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Methodenartikel

Bewertung der Wirt-Pathogen-Antworten und Wirksamkeit des Impfstoffes bei Mäusen

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DOI:

10.3791/58930

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22. Februar 2019

 ,  ,  , 
1Department of Microbial Infection & Immunity, The Ohio State University, 2Department of Microbiology, The Ohio State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir eine elegante Protokoll für in Vivo Evaluierung der Impfstoff Wirksamkeit und Host Immunantworten. Dieses Protokoll kann für Impfstoff-Modelle, die studieren, virale, bakterielle oder parasitäre Erreger angepasst werden.

Zusammenfassung

Impfstoffe sind ein 20th Jahrhundert medizinische Wunder. Sie haben drastisch reduziert die Morbidität und Mortalität durch Infektionskrankheiten verursacht und trugen zu einem markanten Anstieg der Lebenserwartung rund um den Globus. Bestimmung der Impfstoffwirksamkeit bleibt jedoch eine Herausforderung. Anzeichen dafür deutet darauf hin, dass die aktuelle azelluläre Impfstoff (aPV) für Bordetella Pertussis (B. Pertussis) suboptimal Immunität induziert. Daher ist eine große Herausforderung einen nächsten Generation Impfstoff entwerfen, der schützende Immunität ohne die negativen Nebenwirkungen von einer ganzen Zelle Impfstoff (wPV) induziert. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das wir verwendet, um die Wirksamkeit von vielversprechenden, neuartigen Adjuvans zu testen, die verzerrt Immunantworten auf einen schützenden Th1/Th17-Phänotyp und fördert eine bessere Clearance von B. Pertussis Herausforderung aus murinen Atemwege. Dieser Artikel beschreibt das Protokoll für Maus-Immunisierung, bakterielle Inokulation, Gewebe zu ernten und Analyse von Immunreaktionen. Mit dieser Methode, innerhalb unseres Modells haben wir entscheidende Mechanismen ausgelöst durch eine vielversprechende, nächste Generation azellulären Pertussis-Impfstoff erfolgreich aufgeklärt. Diese Methode kann auf jede Infektionskrankheit Modell angewendet werden, um Impfstoffwirksamkeit zu bestimmen.

Einleitung

Impfstoffe sind eines der größten öffentlichen Gesundheit Errungenschaften des 20. Jahrhunderts, doch wir immer noch nicht vollständig verstehen die Mechanismen, durch die erfolgreiche Impfstoffe schützende Immunität anregen. Die Identifizierung von molekularen Signaturen (zB., Zelle Aktivierungsmarker, Erweiterung der zellulären Subtypen und Muster der Genexpression) induziert nach der Impfung bietet eine Fülle von Informationen für die Vorhersage und erzeugen eine wirksame Immunantwort. Die Komplexität der Wirt-Pathogen-Antworten kann nicht angemessen mit in-vitro- Zelle Kultur Systeme1repliziert werden. In Vivo Impfstoff Modelle sind entworfen, um damit auch mehrere Immunzelle Arten innerhalb des Hosts zu bewerten. Dies bietet einen Vorteil, wenn Impfstoff Antigen Verarbeitung und Präsentation, differenzielle Zytokin-Sekretion und Ausbau der Immunzellen zu charakterisieren. Das hier beschriebene Protokoll sieht eine detaillierte Methode zum Bestimmen der Impfstoffwirksamkeit durch Auswertung der systemische und lokale Immunantwort und Quantifizierung der Erreger Belastung in Geweben von Interesse. Das hier angegebene Beispiel testet die Wirksamkeit von einer experimentellen Impfstoff gegen den Erreger Bordetella Pertussis (B. Pertussis).

B. Pertussis ist ein gramnegatives Bakterium, das die ätiologische Agent der Erkrankung der Atemwege Husten Keuchhusten (Pertussis)2,3ist. Engen Kontakt mit infizierten Personen (symptomatisch oder asymptomatisch) führt zur Übertragung, Kolonisierung und Krankheit. Trotz erheblichen globalen Impfstoff Abdeckung4Keuchhusten gilt eine aufrappelte Krankheit in vielen Ländern auf der ganzen Welt und ist die Hauptursache für vermeidbare Kindheit Todesfälle5,6,7, 8. 2015, B. Pertussis und der Pertussis wurden in das National Institute of Allergy und infectious Diseases (NIAID) emerging Pathogen/Infektionskrankheiten Liste, unter Betonung der Notwendigkeit für die Entwicklung besserer Impfstoffe zur Verfügung stehen, das verleiht langlebige schützende Immunität.

Derzeit ist ein aktives Gebiet der Untersuchung, Pertussis Wiederaufleben Steuern Entwicklung von einer nächsten Generation azellulären Pertussis-Impfstoff (aPV) mit einer optimalen Kombination von neuartige Adjuvantien und Antigenen, die Immunantwort ausgelöst durch die ganze Zelle zu imitieren Pertussis-Impfstoff (wPV)9. Mit dem Protokoll beschrieben, berichtet wir kürzlich, dass die Änderung von einer aktuellen FDA-zugelassene aPV durch die Zugabe von ein neuartiges Adjuvans Bordetella Kolonisation Faktor A (BcfA), führte eine effizientere Reduzierung von B. Pertussis Keimbelastung von Maus Lunge10,11. Diese erhöhte Schutz wurde durch die Schiefstellung einer Alaun-induzierte Th1/Th2-Immunantwort, die schonender Th1/Th17 immun Profil10begleitet. Dieses Protokoll ist detailliert und umfassend, die Ermittler maximale Informationen durch gleichzeitige Auswertung von Host und immunen Antworten zu einer Vielzahl von Krankheitserregern zu ermöglichen.

Das hier beschriebene Protokoll folgt der repräsentativen Impfstoff Zeitplan, in Abbildung 1gezeigt, um optimale Host Immunantworten zu gewährleisten.

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Protokoll

Alle Experimente mit lebenden Tieren wurden nach ein Protokoll genehmigt von der Ohio State University IACUC nach IACUC-Richtlinien durchgeführt. C57BL/6 Mäusen wurden in alle Impfungen und Infektionen eingesetzt. Sowohl weibliche als auch männliche Mäuse sind in jeder Gruppe nach NIH-Richtlinien verwendet. Die Anzahl der Tiere pro Gruppe wurde durch macht Berechnungen auf Grundlage der prognostizierten unterschiedlichen Ausgang unter experimentellen Gruppen bestimmt. Beispielsweise ergibt 8 Mäuse pro Gruppe 80 % Leistung bei α = 0,05 (2-seitig) für einen 2-Sample t- Test, um zu erkennen, Unterschiede in den Ergebnissen des Interesses von 1,33 Standardabweichungen (SDs).

(1) Immunisierung von Mäusen

  1. Bereiten Sie eine master-Impfstoff-Mischung in eine sterile physiologische Puffer wie Kochsalzlösung oder DPS.
    Hinweis: Das Gesamtvolumen in der Mischung sollte 10 % umfassen mehr als erforderlich, die für die Immunisierung der gesamten Gruppe. Konzentrationen der Impfstoff Zusammensetzung sind Sie unten in den Schritten 1.1.1 und 1.1.2. Transportieren Sie die Elemente, die das Vivarium auf Eis.
    1. Für B. Pertussis Studien umfassen die folgenden Impfstoff-Gruppen: aPV und aPV + BcfA. Darüber hinaus verwenden Sie Alaun, Impfstoff Antigene allein (FHA und Prn) und naiv (geimpft) Mäuse als Kontrollgruppen.
      Hinweis: aPV ist 1/5th die menschliche Dosis von einer FDA-zugelassene aPV, das Tetanus-Toxoid, reduzierte Diphtherie-Toxoid, Pertussis Toxoid (PT), filamentöses Hämagglutinin (FHA) und Pertactin besteht (Prn) adsorbiert, Aluminiumsalze. Eine menschliche Dosis von aktuellen Keuchhusten aPV ist 0,5 mL, 1/5th einer Dosis deshalb 0,1 mL. Volumen für aPV + BcfA sind 0,1 mL des aPV (1/5th die menschliche Dosis) + 0,046 mL BcfA (30 µg) per Mausklick. Die maximale Lautstärke, die sicher an einem Muskel geliefert werden kann beträgt 0,1 mL. Weil der aPV + BcfA Impfstoff Volumen größer als 0,1 mL, der Impfstoff muss in beiden Schultern, ebenso grob einteilen, um sicher verabreicht werden geliefert werden.
    2. Um einen experimentellen Impfstoff vorzubereiten, für eine Dosis kombinieren Sie 1 µg der FHA und 0,5 µg Prn mit 50 µg von Aluminium-Hydroxid-Gel in sterilen PBS. Lassen Sie die experimentelle aPV auf einem Labor-Walze für 15 min bei Raumtemperatur (RT) mischen. Danach drehen Sie das Rohr auf 18.000 x g für 5 min bei 4 ° c Entfernen des Überstands und Aufschwemmen der Inhalt in 1 mL sterile PBS.
  2. Das Vivarium gegründet Anästhesiegerät (Abbildung 2).
    Hinweis: Sicherstellen Sie, dass ausreichende Mengen an Sauerstoff und Isofluran in ihren jeweiligen Tanks vor Gebrauch. Wiegen Sie den Isofluran-Scavenger-Kanister und ersetzen Sie, wenn das Gewicht von 50 g erhöht.
  3. Gründlich reinigen Sie der biologischen Sicherheitsschrank (BSC) und legen Sie die sauberen Induktion Kammer im Inneren des BSC. Verbinden Sie die Anästhesie und Schnitzeljagden Linien von der Anästhesiemaschine zur Induktion Kammer. Offen der Sauerstoff-Tank über den Regler um Sauerstoff zu gewährleisten, fließt und stellen Sie den Pegel auf 1,5-2 L/min.
  4. Legen Sie Mäuse gewünschtes Alter (6-12 Wochen) in der Induktion-Kammer. Schalten Sie Isofluran auf 2,5-3 % um die Mäuse leicht zu betäuben. Überwachen Sie die Tiere, bis sie nicht sich in der Kammer bewegen und ihre Atmung hat sich verlangsamt.
  5. Testen Sie die Induktion durch Zeh kneifen, für jede reflexive Bewegung beobachten. Wenn es keines gibt, sind die Mäuse für die Injektion bereit.
    Hinweis: In diesem Experiment der ganze Käfig Tiere wurden betäubt auf einmal. Man kann wählen, um Tiere einzeln für die Injektion zu betäuben oder die Tiere ohne Betäubung zu injizieren. Eine der folgenden Methoden eignet.
  6. Unterdessen bereiten Sie 1 mL Insulinspritzen (28 1/2) mit 0,1 mL Impfstoff jedes. Wenn Tiere voll induziert werden, ein Tier aus der Kammer zu entfernen und die Maus ventral auf ein Handtuch oder Bank Pad legen.
  7. Verabreichen Sie den Impfstoff intramuskulär. Mit der Spritze in einem 45°-Winkel mit der Fase nach oben legen Sie die Spritze ~ 5 mm in den Deltamuskel der Maus und injizieren Sie den Impfstoff zu.
    Hinweis: Die hinteren Viertel/Flanke als eine Injektionsstelle anstelle der Deltamuskel verwendet werden.
  8. Halten Sie nach der Injektion die Nadel in den Muskel für ca. 5-10 s. Sobald das Volumen geliefert wird, drehen Sie die Spritze um 180°, sodass Abschrägung entfernt steht, um eine Dichtung zu schaffen und zu verhindern das Austreten des Impfstoffs. Ziehen Sie dann langsam die Nadel aus der Injektionsstelle.
  9. Die Maus in den Käfig zurück. Wiederholen Sie den Vorgang mit allen Tieren in der angegebenen Gruppe.
  10. Schalten Sie die Isoflurane und spülen Sie die Induktion-Kammer mit Sauerstoff vor den nächsten Käfig von Mäusen zu betäuben.
  11. Überwachen Sie die Tiere, bis sie alle Warnungen und beweglichen im Käfig sind. Den Käfig an der Gehäuse-Position zurück.
  12. Monitor Tiere alle 12 h nach der Impfung, bis zu 48 h für die klinischen Symptome der Morbidität wie rau/ungepflegten Mantel langsam Gang oder Atmung gearbeitet. Wenn Symptome fortbestehen, beraten Sie sich mit der institutionellen Tierarzt und entfernen Sie die Mäuse aus der Studie zu, wenn nötig.
  13. Steigern Sie vier Wochen nach der ersten Impfung Mäuse durch betäuben und Verwaltung intramuskuläre Injektionen in die richtigen Deltamuskel der Maus mit der gleichen Impfstoff Formulierung, die zuvor gegeben wurde.
  14. Wieder, Monitor Tier keine klinischen Symptome. Haus Tiere für weitere 2 Wochen und dann mit einer Infektion.

2. Wachstum von B. Pertussis Stämmen und Vorbereitung der Infektion Inokulum

  1. Aus gefrorenen Beständen [kryokonserviert bei-80 ° C in 15 % Glycerin, gefroren von planktonischen Zunahme Stainer-Scholte (SS) Medien12] Streifen, B. Pertussis auf Agarplatten13 Bordet-Gengou (BG) mit 10 % Defibrinated Schafe ergänzt Blut und 100 µg/mL Streptomycin (10 % BG + Sm) zur Auswahl. 4 Tage inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C.
  2. Nehmen Sie ~ 8-10 einzelnen Kolonien von der Angabe von der Platte und impfen Sie 3 mL SS Medien mit 22,8 mM L-Cystein, 3,6 mM Eisensulfat, 3,3 mM Niacin, 48,8 mM Glutathion, 227 mM Ascorbinsäure, 1 mg/mL Heptakis und 100 µg/mL Streptomycin ergänzt. Wachsen Sie die Kultur bei 37 ° C in einer Bandage bei 60 u/min für 16-24 h.
  3. Am nächsten Tag, verdünnen die Primärkultur 1:600, 1: 300, 1: 120, 1: 60, 01:30 und 01:15 in 3 mL ergänzt SS-Medien. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 ° C in Bandage bei 60 u/min für 16-24 h.
  4. Messungen der Extinktion bei 600 nm (OD600) für die Bakterienkulturen. Verdünnen Sie verwenden Spektrofotometer Küvetten, die Kulturen 01:10 durch Zugabe von 0,1 mL der flüssigen Kulturen auf 0,9 mL sterile PBS.
  5. Wählen Sie eine Kultur mit OD600≈ 0,8-1,2. Berechnen Sie das Volumen erforderlich, um 1 OD (Abbildung 3). Drehen Sie die Lautstärke in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch bei 6000 X g für 5 min bei 25 ° C. Den Überstand abgesaugt und Aufschwemmen Bakterienzelle Pellet in 1 mL sterile PBS, eine Dichte von 1 OD/mL zu erhalten [1-3 x 109 Koloniebildenden Einheiten (KBE) /mL].
  6. Zur Vorbereitung einer Inokulum von ~ 5 x 105 bis 1,5 x 106 KBE/Maus in 40-50 µL, Wirbel und verdünnen Sie die bakterielle Lösung (aus Schritt 2.5) seriell 100fach in 1 mL sterile PBS, ~ 1-3 x 107 KBE/mL (Abb. 4A) zu erreichen. Transportieren Sie das Inokulum, das Vivarium auf Eis.

(3) murinen intranasale Infektionsmodell

  1. Festlegen Sie im Vivarium Sauerstoff und Anästhesie Bedingungen wie 1.3 und 1.4 beschrieben. Wie in Schritt 1.5 beschrieben, setzen Sie die Mäuse in der Kammer zu betäuben. Die Tiere zu überwachen, bis die Betäubung wirksam wird.
  2. Wenn die Mäuse betäubt sind, entfernen Sie ein Tier zu einem Zeitpunkt aus der Induktion Kammer. Heben Sie die Maus durch das Genick des dorsalen Thorax, hinter den Schulterblättern und Hals. Positionieren Sie die Maus aufrecht um die Nase zu gelangen.
  3. Mit einer 200 µL Pipettenspitze, langsam zuweisen Sie 40-50 µL bakterielle Inokulum die Nasenlöcher der Maus (20-25 µL in jeder Nare). Halten Sie die Maus, bis das gesamte Inokulum durch das Tier eingeatmet worden ist. Wenn einige das Inokulum Blasen heraus, die Bläschen zu sammeln und wieder in die Nasenlöcher zu vermitteln. Liefern Sie eine gleiche Menge von sterilen PBS zu einer Gruppe von Mäusen als Negativkontrolle.
  4. Wie in Schritten 1.10-1.12, die geimpften Tiere in ihren Käfig zurück und die Tiere zu überwachen, bis sie wach und bewegt werden. Den Käfig zurück zu seiner ursprünglichen Wohnraum auf dem Gestell zurück. Spülen Sie die Induktion-Kammer mit Sauerstoff, um die verbleibende Isofluran entfernen, bevor Sie betäuben den nächsten Satz von Tieren. Beobachten Sie die Tiere für 48 Stunden nach der Infektion.
  5. Im Labor Platte Verdünnungsreihen des Inokulums in sterilen PBS, um die tatsächliche KBE geliefert um die Mäuse zu überprüfen. Platte 0,1 mL Verdünnungen auf 10 % BG + Sm Platten (Abb. 4A). Legen Sie die Platten im Inkubator 37 ° C und für 4 Tage wachsen. Zählen Sie und rechnen Sie die KBE aus das Inokulum an der Maus (Abbildung 4B) geliefert.

4. Ernte von tierischem Gewebe nach der Infektion

  1. Maus-Dissektion und Gewebe Ernte vorbereiten.
    1. Alle Werkzeuge (grob- und Scheren, gebogene Schere, feine Pinzette, Pellet Stößel und Dreieck Streuer) benötigt für die Verarbeitung von Gewebe im Autoklav zu sterilisieren. Verschließen Sie die Werkzeuge in Sterilisation Beutel. Wickeln Sie die Glas-Dounce-Homogenisatoren in Folie und fügen Sie Autoklaven Band um Sterilität anzugeben.
    2. Bereiten Sie Agar-Platten 1 oder 2 Tage vor der Ernte Gewebe, um sicherzustellen, dass die Platten sind erstarrte vor dem Gebrauch vor. Verwenden Sie für B. Pertussis 10 % BG + Körperlänge Label Platten für die Nasenscheidewand, Luftröhre und Lunge für jede Maus mit der gewünschten Verdünnungen, empirisch ermittelt für jedes Experiment.
    3. Füllen Sie und beschriften Sie KBE Verdünnung Röhren. Fügen Sie 0,9 mL sterile PBS, sterile 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen basierend auf Zahl der Organe zu verarbeiten und Verdünnungen pro Organ.
    4. Füllen Sie und beschriften Sie Rohre für Gewebe-Sammlung:
      1. Nasenscheidewand und Luftröhre: füllen Sie einen sterilen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit 0,3 mL steril 1 % Kasein mit PBS-Puffer (Ca2 + und Mg2 +-frei). Shop bei 4 ° C.
      2. Lunge: Fügen Sie 2 mL steril 1 % Kasein in PBS eine sterile 15 mL konische Rohr und speichern bei 4 ° C hinzu. Lungen für Histologie ernten, 2 mL 10 % neutral gepuffertem Formalin (NBF) hinzufügen und speichern bei RT
      3. Milz: Fügen Sie 3 mL RPMI + 5 % FBS eine 15 mL konische Röhrchen. Shop bei 4 ° C.
      4. Blut: beschriften Sie zwei Sätze sterile 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen für Vollblut und Serum.
    5. Frische 70 % igem Ethanol sollte bereit sein, füllen Becher und Flaschen für Dissektion sprühen.
  2. Transportieren Sie alle Materialien für das Vivarium auf einem Wagen am Tag der Ernte. Reinigen der BSC und Einrichten der Anästhesiemaschine wie in den Schritten 1.3 und 1.4.
  3. Legen Sie die Mäuse werden in der Induktion Kammer seziert und mit Sauerstoff fließt, schalten Sie die Isofluran auf 5 % und warten Sie, bis die Tiere bewusstlos sind. Entfernen von Mäusen eine zu einem Zeitpunkt, und Zervikal verrücken das Tier als eine sekundäre Methode, um Tod zu gewährleisten. Nach zervikale Dislokation sollte Sterbehilfe durch das Fehlen einer Atemfrequenz und/oder fehlender Rückzug Reflex (Zehe Kneiftest) bestätigt werden.
  4. Positionieren Sie die Maus, die Bauchseite nach oben, auf dem Brett Dissektion und stecken Sie die Arme und Beine geöffnet. Sprühen Sie den Körper der Maus mit 70 % Ethanol.
  5. Mit Pinzette, Verschluss der Haut unter dem Bauch, in der Mitte des Beckens. Mit einer scharfen Schere, machen Sie einen vertikalen Schnitt bis zu den Unterkiefer. Dann die Haut von der peritonealen Wand durch auseinanderdrücken der zwei Schichten zu sezieren, mit kleinen Bewegungen mit der Schere geschlossen. Legen Sie die Haut an den Seiten der Karkasse, eine freie Feld für sterile Orgel Ernte zu erstellen.
  6. Fassen Sie das intakte Bauchfell unterhalb des Brustkorbs auf oder um die Leber und Aufschneiden in Richtung des Brustkorbs. Setzen Sie den unteren Verdauungstrakt und bewegen Sie den Doppelpunkt enthüllt die Milz links. Mit gebogenen Pinzette, greifen Sie die Milz und entfernt sezieren Sie das Bindegewebe mit einer Schere zu. Ort der Milz in eine 15 mL konische Röhrchen mit 3 mL RPMI + 5 % FBS und Ort das Rohr auf dem Eis.
  7. Verwenden Sie Zange um den Brustkorb am Xiphoid Prozeß zu stabilisieren und das Zwerchfell aufgeschnitten. Lungen sollten entleeren und fallen in Richtung der Wirbelsäule. Schneiden Sie den Brustkorb an den Seiten, die Brustplatte zu entfernen.
  8. Isolieren und Entfernen des überlegenen Lappens der rechten Lunge14, schneiden die pulmonalen Arterien und Venen. Legen Sie den Lappen in eine 15 mL konische Röhrchen mit 10 % NBF und Ort der Röhre bei RT für mindestens 24 h um das Gewebe zu beheben. Isolieren Sie die verbleibenden Lappen der rechten Lunge und der linken Lunge. Lappen in eine 15 mL konische Röhrchen mit 2 mL 1 % Kasein mit PBS-Puffer und legen Sie ihn auf Eis.
  9. Nach dem Schneiden der Lungenvenen und Arterien, die Lunge zu zergliedern, erlauben Sie die Brusthöhle mit Blut zu füllen, da die Maus exsanguinates. Mit einer 1 mL Pipetman mit Spitze, sammeln Sie das Blut und in den bereits beschrifteten 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch übertragen. Platzieren Sie das Rohr auf dem Eis.
  10. Dann vom Hals, entfernen Sie das Weichgewebe (Parotis, sublinguale und Submaxillardrüsen Drüsen und Lymphknoten), das die Luftröhre abdeckt. Öffnen Sie und entfernen Sie die Schutzhäuten, die rund um die Luftröhre. Zart, mit feinen Pinzetten und Scheren, trennen Sie die Luftröhre von Speiseröhre und jede andere Bindegewebe von oben auf das Schlüsselbein nach unten des Unterkiefers.
  11. Mit Pinzette, halten Sie sich an der Luftröhre und schneiden Sie die Luftröhre am oberen Rand des Schlüsselbeins. Herunterziehen der Luftröhre zu maximieren Elastizität und die Luftröhre an der Unterseite des Unterkiefers rechts oberhalb des Kehlkopfes, so weit wie möglich zu isolieren (~ 1 cm) schneiden. Die Orgel in einen bereits beschriftete 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit 0,3 mL 1 % Kasein mit PBS-Puffer und auf Eis legen.
  12. Lösen Sie die Maus und ventral, mit der Maus vor der Forscher für freien Zugang auf die Nase legen. Sprühen Sie den Kopf der Maus mit 70 % Ethanol und mit Händen greifen Sie die Maus direkt hinter dem Schädel.
  13. Mit Schere, Schnitt entfernt weiches Fleisch des Mauls, ausgehend von der Unterseite der Nase und Bewegung nach oben. Darüber hinaus entfernen Sie das Fell, Haut und Barthaare um die Nase. Dann, mit Zange und gebogene Schere, stecken Sie die Spitzen Schere Nares mit den Kurven nach außen zeigte, und aufschneiden den Nasengang auf die Augen, a V-wie Anordnung zu schaffen.
  14. Mit feinen Pinzette, sammeln Sie die Nasenscheidewand und weiches Gewebe innerhalb der erstellten Formation. Legen Sie das Gewebe in einem Pre-beschrifteten 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit 0,3 mL 1 % Kasein mit PBS-Puffer und auf Eis legen.
  15. Entsorgen Sie den Kadaver in einer Biohazard-Tasche. Spülen Sie bevor das nächste Tier sezieren die Werkzeuge mit entionisiertem Wasser, und legen Sie dann in einen Becher gefüllt mit 70 % Ethanol. Entfernen Sie die Werkzeuge, überschüssige Ethanol abzuschütteln Sie, und fahren Sie dann mit der nächsten Dissektion
  16. Jede Maus, die folgenden Schritte 4.3-4.14 zu sezieren.
  17. Verarbeiten Sie das Gewebe, wie unten beschrieben.

(5) die Verarbeitung der Milz

  1. Um die Milz zu distanzieren, legen Sie ein 70 µm Zelle Sieb in der Kulturschale 60 mm Gewebe. Gießen Sie die Milz und die zugehörigen Medien in den Filter mit den Kolben der Spritze 3 mL. Pürieren Sie sorgfältig die Orgel bis es vollständig dissoziiert und durch Zelle Sieb gefiltert.
  2. Spülen Sie den Filter mit 3 mL RPMI + 5 % FBS in der Kulturschale Gewebe. Sammeln Sie die Zellsuspension und legen Sie sie in ihrer ursprünglichen 15 mL-Tube. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 450 X g für 5 min bei 4 ° C zu die Zellen zu Pellets.
  3. Aspirieren oder den Überstand abgießen und lyse der roten Blutkörperchen durch das Pellet in 2 mL Ammoniumchlorid Kalium (ACK) Puffer (Ammoniumchlorid 150 mM, 10 mM Kaliumbicarbonat, 0,1 mM Natrium EDTA) resuspending. 3 min bei RT (25 ° C) inkubieren.
  4. Füllen Sie die Rohre bis zu 8 mL RPMI + 5 % FBS und Zentrifuge Röhren 450 X g für 5 min bei 4° C. Aspirieren oder den Überstand abgießen. Aufschwemmen der Zelle Pellets in 5 mL RPMI + 5 % FBS und zählen die Splenocyten mit einem Hemocytometer und einem Mikroskop.
  5. Berechnen Sie das Volumen der Zellen benötigt, 2,5 x 106 Zellen pro Bohrloch zu stimulieren. Samen Sie in einem 48-Well-Platte Zellen in 0,5 mL der T-Zell-Medien (RPMI 1640 + 10 % FBS 10 µg/mL Gentamicin und 50 µM β-Mercaptoethanol) pro Bohrloch.
  6. Basierend auf der obigen Berechnung, legen Sie die erforderliche Menge der Zellsuspension in ein frisches Tubus und Pellet-Zellen bei 450 X g für 5 min bei 4 ° C.
  7. Das Pellet in das erforderliche Volumen der T-Zell-Medien aufzuwirbeln. Für ein B. Pertussis -Infektion-Modell testen die Antigen-spezifische Zytokin-Antwort auf Impfstoff Antigene: Pertactin (Prn) und filamentöses Hämagglutinin Adhäsion (FHA). Daher sind 3 Behandlungen erforderlich: (1) keine Stimulation (NS, als Negativkontrolle), Prn (2) und (3) FHA. Für den Assay beträgt 7,5 x 106 Zellen in 1,5 mL T-Zell-Medien erforderlich (2,5 x 106 Zellen je 0,5 mL).
  8. Aliquoten 0,5 mL Zellsuspension in einem 48-Well-Platte.
  9. Um Zellen zu stimulieren, mischen Sie Antigene auf 2 Mal die gewünschte Konzentration in T-Zell-Medien. Endkonzentrationen Prn und FHA = 1 µg/mL und 0,5 µg/mL, beziehungsweise. Daher mischen Sie 2 µg/mL Prn oder 1 µg/mL FHA in 0,5 mL. Dann, aliquoten 0,5 mL des Mediums Stimulation in jeder bestimmt gut, verdünnen die Antigen-Behandlung auf 1 X in einem Endvolumen von 1 mL in jede Vertiefung.
  10. Inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C in 5 % CO2. Sammeln Sie Überstände am 7. Tag und aliquoten 0,5 mL der Überstände in bereits beschriftete Mikrozentrifugenröhrchen. Speichern Sie die Proben in einem-20 ° C bis bereit zu testen, Antigen-spezifische Zytokine durch ELISA (Abbildung 6).

6. Verarbeitung der Lunge

  1. Übertragen Sie die Lunge (in 2 mL 1 % Kasein mit PBS-Puffer) in eine sterile, 15 mL Dounce-Homogenisator. Verwendung Stößel zu Gewebe zu homogenisieren. Distanzieren Sie, bis keine große Partikel des Gewebes bleiben. Legen Sie die homogenisierte Suspension wieder in der ursprünglichen 15 mL Tube.
  2. Entfernen einer 0,3 mL aliquoten für Galvanik KBE und Zentrifugieren Homogenat 450 X g für 5 min bei 4 ° C. Sammeln und aliquoten Röhren der Überstand in 0,5 mL Aliquots in bereits beschriftete Microcentrifuge. Speichern Sie die Proben in einem-20 ° C bis zur Analyse von Zytokinen durch ELISA.
  3. Bereiten Sie gewählte Verdünnungen durch Verdünnen seriell 0,1 mL der Suspension homogenisierte Lunge in Verdünnung Röhren (0,9 mL sterile PBS vor). Platte 0,1 mL empirisch gewählte Verdünnungen auf bereits beschriftete 10 % BG + Sm-Platten und Ausbreitung mit sterilen Dreieck Streuer.
  4. 4 Tage inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C in Raumluft.
  5. Zählen Sie und rechnen Sie KBE/Lunge (Abbildung 6). Kurz, multiplizieren Sie wiederhergestellten KBE Zahlen durch den Verdünnungsfaktor der Platte, dann auch durch das Gesamtvolumen, in dem die Orgel verarbeitet wurde. Die KBE-Berechnungen sind dann Log10 -Werte für jedes Tier verwandelt und grafisch dargestellt.
    1. Platten mit 30-300 Kolonien sind leicht und genau gezählt. Platten mit weniger als 6 Kolonien sollte nicht für Berechnungen verwendet werden, da solche niedrigen Kolonie Zahlen Fehler15einzuführen. Um eine Untergrenze der Erkennung zu erhalten, ist das Gesamtvolumen, in denen ein Organ homogenisiert wurde, dividiert durch das Volumen, die verwendet, um vor Ort auf einen Teller aus dem unverdünnten Homogenat (zB., 2 mL Gesamtvolumen geteilt durch 0,1 mL der unverdünnten Homogenat entspricht die untere Grenze des 20 KbE nachweisbar).

7. Verarbeitung der Nasenscheidewand und der Trachea

  1. Homogenisieren des Gewebes in der 0,3 mL von 1 % PBS/Kasein mit Pellet zerstoßen schnurlose motor Homogenisatoren. Homogenisieren des Gewebes für 0,5-1 min bis das Gewebe weitgehend getrennt ist. Bakterien sollten in die Suspension vergossen werden.
  2. Vorbereiten der gewählten 10 x Verdünnungen durch serielle Verdünnung von 0,1 mL der homogenisierte Suspension in Verdünnungen Röhrchen mit 0,9 mL sterile PBS. Dot 0,1 mL jeder Verdünnung auf beschriftet vorab 10 % BG + Sm-Platten und verbreiten die Suspension mit einem Dreieck-Spreader, die mit 70 % igem Ethanol waschen und Flamme sterilisiert worden.
  3. 4 Tage inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C in Raumluft.
  4. Zählen Sie und rechnen Sie KBE/Orgel wie in Schritt 6.5 (Abbildung 6). Um eine Untergrenze der Erkennung zu erhalten, ist das Gesamtvolumen, in denen ein Organ homogenisiert wurde, dividiert durch das Volumen, die verwendet Punkt auf einer Platte aus dem unverdünnten Homogenat (zB., 0,3 mL Gesamtvolumen geteilt durch 0,1 mL der unverdünnten entspricht der untere Grenzwert der 3 KBE Detecta BLE).

8. Verarbeitung von Blut

  1. Zentrifugieren Sie die Röhrchen mit isolierten Vollblut bei 18.000 x g für 30 min bei 4 ° C zu roten Blutkörperchen Pellets.
  2. Das Serum überstand und Pipettieren zu einem bereits beschriftete Serum Microcentrifuge Schlauch vorsichtig abnehmen. Speichern Sie die Rohre bei-20 ° C bis bereit für weitere nachgelagerte Analyse (i.e., total und spezifische Ig ELISA).

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Ergebnisse

Das Modell beschrieben zeigt eine Methode zur Bewertung von Impfstoff Effizienz und Immunreaktionen während Wirt-Pathogen Interaktionen. Abbildung 1 zeigt die repräsentative Impfstoff Zeitplan zu immunisieren und Mäuse zu infizieren und zu ernten Gewebe für die Analyse verwendet. Abbildung 2 zeigt das Setup des Systems, Anästhesie, Mäuse, induzieren Ermittler Impfungen und bakterielle Befallsdruck zu ermöglichen.

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Diskussion

Das umfassende Protokoll hier beschriebenen um Impfstoff induzierte Immunität gegen B. Pertussis -Infektion zu studieren wird auch Bewertung der Host Antworten auf eine Vielzahl von anderen Krankheitserregern ermöglichen. Das Protokoll beschreibt Methoden liefern Impfungen, bestimmen Impfstoff Wirksamkeit folgende Erreger Herausforderung und parallele Dissektion der Immunfunktion. Bei der Anpassung des Protokolls um andere Krankheitserreger zu studieren, müssten mehrere Parameter geändert werden. Diese beinhalte...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von 1R01AI125560-01 und Start-up-Fonds von der Ohio State University unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2L InduktionskammerVet Equip941444
FlurisoVet OneV1 501017jede Marke ist geeignet
Bordet Gengou Agar BaseBD bioscience248200
CaseinSigmaC-7078
CasaminosäurenVWRJ851-500GSieb Scholte (SS) Medienkomponenten
L-GlutaminsäureForschungsprodukte IntG36020-500
L-ProlinForschungsprodukte IntP50200-500
NatriumchloridFisherBP358-10
Kaliumphosphat einbasischFisherBP362-1
KaliumchloridFisherP217-500
Magnesiumchlorid-HexahydratFisherM2670-500G
CalciumchloridFisherC75-500
Tris-BaseFisherBP153-1
L-Cystein HClFisherBP376-100SS Medienergänzungen
Eisensulfat-HeptahydratSigmaF-7002
NiacinResearch Products IntN20080-100
GlutathionForschungsprodukte IntG22010-25
AscorbinsäureForschungsprodukte IntA50040-500
RPMI 1640ThermoFisher Scientific11875093
FBSSigmaF2442-500mL  alle US-Quellen, nicht hitzeinaktiviertes
GentamicinThermoFisher Scientific15710064
B-MercaptoethanolFisher BP176-100
15mL dounce GewebemühleWheaton357544jede ähnliche Marke ist geeignet
Akku-HandhomogenisatorKontes/Sigma Z359971-1EAjede ähnliche Marke ist geeignet
Instrumente - Schere, Kurvenschere, Pinzette, feine Pinzette, Dreiecksspreizerjede Marke ist geeignet
3mL SpritzenBD Bioscience309657
15mL konische RöhrchenFisher 
1,5 mL Mikrofuge-RöhrchenDenvilleC2170
70um ZellsiebeFisher 
60-mm-PlattenThermoFisher Scientific130181
48-Well-GewebekulturplattenThermoFisher Scientific08-772-1C
1 ml Insulinspritze 28G1/2Fisher Scientific/Excel Int.14-841-31
Maus IFN-gamma ELISA Ready-SET-Go! KitInvitrogen / eBioscience50-173-21
Maus IL-17 ELISA Ready-SET-Go! KitInvitrogen / eBioscience50-173-77
Maus IL-5 ELISA Ready-SET-Go! BausatzInvitrogen / eBioscience50-172-09
, 33965122363548

Referenzen

  1. Tacken, P. J., Figdor, C. G. Targeted antigen delivery and activation of dendritic cells in vivo: steps towards cost effective vaccines. Seminars in Immunology. 23 (1), 12-20 (2011).
  2. Kilgore, P. E., Salim, A. M., Zervos, M. J., Schmitt, H. J. Pertussis: Microbiology, Disease, Treatment, and Prevention. Clinical Microbiology Reviews. 29 (3), 449-486 (2016).
  3. Dorji, D., et al. Bordetella Pertussis virulence factors in the continuing evolution of whooping cough vaccines for improved performance. Medical Microbiology and Immunology. 207 (1), 3-26 (2018).
  4. Feldstein, L. R., et al. Global Routine Vaccination Coverage, 2016. Morbidity and Mortality Weekly Report. 66 (45), 1252-1255 (2017).
  5. Cherry, J. D. Epidemic pertussis in 2012--the resurgence of a vaccine-preventable disease. New England Journal of Medicine. 367 (9), 785-787 (2012).
  6. Celentano, L. P., et al. Resurgence of pertussis in Europe. The Pediatric Infectious Disease Journal. 24 (9), 761-765 (2005).
  7. McNabb, S. J., et al. Summary of notifiable diseases. Morbidity and Mortality Weekly Report p. 54 (53), 1-92 (2007).
  8. Sealey, K. L., Belcher, T., Preston, A. Bordetella pertussis epidemiology and evolution in the light of pertussis resurgence. Infection, Genetics, and Evolution. 40, 136-143 (2016).
  9. Warfel, J. M., Merkel, T. J. The baboon model of pertussis: effective use and lessons for pertussis vaccines. Expert Reviews of Vaccines. 13 (10), 1241-1252 (2014).
  10. Jennings-Gee, J., et al. The adjuvant Bordetella Colonization Factor A attenuates alum-induced Th2 responses and enhances Bordetella pertussis clearance from mouse lungs. Infection and Immunity. , (2018).
  11. Sukumar, N., Mishra, M., Sloan, G. P., Ogi, T., Deora, R. Differential Bvg phase-dependent regulation and combinatorial role in pathogenesis of two Bordetella paralogs, BipA and BcfA. Journal of Bacteriology. 189 (10), 3695-3704 (2007).
  12. Stainer, D. W., Scholte, M. J. A simple chemically defined medium for the production of phase I Bordetella pertussis. Journal of General Microbiology. 63 (2), 211-220 (1970).
  13. Bordet, J. Le microbe de le coqueluche. Annales de l'Institut Pasteur. 20, 731-741 (1906).
  14. Cook, M. J. The Anatomy of the Laboratory Mouse. , Academic Press. (1965).
  15. Sutton, S. Accuracy of Plate Counts. Journal of Validation Techniques. 17 (3), 42-46 (2011).
  16. Conover, M. S., Sloan, G. P., Love, C. F., Sukumar, N., Deora, R. The Bps polysaccharide of Bordetella pertussis promotes colonization and biofilm formation in the nose by functioning as an adhesin. Molecular Microbiology. 77 (6), 1439-1455 (2010).
  17. Cattelan, N., Jennings-Gee, J., Dubey, P., Yantorno, O. M., Deora, R. Hyperbiofilm Formation by Bordetella pertussis Strains Correlates with Enhanced Virulence Traits. Infection and Immunity. 85 (12), (2017).
  18. Andreasen, C., Carbonetti, N. H. Pertussis toxin inhibits early chemokine production to delay neutrophil recruitment in response to Bordetella pertussis respiratory tract infection in mice. Infection and Immunity. 76 (11), 5139-5148 (2008).
  19. Mills, K. H., Gerdts, V. Mouse and pig models for studies of natural and vaccine-induced immunity to Bordetella pertussis. Journal of Infectious Diseases. 209, Suppl 1 16-19 (2014).
  20. Dunne, A., et al. A novel TLR2 agonist from Bordetella pertussis is a potent adjuvant that promotes protective immunity with an acellular pertussis vaccine. Mucosal Immunology. 8 (3), 607-617 (2015).
  21. Denoel, P., Godfroid, F., Guiso, N., Hallander, H., Poolman, J. Comparison of acellular pertussis vaccines-induced immunity against infection due to Bordetella pertussis variant isolates in a mouse model. Vaccine. 23 (46-47), 5333-5341 (2005).
  22. Marr, N., et al. Protective activity of the Bordetella pertussis BrkA autotransporter in the murine lung colonization model. Vaccine. 26 (34), 4306-4311 (2008).
  23. Feunou, P. F., Bertout, J., Locht, C. T- and B-cell-mediated protection induced by novel, live attenuated pertussis vaccine in mice. Cross protection against parapertussis. PLoS One. 5 (4), 10178(2010).
  24. Mills, K. H., Ryan, M., Ryan, E., Mahon, B. P. A murine model in which protection correlates with pertussis vaccine efficacy in children reveals complementary roles for humoral and cell-mediated immunity in protection against Bordetella pertussis. Infection and Immunity. 66 (2), 594-602 (1998).
  25. Higgs, R., Higgins, S. C., Ross, P. J., Mills, K. H. Immunity to the respiratory pathogen Bordetella pertussis. Mucosal Immunology. 5 (5), 485-500 (2012).
  26. Alving, C. R. Design and selection of vaccine adjuvants: animal models and human trials. Vaccine. 20, Suppl 3 56-64 (2002).
  27. Ipp, M. M., et al. Adverse reactions to diphtheria, tetanus, pertussis-polio vaccination at 18 months of age: effect of injection site and needle length. Pediatrics. 83 (5), 679-682 (1989).
  28. Fessard, C., Riche, O., Cohen, J. H. Intramuscular versus subcutaneous injection for hepatitis B vaccine. Vaccine. 6 (6), 469(1988).
  29. Bergeson, P. S., Singer, S. A., Kaplan, A. M. Intramuscular injections in children. Pediatrics. 70 (6), 944-948 (1982).
  30. Zhang, L., Wang, W., Wang, S. Effect of vaccine administration modality on immunogenicity and efficacy. Expert Review of Vaccines. 14 (11), 1509-1523 (2015).
  31. Ross, P. J., et al. Relative Contribution of Th1 and Th17 Cells in Adaptive Immunity to Bordetella pertussis: Towards the Rational Design of an Improved Acellular Pertussis Vaccine. PLoS Pathogens. 9 (4), 1003264(2013).
  32. Warfel, J. M., Zimmerman, L. I., Merkel, T. J. Acellular pertussis vaccines protect against disease but fail to prevent infection and transmission in a nonhuman primate model. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 111 (2), 787-792 (2014).
  33. Allen, A. C., et al. Sustained protective immunity against Bordetella pertussis nasal colonization by intranasal immunization with a vaccine-adjuvant combination that induces IL-17-secreting TRM cells. Mucosal Immunology. , (2018).
  34. Solans, L., et al. IL-17-dependent SIgA-mediated protection against nasal Bordetella pertussis infection by live attenuated BPZE1 vaccine. Mucosal Immunology. , (2018).
  35. Miller, M. A., et al. Visualization of murine intranasal dosing efficiency using luminescent Francisella tularensis: effect of instillation volume and form of anesthesia. PLoS One. 7 (2), 31359(2012).
  36. Sato, Y., Izumiya, K., Sato, H., Cowell, J. L., Manclark, C. R. Aerosol infection of mice with Bordetella pertussis. Infection and Immunity. 29 (1), 261-266 (1980).
  37. Warfel, J. M., Beren, J., Merkel, T. J. Airborne transmission of Bordetella pertussis. Journal of Infectious Diseases. 206 (6), 902-906 (2012).
  38. Scanlon, K. M., Snyder, Y. G., Skerry, C., Carbonetti, N. H. Fatal Pertussis in the Neonatal Mouse Model Is Associated with Pertussis Toxin-Mediated Pathology beyond the Airways. Infection and Immunity. 85 (11), (2017).
  39. Martinez de Tejada, G., et al. Neither the Bvg- phase nor the vrg6 locus of Bordetella pertussis is required for respiratory infection in mice. Infection and Immunity. 66 (6), 2762-2768 (1998).
  40. Higgins, S. C., Jarnicki, A. G., Lavelle, E. C., Mills, K. H. TLR4 mediates vaccine-induced protective cellular immunity to Bordetella pertussis: role of IL-17-producing T-cells. Journal of Immunology. 177 (11), 7980-7989 (2006).
  41. Mahon, B. P., Brady, M. T., Mills, K. H. Protection against Bordetella pertussis in mice in the absence of detectable circulating antibody: implications for long-term immunity in children. Journal of Infectious Diseases. 181 (6), 2087-2091 (2000).
  42. Karlsson, A. C., et al. Comparison of the ELISPOT and cytokine flow cytometry assays for the enumeration of antigen-specific T-cells. Journal of Immunological Methods. 283 (1-2), 141-153 (2003).
  43. Hagen, J., et al. Comparative Multi-Donor Study of IFNgamma Secretion and Expression by Human PBMCs Using ELISPOT Side-by-Side with ELISA and Flow Cytometry Assays. Cells. 4 (1), 84-95 (2015).
  44. Raeven, R. H. M., et al. Molecular and cellular signatures underlying superior immunity against Bordetella pertussis upon pulmonary vaccination. Mucosal Immunology. 11 (3), 1009(2018).

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