Methodenartikel

Ein Ansaugsystem für gruppierte Spaltöffnungen durch Zucker Lösung eintauchen Behandlung in Arabidopsis Thaliana Sämlinge

DOI:

10.3791/58951

⸱

15. Februar 2019

 , 
1Department of Integrated Frontier Sciences, The University of Tokyo, 2International Research Organization for Advanced Science and Technology, Kumamoto University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das Ziel dieses Protokolls ist zu zeigen, wie induzieren gruppierte Spaltöffnungen in Keimblätter von Arabidopsis Thaliana Sämlinge durch Immersion Behandlung mit einer zuckerhaltigen Lösung für mittlere und intrazelluläre Strukturen wie Chloroplasten beobachten und Mikrotubuli in der gruppierten Schließzellen mit konfokale laser-Mikroskopie.

Zusammenfassung

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Stomata Bewegung vermittelt Gasaustausch Pflanze, die für die Photosynthese und Transpiration ist. Stomata öffnen und Schließen erfolgt durch eine deutliche Steigerung und Abnahme bzw. Guard Zellvolumen. Da shuttle-Transport von Ionen und Wasser während der Stomata Bewegung zwischen Schließzellen und größeren benachbarten Epidermiszellen erfolgt, gilt die Abstand Verteilung der Pflanze Spaltöffnungen eine optimale Verteilung für die Stomata Bewegung. Experimentelle Systeme für sind der Abstand Musters der Spaltöffnungen sind nützlich, um den Abstand Muster Bedeutung zu prüfen. Mehrere wichtige Gene verbunden mit dem Abstand Stomata Vertrieb wurden identifiziert und gruppierte Spaltöffnungen experimentell durch die Veränderung dieser Gene induziert werden können. Gruppierte Spaltöffnungen können alternativ auch durch exogene Behandlungen ohne gentechnische Veränderung induziert werden. In diesem Artikel beschreiben wir eine einfache Induktionssystem für gruppierte Spaltöffnungen in Arabidopsis Thaliana Sämlinge durch Immersion Behandlung mit einer Saccharose-haltige Mittel Lösung. Unsere Methode ist einfach und unmittelbar zu transgenen oder mutierten Linien. Größere Chloroplasten werden als biologische Zelle Markenzeichen der Saccharose-induzierte gruppierten Schließzellen vorgestellt. Darüber hinaus ist ein repräsentatives konfokale mikroskopische Bild der kortikalen Mikrotubuli der intrazellulären Beobachtung von gruppierten Schließzellen exemplarisch dargestellt. Die radiale Ausrichtung der kortikalen Mikrotubuli wird in gruppierten Schließzellen wie angeordneten Schließzellen in Kontrolle Bedingungen beibehalten.

Einleitung

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Die Pflanze Stoma ist ein wesentliches Organ für Gasaustausch für Photosynthese und Transpiration und Stomata Bewegung wird durch Veränderungen im Schließzellen durch Ionen-gesteuerte Aufnahme und Abgabe von Wasser erreicht. Unter dem Mikroskop können wir beobachten, ein Abstand Verteilungsmuster von Spaltöffnungen auf der Oberfläche der Blätter und Stängel. Dieser Abstand Verteilung der Spaltöffnungen wird als Stomata Bewegung helfen, die von Wasser und Ionen-Austausch zwischen den Schließzellen und den angrenzenden Epidermiszellen1,2geregelt ist. Experimentellen Induktion Systeme für gruppierte Spaltöffnungen eignen sich für die Untersuchung der Bedeutung der Abstand Verteilung der Spaltöffnungen.

Es wurde berichtet, dass räumliche Bündelung von Spaltöffnungen durch gentechnische Veränderung von Schlüsselgene für Guard Zelle Differenzierung3,4 oder Behandlung mit einer chemischen Verbindung5induziert werden kann. Wir haben auch berichtet, dass Immersion Behandlung mit einer mittleren Lösung mit Zucker Saccharose, Glukose, einschließlich ergänzt und Fruktose verursacht Stomata clustering in Keimblätter von Arabidopsis Thaliana Sämlinge6. Reduzierte Kallose in neue Zellwänden, die Trennung von Meristemoids und Epidermiszellen beobachtet in der Saccharose behandelt Keimblattes Epidermis, was darauf hindeutet, dass Saccharose Lösung eintauchen Behandlung wirkt sich negativ auf die Zellwand, die verhindert das Auslaufen und ektopische Wirkung der Schlüssel-Genprodukte für Guard-Zell-Differenzierung (z. B. Transkriptionsfaktoren) gegenüber angrenzenden epidermalen Zellen6. Ein ähnlicher Mechanismus wurde von Studien über die gsl8/Chor Mutanten7,8vorgeschlagen. Unsere Experimentiersystem für reproduzierbare Induktion von gruppierten Spaltöffnungen mit Saccharose-haltige Mittel Lösung ist ganz einfach und billig. Es kann auch verwendet werden, zu untersuchen, intrazelluläre Strukturen wie Organellen und dem Zytoskelett in die gruppierten Schließzellen bei transgenen Linien mit dem Ausdruck fluoreszierenden Marker, dass Label intrazellulären Strukturen9, 10.

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Protokoll

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1. Vorbereitung von 3 % Saccharose-haltige 1/2 Murashige-Skoog mittlere Lösung

  1. Hinzu kommt ein Becherglas 1,1 g Murashige Skoog mittlere Salze und 15 g Saccharose.
  2. 490 mL destilliertem Wasser und mischen Sie gut mit einer rühren.
  3. Stellen Sie den pH-Wert auf 5,8 mit KOH.
  4. Bis 500 mL mit destilliertem Wasser verdünnen und die Lösung in eine mittlere Flasche übertragen.
  5. Sterilisieren Sie die Lösung durch Autoklavieren (121 ° C, 20 min). Wenn nicht sofort verwendet, kann diese Lösung nach der Sterilisation bei 4 ° C aufzubewahren.

(2) Induktion von gruppierten Spaltöffnungen von Saccharose-haltige Mittel Lösung eintauchen Behandlung

  1. Sterilisieren Sie die Samen.
    1. Bereiten Sie die Sterilisation Lösung durch Zugabe von 500 µL 5 % Aktivchlor NaClO Lösung und 1 µL 10 % Triton x-100, 500 µL sterilem Wasser.
    2. Legen Sie ca. 50 transgenen A. Thaliana Samen tragen einen fluoreszierenden Marker wie CT-GFP11 oder GLP-TUB612 in eine 1,5-mL-Tube.
    3. Fügen Sie 1 mL 70 % igen Ethanol Lösung und Mischung gut durch fünf mal umdrehen. Lassen Sie für 1 Minute.
    4. Der Samen werden auf den Boden des Röhrchens sinken. Auf einer sauberen Werkbank vorsichtig entfernen Sie das 70 % Ethanol mit einer Mikropipette und fügen Sie 1 mL der Lösung der Sterilisation. Mischen Sie gut durch fünf mal umdrehen und 5 min warten.
    5. Waschen Sie die Samen. Entfernen Sie die Lösung mit einer Mikropipette arbeiten noch unter aseptischen Bedingungen an einer sauberen Werkbank, sanft und geben Sie 1 mL sterilem Wasser hinzu. Wiederholen Sie diesen Schritt fünf Mal.
  2. 1,5 mL sterilisiert 3 % Saccharose-haltige 1/2 Murashige Skoog mittlere Lösung in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte auf einer sauberen Werkbank hinzugeben.
  3. Fügen Sie zwei sterilisierte Samen in jede Vertiefung. Kleben Sie den Deckel auf die 24-Well-Platte mit zwei Schichten von Parafilm.
  4. Übertragen Sie 24-Well-Platte zu einem Wachstum Kammer Satz bei 23,5 ° C mit einem 12-h/12-h-hell-dunkel-Zyklus mit 100 µmol m−2 s−1 weißes Licht zu und inkubieren Sie für 14 Tage.

3. mikroskopische Beobachtung der gruppierten Spaltöffnungen

  1. Platz 30 µL 3 % Saccharose-haltige 1/2 Murashige Skoog mittlere Lösung aus einem Brunnen 24-Well-Platte in der Mitte des einen Objektträger (Größe: 76 × 26 mm, Dicke: 1,0-1,2 mm).
  2. Entfernen Sie ein Keimblatt aus 14 Tage alten Sämling mit sezierenden Schere. Schweben Sie mit der Beobachtung Seite nach oben auf das Drop-Lösung den Keimblättern.
  3. Die Samenlappen Probe nach unserer vorherigen Methode13vorbereiten. Im wesentlichen stellen 30 µL der Lösung auf die Mitte von einem Deckglas (Größe: 18 × 18 mm, Dicke: 0.12-0,17 mm). Umdrehen Sie das Deckglas und legen Sie sie sanft auf den Keimblättern. Überschüssigen Puffer mit einem fusselfreien Tuch abwischen.
  4. Ein Exemplar auf der Bühne von einem konfokalen Laser-Mikroskop und wählen Sie gruppierte Schließzellen für Beobachtung mit Hellfeld-Beleuchtung.
  5. Konfokale Bilder von Eindringmittel gekennzeichneten intrazellulären Strukturen gemäß Anweisungen des Herstellers Mikroskop zu erwerben.

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Ergebnisse

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Hier wurde das Protokoll für eine einfache Methode der Induktion Stomata clustering mit Saccharose-haltige Mittel Lösung in A. Thaliana Sämlinge vorgestellt. Die gruppierten Schließzellen in Saccharose-haltige Mittel Lösung (Abbildung 1B) angebaut haben größere Chloroplasten als Schließzellen in Saccharose free Control Bedingungen (Abb. 1A) angebaut. Die Erweiterung der Chloroplasten bes...

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Diskussion

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Wir haben Protokolle für die Induktion von gruppierten Spaltöffnungen in A. Thaliana Sämlinge durch Immersion Behandlung mit einer Saccharose-haltige Mittel Lösung vorgelegt. Wie hier gezeigt, diese Methode ist sehr einfach und erfordert keine spezielle Fähigkeit aber effizient gruppierte Spaltöffnungen induzieren kann. Mehr als 45 % der Schließzellen sind mit 3 % Saccharose-haltige Cluster mittlere Lösung (Mittelwerte von mehr als 20 unabhängige Beobachtungen)6. Darüber hinaus kann diese...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Wir sind dankbar, Prof. Seiichiro Hasezawa für seine freundliche Unterstützung unserer Arbeit. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von der Japan Society unterstützt, für die Promotion of Science (JSPS) KAKENHgrant 17K 19380 Zahlen und 18 H 05492, der Sumitomo-Foundation für einen Zuschuss für grundlegende Wissenschaft Forschungsprojekte, Anzahl 160146 und die Canon Foundation t.h gewähren. Dieses experimentelle System wurde unter eine finanzielle Unterstützung von der JSPS KAKENHgrant Nummer 26891006, K. A. entwickelt. Wir bedanken uns bei Robbie Lewis, MSc, aus Edanz Gruppe (www.edanzediting.com/ac) für die Bearbeitung eines Entwurfs des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
24-Well-PlatteSumitomo BakelitMS-0824R
488 nm LaserFurukawa DenkoHPU-50101-PFS2
488 nm LaserOlympusSapphire488-20/O
510 nm LangpassfilterOlympusBA510IF
524 - 546 nm BandpassfilterSemrockFF01-535/22-25
530 nm Kurzpass FilterOlympusBA530RIF
561 nm LaserCVI Melles Griot85-YCA-025-040
604 - 644 nm BandpassfilterSemrockFF01-624/40-25
Konfokaler LaserscankopfYokogawaCSU10
Konfokaler LaserscankopfOlympusFV300
Gekühlte CCD-KameraPhotometrieCoolSNAP HQ2
BilderfassungssoftwareMolecular DevicesMetaMorph Version 7.8.2.0
BildaufnahmesoftwareOlympusFLUOVIEW v5.0
ImmersionsölOlympusImmersionsöl Type-Fne = 1.518 (23 Grad)
Inverses MikroskopOlympusIX-70
Inverses MikroskopOlympusIX-71
Murashige und Skoog PflanzensalzmischungFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation392-00591Murashige T und Skoog F (1962) Ein überarbeitetes Medium für schnelles Wachstum und Bioassays mit Tabakgewebekulturen. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497.
Objektiv OlympusUPlanApo 100x / 1.35 NA Öl Blende 1.35NA = 1.35
Objektiv OlympusUPlanAPO 40x / 0.85 NANA = 0.85
SaccharoseFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation196-00015

Referenzen

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  1. Raschke, K., Fellows, M. P. Stomatal movement in Zea mays: shuttle of potassium and chloride between guard cells and subsidiary cells. Planta. 101 (4), 296-316 (1971).
  2. Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant and Cell Physiology. 55 (4), 773-780 (2013).
  3. Bergmann, D. C., Sack, F. D. Stomatal development. Annual Review of Plant Biology. 58, 163-181 (2007).
  4. Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Mechanisms of stomatal development. Annual Review of Plant Biology. 63, 591-614 (2012).
  5. Sakai, Y., et al. The chemical compound bubblin induces stomatal mispatterning in Arabidopsis by disrupting the intrinsic polarity of stomatal lineage cells. Development. 144 (3), 499-506 (2017).
  6. Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Breaking of plant stomatal one-cell-spacing rule by sugar solution immersion. PLOS One. 8 (9), 72456(2013).
  7. Chen, X. Y., et al. The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning. Plant Physiology. 150 (1), 105-113 (2009).
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  9. Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Cortical microtubules and fusicoccin response in clustered stomatal guard cells induced by sucrose solution immersion. Plant Signaling and Behavior. 13 (4), 1454815(2018).
  10. Akita, K., Hasezawa, S. Sugar solution induces clustered lips. Cytologia. 79 (2), 125-126 (2014).
  11. Holzinger, A., Buchner, O., Lütz, C., Hanson, M. R. Temperature-sensitive formation of chloroplast protrusions and stromules in mesophyll cells of Arabidopsis thaliana. Protoplasma. 230 (1-2), 23-30 (2007).
  12. Abe, T., Hashimoto, T. Altered microtubule dynamics by expression of modified α-tubulin protein causes right-handed helical growth in transgenic Arabidopsis plants. The Plant Journal. 43 (2), 191-204 (2005).
  13. Higaki, T. Real-time imaging of plant cell surface dynamics with variable-angle epifluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (106), 53437(2015).

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Schlagwörter

Saccharose BehandlungSchlie zellvolumenChloroplastenvergr erungkortikale Mikrotubulikonfokale MikroskopieMurashige Skoog Mediumstomat re ClusterbildungKeimlingsinkubation

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