion

1. Arbeitet schnell und präzise, 20 µL hinzufügen (1 x 10⁶ KBE; Multiplizität der Infektion, MOI = 5) des frisch zubereiteten Lm Inokulums (Schritt 2.4 oben) in Vertiefungen durch leichtes Kippen der Schale und sorgfältig platzieren Pipettieren Tipp in den darüberliegenden Medien;
   Hinweis: berühren Sie die Wände des Brunnens mit der Spitze pipettieren.
2. Sanft Pipettieren vervollständigen den Inhalt jedes gut darauf mischen; nicht schütteln Sie oder deutlich kippen Sie die Platte, wie dies die Wände des Brunnens Lm verteilt wird. 37 °C/5% CO₂ -Inkubator Zelle Kulturschale zurückzukehren.
3. Bereiten Sie eine 10 µg/mL Gentamicin Lösung mit konditionierten Medien aus nicht infizierten Brunnen als Verdünnungsmittel.
4. 30 Minuten nach Infektion (Mpi), fügen Sie sorgfältig den Inhalt der sowie vor und zurück Zelle Kulturschale 30 µL der Gentamicin-Lösung (Endkonzentration 2,5 µg/mL) und sanft pipettieren, 37 °C/5% CO₂ Inkubator.
5. Ernten Sie bei 60 Mpi entsprechende Vertiefungen für KBE-Assay (60 Mpi-Zeitpunkt) oder FCM-Analyse (wie unten in den Abschnitten 4 und 5 beschrieben).
6. Für die verbleibenden Brunnen zu verschiedenen Zeiten danach entweder Zellen wie vor oder für die Lm -Entstehung-Assay ganz Medien aus gut entfernen und mit 150 µL Gentamicin-freie konditionierten Medien ersetzen zu ernten.

(4) Probenahme, Aufbereitung und Analyse von intrazellulären und Emergent Lm von KBE-Assay

1. Zu ernten, die Schale leicht kippen und entfernen vorsichtig das gesamte Medium aus dem Brunnen. Der Brunnen 0,50 mL destilliertem sterilem Wasser (DsH₂O) hinzufügen. Nach 30 s, die daraus resultierende Wasser lysate (10⁰) zu einer 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und kräftig vortexen 10 s.
2. Bereiten Sie 10^-1 und 10^-2 Verdünnungen, indem entweder 4,5 µL oder 50 µL des Wassers lysate zu 450 µL der DsH₂O und kurz Wirbel um gute Durchmischung zu gewährleisten.
3. Verbreiten von 50 µL der 10⁰, 10 -1/10^-2 Proben auf Agarplatten Lysogeny Brühe (LB) oder.
4. Test für emergente Lm (Schritt 3.6 oben), 10 µL der Überlagerung Medien entfernen und teilen sie in zwei 5 µL Aliquots: zu einem aliquoten hinzufügen 5 µL DMEM/FCS und die zweite aliquoten 5 µL DMEM/FCS mit 5 µg/mL Gentamicin. Die Kontrolle unterscheidet zwischen extrazellulären Lm (Gentamicin empfindliche) und intrazellulären Lm (Gentamicin resistent) in die nachfolgende KBE assay.
5. Nach 5 min bei Raumtemperatur Add-on 90 µL der DsH₂O, energisch für 10 s Wirbel und Verbreitung 50 µL LB-Agar-Platten.
6. Auflisten von Lm Kolonien auf LB-Agar-Platten nach 2 Tagen Inkubation bei 37 ° C.

(5) Probenahme, Aufbereitung und Analyse von intrazellulären und Emergent Lm durch Durchflusszytometrie (FCM)

1. Bereiten Sie RAW 264,7 Zellen, wie in den Schritten 1,1-4 beschrieben. Passen Sie Zellen, 1 x 10⁶ Zellen/mL und Brunnen der Gewebekultur 6-Well Platte fügen Sie 1 mL (1 x 10⁶ Zellen hinzu).
2. Bereiten Sie Bakterium Inokulum vor, wie in Schritt 2.1-2.3 beschrieben und infizieren Sie Zellen mit Volumen des Inokulums entspricht einer MOI von 50 (5 x 10⁷ KBE).
3. 1,5 Stunden Post-Infektion (Hpi) sammeln Sie Medien aus der ersten Reihe von Brunnen und in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit 500 µL 4 % Paraformaldehyd (PFA) und auf Eis legen Sie, bis alle Brunnen verarbeitet wurden.
4. Zum Sammeln von intrazellulären Lmfügen Sie 1 mL der DsH₂O zum Brunnen und nach 60 s, übertragen die resultierende Wasser lysate zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit 500 µL 4 % PFA. Vortex energisch für 10 s und Platz auf dem Eis, bis alle Brunnen verarbeitet wurden. (Probenverarbeitung ist im Schritt 5.8 unten beschrieben.)
5. Für die verbleibenden Brunnen Medien entfernen und ersetzen mit 1 mL DMEM/FCS mit 5 µg/mL Gentamicin zu töten extrazelluläre Lm und umgehend zurücksenden Zellen in Inkubator.
6. Nach 30 min (2 Hpi) Medien zu entfernen und ersetzen mit DMEM/FCS ohne Gentamicin.
7. Nach 2 bis 4 h (4 und 6 Hpi) zweiten und dritten Mal Punkte durch das Sammeln von Medien und Lysates als Schritte 5.3 und 5.4.
8. Zentrifugieren Sie Rohre bei 10.000 X g für 7 min. entfernen überstand ohne störende Pellet.
9. Auszusetzen, jedes Pellet in der Färbung Cocktail von 50 µL 4 % PFA und 15 µL Phalloidin. Inkubieren Sie Rohre im Dunkeln bei 4 ° C für 20 min.
10. Fügen Sie nach der Inkubation 1 mL der FACS-Puffer für jeden Schlauch und Pipette rauf und runter zu mischen hinzu.
11. Spin-Rohre bei 10.000 X g für 7 min. entfernen überstand ohne störende Pellet.
12. Hängen Sie jedes Pellet in 400 µL FACS Puffer für den sofortigen Einsatz oder FACS Puffer 200 µL und 200 µL von 4 % PFA, wenn für eine spätere Analyse gespeichert.
13. Proben auf einem Durchflusszytometrie laufen und die gesammelten Daten zu analysieren.

(6) Probenahme, Aufbereitung und Analyse von Lm Kolonisation und Host-Reaktionen in der Leber

1. Bereiten Sie Lm für Infektion, wie unter Punkt 2.1-2.3 beschrieben.
2. Berechnen Sie die notwendige Menge an Subkultur für gewünschte Titer von 3 x 10⁶ KBE/mL.
3. Kurz vor der Infektion verdünnen Sie die Höhe der berechneten Bakterien mit vorgewärmten Hank ausgewogen Salz Lösung (HBSS) in einem Endvolumen von 1 mL. Dies ist die Eingabe Inokulum, das in der Maus injiziert wird.
4. Mit einer 28 G½ 100U Insulin Spritze, 100 µL (3 x 10⁵ KBE) Eingabe Inokulum zu ziehen und sichtbaren Luftblasen zu entfernen.
5. Platzieren Sie den Mauszeiger (Stamm C57BL/6; Männer zwischen 6 und 12 Wochen alt) in der Holding Zurückhaltung und verwenden Sie warmes Wasser (nicht mehr als 45 ° C), um die Rute Vene zu dehnen, dann injizieren Sie die Eingabe Inokulum in die Vene.
6. Platte 10^-2 und 10^-3 Verdünnungen der Eingabe Inokulum auf Agarplatten 10bcm LB und Inkubation über Nacht bei 37 ° C, die tatsächliche Eingabe Dosierung zu bestimmen.
7. Bei 18 Hpi Human einzuschläfern Sie, Maus (CO₂ Erstickung gefolgt von zervikale Dislokation) und mit steriler Schere geschnittenen offenen Maus Peritoneum Frontallappen der Leber mit getrennten Paare von Pinzetten und Scheren für Außen und innen zu sammeln die Maus. Legen Sie die Leber in eine 6 cm Petrischale auf Eis.
8. Schneiden Sie die Leber in kleine Würfel und in eine Glasflasche mit einem magnetischen Stir Bar. Fügen Sie 2 mL 2 mg/mL Kollagenase D in DMEM ohne FCS rekonstituiert. Inkubieren Sie Fläschchen bei 37 ° C auf einem Magnetrührer 30−45 min. Sobald das Gewebe homogenisiert ist, fügen Sie 3 mL DMEM/FCS, die Kollagenase zu inaktivieren.
9. Filtern Sie die Zellen durch ein Sieb 70 µm Zelle in eine konische Rohr, indem mehr DMEM/FCS, wenn nötig.
10. Zentrifugieren Sie Zellen bei 800 X g bei 4 ° C für 10 min pellet, überstand entfernen und Zelle Pellet in 500 µL des ACK-Puffer, in den Erythrozyten zu lysieren auszusetzen.
11. Inkubieren Sie Zellen bei Raumtemperatur für 5 min in Puffer ACK. Zellen in 1 mL DMEM/FCS auszusetzen.
12. Zentrifugieren Sie Zellen bei 800 X g bei 4 ° C für 10 min pellet, überstand entfernen und in 1 mL DMEM/FCS auszusetzen. Dann zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer oder einem automatisierten Zelle Zähler.
13. Übertragen Sie 1 x 10⁶ Zellen auf 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und Spin zu Pellets. Dann hängen Sie in 1 mL der DsH₂O und Wirbel um die Zellen zu lösen. Platte 50 µL auf LB-Platten bei unverdünnt und 10^-2 Verdünnungen und Inkubation bei 37 ° C Lm für KBE Analyse auflisten.
14. 1 x 10⁶ Zellen in FACS Rohre für jede Gewebeprobe nach der Zellzahlen und waschen mit 1 mL FACS-Puffer.
15. Zentrifugieren Sie Zellen bei 800 X g bei 4 ° C für 10 min pellet und überstand zu entfernen.
16. Bereiten Sie einen Antikörper-Cocktail, der Antikörper von Interesse, die anhand der empfohlenen Konzentration für jeden Antikörper und FACS Puffer enthält. Sehen Sie Tabelle der Materialien für die empfohlenen Mengen, die in der Analyse verwendeten.
17. Pellets in 100 µL Antikörper cocktail und inkubieren Sie Rohre im Dunkeln bei 4 ° C für 30 min.
18. Nach der Inkubation jedes Rohr 2 mL FACS Puffer hinzu und auszusetzen Sie Zellen.
19. Zentrifugieren Sie Zellen bei 800 X g Pellets bei 4 ° C und den Überstand verwerfen. Dann unterbrechen das Pellet in 400 µL FACS Puffer für den sofortigen Einsatz oder FACS Puffer 200 µL und 200 µL 4 % PFA wenn für später speichern.
20. Zellen durch Durchflusszytometrie zu analysieren (siehe Schritt 5.13).

Ergebnisse

Bewertung der Rolle von Erreger und Wirt-codierte Faktoren beeinflussen zellulären Infektion
Mit den oben beschriebenen Infektionsbedingungen, 0,15 % von der Eingabe Wildtyp Lm erholte sich nach 1,5 h Co Inkubation mit kultivierten Makrophagen (Abb. 1A). In der anschließenden 1,5 h Co Inkubation (3 h Post Infektion, Hpi) gab es ein 4-facher Anstieg bei der Beitreibung von lebensfähigen Lm und von 3 bis 6 ...

Diskussion

Aufgrund seiner schnellen und prozessualen zelluläre Infektion Programm ist Lm eine ideale Erreger, zelluläre Aktivitäten zu erforschen, die Infektion auswirken. Eine Reihe von Host Faktoren wurden identifiziert, die entweder positiv oder negativ Lm zelluläre Infektion^{11,12,13,14 beeinflussen}. Zwei solche host Faktoren gekennzeichnet, die in unserem Labor Perforin-2 und der Hä...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
ACK Lysing Puffer	Gibco
ArC-Amin-Reaktivkompensationsperlen	Life Technologies	A10346
BHI (Brain Heart Infusion) Bouillon	EMD Milipore	110493
Zellsieb, 70 & Mikro; m	VWR	10199-656
Kollagenase D	Roche	11088858001
DMEM Medien	Gibco	11965-092
FACS-Röhren	BD Falcon	352054
FBS - Hitzeinaktiviert	Sigma-Aldrich	F4135-500ML
Hanks' Balanced Salt Lösung	Sigma-Aldrich	H6648-6X500ML
LB Agar	Grow Cells MS	MBPE-4040
LIVE/DEAD Fixierbares gelbes Fleckenset für tote Zellen	Life Technologies	L349S9
Rhodamin Phalloidin	Thermo Fischer	R415
SP6800 Spektralanalysator	Sony
Spritze 28 G 1/2" 1cc	BD	329461
TPP Gewebekultur 48 Well Platten	MIDSCI	TP92048
	MIDSCI	TP92406
UltraComp eBeads	eBioscience	01-2222-42
Antigen
CD11b	Biolegend		Flurochrom = PE Cy5, Verdünnung = 1/100, Klon = M1/70
CD11c	Biolegend		Flurochrom = AF 647, Verdünnung = 1/100, Klon = N418
CD45	Biolegend		Flurochrom = APC Cy7, Verdünnung = 1/100, Klon = 30-F11
F4/80	Biolegend		Flurochrom = PE, Verdünnung = 1/100, Klon = BM8
Lebend/Tot	Invitrogen		Flurochrom = AmCyN, Verdünnung = 1/100
Ly6C	Biolegend		Flurochrom = PacBlue, Verdünnung = 1/200, Klon = HK1.4
MHC II	Biolegend		Flurochrom = AF 700, Verdünnung = 1/200, Klon = M5/114.15.2
NK 1.1	Biolegend		Flurochrom = BV 605, Verdünnung = 1/100, Klon = PK136