Hier präsentieren wir Ihnen eine Protokoll, die beschreibt allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation und ermöglicht sich wiederholenden Mini-endoskopische Auswertungen des distalen Colon an Ort und Stelle für die Präsenz, die Merkmale und die Schwere der Kolon Entzündung im live Mäuse Darm Graft - Versus - Host-Seuche leiden.
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Methodenartikel
Induktion der intestinalen Graft - Versus - Host-Seuche und seiner Mini-endoskopische Beurteilung in Live Mäuse
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Akute Graft - Versus - Host-Seuche (GvHD) stellt die schwersten Komplikation, dass Patienten, die zuvor allogene hämatopoetische Stammzell-Transplantation (allo-HCT) Gesicht und ist häufig mit einem schlechten klinischen Ergebnis verbunden. Weile, zum Beispiel GvHD Manifestationen der Haut sind in der Regel auf etablierten immun-unterdrückende Therapien und, daher nehmen keinen fatalen Kurs, das Vorhandensein und die Intensität der intestinalen GvHD, vor allem von der Mitte zum unteren Teile des Darms, Das Ergebnis stark beeinflussen und insgesamt Überlebenszeit von Patienten mit akuten GvHD. therapeutische Optionen sind im Wesentlichen beschränkt sich auf die klassischen immun-unterdrückende Agenten nur moderate Krankheit mildern Wirkungen nachgeben. Daher detaillierte Kenntnisse über die Gewebe-Resident immun Kaskade, Veränderungen in der intestinalen Mikrobiota, und die stromale Reaktion vor, nach und nach Darm GvHD auftreten sind dringend erforderlich, um die Ereignisse und die zugrunde liegenden Mechanismen zu verstehen sein Pathogenese und innovative Therapiemöglichkeiten zu entwickeln. Murine Modelle von GvHD werden häufig eingesetzt zur Feststellung und Beurteilung funktional Moleküle und wegen vermeintlich Darm GvHD fahren. Mittel, insbesondere Überwachung und Evaluierung der Darmentzündung im Laufe der Zeit im Wesentlichen fehlt aber da etablierten Resultate zu bewerten und benoten akuten GvHD routinemäßig verschiedener Parameter bestehen die eher systemische GvHD widerspiegeln Manifestationen. Die detaillierte Auswertung der intestinalen GvHD euthanasierten Mäusen, damit im wesentlichen ausgenommen longitudinale Studien eingeschränkt wurde (z.B. kinetische) Analysen von Kolon Fach unter einem bestimmten Versuchsbedingung (z. B. Antikörper-vermittelten Blockade von einem proinflammatorischen Zytokinen) in live Mäuse (in Vivo). Die Mini-endoskopische in-situ Beurteilung der distalen Dickdarm von allo-HCT-behandelten Mäusen, die hier beschriebenen ermöglicht (a) eine detaillierte makroskopische Auswertung der verschiedenen Aspekte der Darmentzündung und (b) die Möglichkeit, Gewebeproben für nachgelagerte Analysen zu sammeln verschiedenen Zeitpunkten im Verlauf des Beobachtungszeitraums. Insgesamt bietet der Mini-endoskopische Ansatz einen großen Fortschritt in präklinischen nichtinvasive Überwachung und Bewertung der intestinalen GvHD.
Einleitung
Hämatopoetischen Tumoren entstehen direkt aus dem Fach der hämatopoetischen Stammzellen und unkontrollierte, sind gehen zügig voran und schweren immunvermittelte Erkrankungen oft Indikationen allo-HCT1,2durchführen. Obwohl für das Auftreten der prognostische Vorteil Graft-versus-Tumor Reaktion Buchhaltung, sind Spender-Lymphozyten jedoch häufig induzieren und fördern einen unerwünschten immunvermittelte Angriff von gesundem Gewebe Komponenten innerhalb der allo-HCT-Empfänger , ein Prozess, der Graft - Versus - Host-Seuche3aufgerufen wird. Manifestationen im Darm, der so genannte intesti....
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Protokoll
Die hier beschriebenen experimentellen Methoden wurden von der Regierung von Mittelfranken, Bavaria, Germany genehmigt.
(1) GvHD Induktion
- Tag 0: Ganzkörper-Bestrahlung der Empfänger Mäuse
- Verwenden Sie weiblichen CD45.2+ H2kd+ BALB/c Mäuse, die mindestens 10 Wochen alt als Empfänger sind.
- Weigh und nimmt das Gewicht der Empfänger Mäuse vor GvHD Induktion.
Hinweis: Stellen Sie sicher, dass der Empfänger eine minimale Gewicht von 20 g. Die Einwaage Körper dient als Referenzwert, den Gewichtsverlust der einzelnen Maus im Laufe der GvHD Induktion und das ....
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Ergebnisse
Das aktuelle Protokoll beschreibt die Mini-endoskopische Bewertung der intestinalen GvHD-assoziierten Läsionen des distalen Colon wurde etabliert und validiert bei Mäusen, die vorher zur systemischen Induktion eines schweren akuten GvHD-Modells unterzogen. In dieser Studie verwendeten wir eine MHC-Klasse, die ich vollständig Modellsystem in welche BALB/c Mäuse letal bestrahlten übereinstimmende wurden, gefolgt von T-Zelle-abgereicherte Allogene Knochenmark-Transplantation und die Verwaltu.......
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Diskussion
Das Protokoll beschreibt die Methode der Induktion und Mini-endoskopische Beurteilung des Kolon Phänotyps im Zuge der intestinalen GvHD beobachtet. Es dient breiter ermöglichen Wissenschaftlern, Darm GvHD längs und nicht-invasiv über den gesamten Krankheitsverlauf (z.B. durch das Auftreten von Kolon Manifestation und Verlauf bis maximale Krankheitsaktivität) zu studieren.
Allerdings gibt es einige wichtige Schritte und wichtige Einschränkungen, die die vorgestellten Methoden muss der Experimen.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Diese Studie wurde unterstützt durch die Collaborative Research Center (CRC) 221 (CRC/TR221-DFG, #324392634, Projekt B03) (um K.H) und CRC 1181 (CRC-DFG Projekt B05) (um K.H), beide von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, Deutsche Forschungsgemeinschaft) finanziert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| BIOBEAM 2000 Gamma-Bestrahlungsgerät | Gamma-Service Meical GmbH | ||
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Sigma-Aldrich Co., LLC. | D8662-6x500ML | |
| Semken Pinzette (Länge: 13 cm; gezahnte, gebogene Spitzen) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Gehärtete Feinschere (Länge: 8,5 cm; gerade Spitzen; Schneide: 24 mm) | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich Co. LLC. | R8758-500ML | |
| Injektionsnadel (26 G) | B. Braun Melsungen AG | 4657683 | |
| 1 mL Spritze | B. Braun Melsungen AG | 9166017V | |
| 50 mL Tube | Sarstedt Ag & Co.KG | 62.547.254 | |
| Zellsieb mit einem 40 & Mikro; m Maschensieb | BD Falcon | 352340 | |
| Ammoniumchlorid (NH4Cl) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 11209 | Bestandteil des ACK-Lysingpuffers |
| Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalzdihydrat (Na2EDTA) | Carl Roth GmbH & Co.KG | 8043.2 | Bestandteil des ACK-Lysingpuffers |
| Kaliumbicarbonat (KHCO3) | Merck KGaA | 1.048.540.500 | Bestandteil des ACK-Lysingpuffers |
| CD90.2 Mikrobeads, Maus | Miltenyi Biotec GmbH | 130-049-101 | Magnetzelltrennung zur Isolierung von T-Zell-depletierten Knochenmarkzellen |
| Pan T Cell Isolation Kit II, Maus | Miltenyi Biotec GmbH | 130-095-130 | Magnetzelltrennung zur Isolierung von Milz-T-Zellen |
| Alexa Fluor 700 Anti-Maus CD45.2 Antikörper (Klon: 104; Los: B252126; RRID: AB_493731) | Biolegend | 109822 | |
| Pacific Blue Anti-Maus CD3 Antikörper (Klon: 17A2; Los: B227246; RRID: AB_493645) | Biolegend | 100214 | |
| FITC Anti-Maus CD4 Antikörper (Klon: GK1.5; Los: B225057; RRID: AB_312691) | Biolegend | 100406 | |
| PE/Cy7 Anti-Maus CD45.1 Antikörper (Klon: A20; Los: B217246; RRID: AB_1134168) | Biolegend | 110730 | |
| APC/Cy7 Anti-Maus CD8a Antikörper (Klon: 53-6.7, Los: B247008; RRID: AB_312753) | Biolegend | 100714 | |
| filtriertes Rinderserum | Pan Biotec | P40-47500 | Inhaltsstoff von FACS-Puffer |
| 96-Well-Polystyrol-V-Bodenplatten | Greiner Bio-One | 651201 | |
| Polystyrol-Rundbodenröhrchen (5 mL) | Falcon | 352052 | |
| BD LSRFortessa II Durchflusszytometer | BD Bioscience Co. | ||
| Insulinspritze mit sterilem Innenraum (30 G) | BD | 324826 | |
| Oxy Vet Oxymat 3 | Eickemeyer | Sauerstoffkonzentrator für die Anästhesie | |
| NarkoVet | Eickemeyer | 213062 | |
| Plexiglaskammer | Eickemeyer | 214620 | |
| Straight Forward Teleskop | KARL STORZ SE & Co KG | 64301 AA | Teil des Versuchsaufbaus für die Koloskopie |
| Schutz- und Untersuchungsschleuse | KARL STORZ SE & Co KG | 61029 C | Teil des Versuchsaufbaus für die Koloskopie |
| Untersuchungsschleuse mit Arbeitskanal | KARL STORZ SE & Co KG | 61029 D | Teil des Versuchsaufbaus für die Koloskopie |
| Biopsiezange | KARL STORZ SE & Co KG | 61071 ZJ | Teil des Versuchsaufbaus für die Koloskopie |
| 175 Watt SCB XenonLichtquelle | KARL STORZ SE & Co KG | 20132120 | Teil des Versuchsaufbaus für die Koloskopie |
| Faseroptisches Lichtkabel | KARL STORZ SE & Co KG | 495 NL | Teil des Versuchsaufbaus für die Koloskopie |
| Bild 1 S3 Kamerakopf | KARL STORZ SE & Co KG | 22220030 | Teil des Versuchsaufbaus für die Koloskopie |
| Bild 1 SCB Camera Control Unit | KARL STORZ SE & Co KG | 22200020 | Teil des Versuchsaufbaus für die Koloskopie |
| LCD-Monitor | Olympus | OEV181H | Teil des Versuchsaufbaus für die Koloskopie |
| Forane / Isofluran | AbbVie Inc. | B506 | |
| Formaldehydlösung 37 % | Carl Roth GmbH & Co.KG | 7398.1 | |
| 5,0 mL Spender-Tipp | Eppendorf AG | 30089456 |
Referenzen
- Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P., Holler, E. Graft-versus-host disease. The Lancet. 373, 1550-1561 (2009).
- Magenau, J., Runaas, L., Reddy, P. Advances in understanding the pathogenesis of graft-versus-host disease. British Journal of Haematology. 173, 190-205 (2016).....
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Nachdrucke und Genehmigungen
