Hier beschreiben wir ein Protokoll für eine allgemeine Puls-Jagd-Methode, die die kinetische Analyse der Faltung, Transport und Abbau von Proteinen in lebenden Zellen einzuhaltenden erlaubt.
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Methodenartikel
Analyse der Proteinfaltung, Transport und Abbau in lebenden Zellen durch radioaktive Puls Chase
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Kennzeichnung von radioaktiven Puls-Jagd ist ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium der Konformationsänderungen Reifung, den Transport zu ihrer zellulären Platzes und der Verschlechterung der Zielproteine in lebenden Zellen. Mit kurzen (Puls) enzymatische Zeiten (< 30 min) und streng kontrolliert Chase Zeiten, es ist möglich, beschriften Sie nur einen Bruchteil des gesamten Protein Pools und folgen seinen Falten. In Kombination mit nonreducing/Reduzierung der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Immunopräzipitation mit (Konformation) Antikörper kann Falten Prozesse im Detail untersucht werden. Dieses System wurde verwendet, um die Faltung von Proteinen mit eine große Variation in Eigenschaften wie lösliche Proteine, Einzel- und Multi-Pass transmembranen Proteine, stark N und O-glycosylierten Proteine und Proteine mit und ohne umfangreiche Disulfid analysieren die Verklebung. Puls-Jagd-Methoden sind die Basis für kinetische Untersuchungen in eine Reihe von zusätzlichen Funktionen, einschließlich Co- und posttranslationale Modifikationen, Oligomerisierung und Polymerisation, im wesentlichen erlaubt die Analyse eines Proteins von der Geburt bis zum Tod. Puls-Chase-Studien zur Proteinfaltung ergänzen sich mit anderen biochemischen und biophysikalischen Methoden für ein Studium Proteine in Vitro durch höhere zeitliche Auflösung und physiologische Informationen. Die Methoden, wie in diesem Dokument beschrieben sind leicht angepasst, zur Untersuchung der Faltung von fast jedem Protein, das in Säugetieren oder Insekt-Zelle Systeme ausgedrückt werden kann.
Einleitung
Die Faltung auch relativ einfache Proteine umfasst viele verschiedene klappbaren Enzyme, molekulare Chaperone und kovalente Modifikationen1. Eine vollständige Wiederherstellung der diese Prozesse in Vitro ist praktisch unmöglich, angesichts die Vielzahl von verschiedenen Komponenten beteiligt. Es ist daher höchst wünschenswert, Proteinfaltung in Vivo, in lebenden Zellen zu studieren. Radioaktiven Puls-Jagd Techniken beweisen ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium der Synthese, Falten, Transport und Abbau von Proteinen in ihrer natürlichen Umgebung.
Die metabolische Kennzeichnung von Proteinen....
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Protokoll
Alle radioaktiven Reagenzien und Verfahren wurden in Übereinstimmung mit örtlichen Universität Utrecht Strahlung Regeln und Vorschriften gehandhabt.
1. Puls Chase
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Puls-Chase für adhärente Zellen
Hinweis: Die hier angegebenen Volumen basiert auf 60 mm Zelle Kultur Gerichte. Für 35 mm oder 100 mm Schalen die Bände mit 1/2 oder 2, jeweils multipliziert. Dieses Protokoll verwendet eine Taktzeit von 0, 15, 30, 60, 120 und 240 min. 10 min und Chase Zeiten. Diese können je nach den spezifischen Proteinen untersucht (unten besprochen) variiert werden.- Samen adhärente Zellen (z. B.HEK 293, HeLa, CHO) i....
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Ergebnisse
Die Faltung und Sekretion von HIV-1 gp120 aus einem anhaftenden Puls Chase ist in Abbildung 2dargestellt. Das nonreducing Gel (Zellen NR in der Abbildung) zeigt die oxidative Faltung des gp120. Sofort nach dem Puls Kennzeichnung von 5 min (0 min. Chase) gp120 erscheint als eine diffuse Band höher in das Gel, und Fortschreiten der Jagd, die Band wandert nach unten das Gel durch noch mehr verbreitet Faltung Zwischenprodukte (IT), bis es reichert sich in den eng.......
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Diskussion
Puls-Jagd-Methoden wurden wesentlich für die Entwicklung von wissenschaftlichen Verständnis der Proteinfaltung in intakten Zellen. Während wir versucht haben, ein Verfahren zu schaffen, die so allgemein wie möglich ist, hat dieser Ansatz das Potenzial für nahezu grenzenlose Variationen, verschiedene Prozesse zu studieren, die während der Faltung, den Transport und das Leben der Proteine in der Zelle auftreten.
Bei der Durchführung einer Puls-Verfolgungsjagd mit adhärenten Zellen in Gerichte un.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Die Autoren danken allen Mitgliedern des Labors Braakman, vorbei an und präsentieren, für ihre fruchtbaren Diskussionen und helfen bei der Entwicklung der Methoden in diesem Artikel vorgestellt. Dieses Projekt wird finanziell von der Europäischen Forschungsrat unter der Europäischen Union siebten Rahmenprogramms (RP7/2007-2013) N ° 235649 und der Niederlande Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO) unter der ECHO-Programm N ° 711.012.008.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1,5 mL Safeseal Mikrozentrifugenröhrchen | Sarstedt | 72.706.400 | |
| Essigsäure | Sigma | A6283 | Eisessig |
| BAS Lagerung Phosphorsieb 20x25 cm | GE Life Sciences | 28956475 | |
| Bromophenol Blue | Sigma | B8026 | |
| Carestream Biomax MR-Filme | Kodak | Z350370-50EA | |
| Zellkulturmedien | Verschiedenes | N/A | Normale Zellkulturmedien für bestimmte verwendete Zelllinien |
| Zellkulturmedien, kein Methionin/Cystein | Verschiedenes | N/A | Gleiche Medienformulierung wie normale Nährmedien, z. B. DMEM/MEM/RPMI, ohne Methionin und Cystein |
| Aktivkohlefilterpapier | Whatman | 1872047 | |
| Pipettenspitzen mit Aktivkohlefiltrierung | Molekular bioproducts | 5069B | |
| Aktivkohle-Vakuumschutz | Whatman | 67221001 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Sigma | 112.553 | für Elektrophorese |
| Cystein | Sigma | C7352 | Molekularbiologische Qualität, 500 mM Lagerbestand herstellen, lagern bei -20 |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | Molekularbiologische Qualität |
| EasyTag Express35S Proteinmarkierungsmischung | Perkin Elmer | NEG772014MC | Andere Größen von Markierungschargen sind je nach Verwendung erhältlich |
| EDTA | Sigma | E1644 | in molekularbiologischer Qualität |
| Verschiedene | N/A | ||
| Glycerin | Sigma | G5516 | Molekularbiologie |
| Güteklasse 3 Chromatographie-Papier | GE Life Sciences | 3003-917 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 24020117 | |
| Kimwipes Zarte Arbeitstücher | VWR | 21905-026 | |
| MES | Sigma | M3671 | |
| Methanol | Sigma Sigma | MX0490 | |
| Methionin | Sigma | M5308 | Molekularbiologie Qualität, 250 mM Lagerbestand, Lagerung bei -20 |
| Minigel Gieß- / Laufausrüstung | Verschiedene | N / A | |
| NaCl | Sigma S7653 | Molekularbiologische Qualität | |
| N-Ethylmaleimid | Sigma | E3876 | Molekularbiologische Qualität, Herstellung von 1 Mio. Lager in 100% Ethanol, Lagerung bei -20 |
| PBS | Sigma | P5368 | |
| Protein-A Sepharose-Fastflow-Kügelchen | GE Health-Care | 17-5280-04 | |
| Natriumdodecylsulfat (SDS) | Sigma | L3771 | Molekularbiologisches |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Molekularbiologisches |
| Trizma-Base (Tris) | Sigma | T6066 | Molekularbiologisches |
| Typhoon IP Biomolekularer Imager | Amersham | 29187194 | |
| Reagenzglasgestell ohne Draht 20 mm für Wasserbad | Nalgene | 5970-0320PK |
Referenzen
- Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER. Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).
- Pisoni, G. B., Molinari, M. Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation. Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).
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Nachdrucke und Genehmigungen
