Ein Edelstahl-Protokoll für hochwertige RNA Isolation aus Laser Capture Microdissected Purkinje-Zellen im menschlichen Post-Mortem Kleinhirn

Regina T. Martuscello; Elan D. Louis; Phyllis L. Faust

doi:10.3791/58953

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Methodenartikel

Ein Edelstahl-Protokoll für hochwertige RNA Isolation aus Laser Capture Microdissected Purkinje-Zellen im menschlichen Post-Mortem Kleinhirn

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DOI:

10.3791/58953

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17. Januar 2019

Regina T. Martuscello¹ , Elan D. Louis²^,³^,⁴ , Phyllis L. Faust¹

¹Department of Pathology and Cell Biology, Columbia University, ²Division of Movement Disorders, Department of Neurology, Yale University, ³Department of Chronic Disease Epidemiology, Yale School of Public Health, Yale University, ⁴Center for Neuroepidemiology and Clinical Neurological Research, Yale School of Medicine, Yale University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll verwendet einen fleckenfreie Ansatz zu visualisieren und Purkinje-Zellen im Tiefkühlfrische Gewebe von Post-Mortem-menschlichen Kleinhirn per Laser Capture Microdissection zu isolieren. Der Zweck dieses Protokolls ist, ausreichende Mengen an qualitativ hochwertigen RNA für die RNA-Sequenzierung zu generieren.

Zusammenfassung

Laser Capture Microdissection (LCM) ist ein Vorteil, die für die Sammlung von zytologisch und/oder phänotypisch relevanten Zellen oder Regionen von heterogenen Gewebe ermöglicht. Erfasste Produkt kann verwendet werden, in einer Vielzahl von molekularen Methoden für Protein, DNA oder RNA isoliert. Erhaltung der RNA aus Post-mortem Gehirngewebe ist jedoch eine besondere Herausforderung. Immunhistochemische Färbung Verfahren, die weiter verschlechtern RNA oder Standard Visualisierungstechniken für LCM erfordern histologische. Daher haben wir ein Edelstahl-Protokoll zur Visualisierung in LCM mit dem Verwendungszweck der Erhaltung der Integrität der RNA in Post-Mortem Gehirngewebe entwickelt. Die Purkinje-Zelle des Kleinhirns ist ein guter Kandidat für Edelstahl-Visualisierung, aufgrund seiner Größe und charakteristischen Lage. Die zerebelläre Kortex besteht aus unterschiedlichen Schichten, die sich in Zelldichte unterscheiden, so dass sie eine gute Archetyp, unter starker Vergrößerung Mikroskopieren zu identifizieren. Purkinje-Zellen sind große Neuronen liegt zwischen Granulat Zellschicht, die dicht Mobilfunknetz kleinen Neuronen, und die molekulare Schicht, die in Zellkörpern spärlich ist. Wegen dieser Architektur ist der Einsatz von Edelstahl Visualisierung möglich. Geeignet wäre auch andere Organ oder eine Zelle Systeme, die diesen Phänotyp zu imitieren. Das Edelstahl-Protokoll soll fix Tiefkühlfrische Gewebe mit Ethanol und Lipide mit Xylol für verbesserte morphologische Visualisierung unter hoher Vergrößerung Lichtmikroskopie zu entfernen. Dieses Protokoll nicht für andere Fixierung Methoden berücksichtigt und ist speziell für Tiefkühlfrische Gewebeproben mit einer ultravioletten (UV) erfasst-LCM-System. Hier präsentieren wir Ihnen eine vollständige Protokoll für schneiden und Festsetzung von frisch gefrorenen Post-Mortem-zerebelläre Gewebe und Reinigung der RNA von Purkinje-Zellen, die durch UV-LCM, unter Beibehaltung der RNS-Qualität für die anschließende RNA-Sequenzierung isoliert. In unseren Händen dieses Protokoll produziert außergewöhnliches Maß an zellulären Visualisierung ohne Reagenzien Färbung und RNA mit hoher RNA Integrität Zahlen (≥8) ergibt, Bedarf für transkriptionelle Profilerstellung Experimente.

Einleitung

Laser Capture Microdissection (LCM) ist eine wertvolle Recherche-Tool, die die Trennung der pathologisch relevanten Zellen für Molekular angetriebenen Folgebewertung ermöglicht. Die Verwendung von molekularen Analysen in dieser heterogenen Gewebeproben und die Korrelation mit pathologischen und klinischen Daten ist ein notwendiger Schritt bei der Bewertung der translationalen Bedeutung der biologischen Forschung¹. Bei der Analyse der Genexpressionsdaten aus RNA die Verwendung von gefrorenen Gewebeschnitte wird dringend empfohlen, denn es ermöglicht eine ausgezeichnete Qualität der RNA sowie Menge²maximiert. Es wurde auch....