Summary
Här presenterar vi ett flöde flödescytometrisk protokoll för att identifiera CD4+ och CD8+ T celler, γδ T-celler, B-celler, NK-celler och monocyter i perifert blod med hjälp av endast två fluorokromer i stället för sju. Med detta synsätt, kan fem ytterligare markörer spelas på de flesta flöde cytometers.
Abstract
Immunceller karakterisering är starkt beroende av multicolor flödescytometri att identifiera subpopulations baserat på differentiell uttryck för yta markörer. Installationen av en klassisk multicolor panel kräver avancerade instrument, anpassade märkt antikroppar och noggrann studiedesign för att minimera spektrala överlappning. Vi utvecklade en multiparametric analys för att identifiera stora befolkningsgrupper immun (CD4+ och CD8+ T celler, γδ T-celler, B-celler, NK-celler och monocyter) i perifert blod genom att kombinera sju lineage markörer med endast två fluorokromer. Vår strategi bygger på observationen att lineage markörer ständigt uttrycks i en unik kombination av varje cell befolkningen. Kombinera denna information med en noggrann titrering av antikroppar kan utredarna att registrera fem ytterligare markörer, expanderar den optiska gränsen för de flesta flöde cytometers. Head-to-Head jämförelse visade att majoriteten av immunceller populationer i perifert blod kan karakteriseras med jämförbar noggrannhet mellan vår metod och den klassiska ”en fluorokrom-en markör metoden”, även om det senare är fortfarande mer exakt för att identifiera populationer såsom NKT-celler och γδ T-celler. Att kombinera sju markörer med två fluorokromer möjliggör analys av komplexa immunceller populationer och kliniska prover på prisvärd 6-10 fluorokrom flöde cytometers, och även på 2-3 fluorokrom fältinstrument i områden med begränsade resurser. Avancerade instrument kan också nytta detta synsätt genom att använda extra fluorokromer för att utföra djupare flödesanalys flödescytometri. Detta tillvägagångssätt är också mycket väl lämpad för screening flera cellpopulationer kliniska prov med begränsat antal celler.
Introduction
Flödescytometri är en teknik som utvecklades för att analysera flera parametrar på enstaka partiklar med en hastighet av flera tusen händelser per andra1. Exempel på prover som analyseras med flödescytometri inkluderar, men är inte begränsade till, celler, pärlor, bakterier, blåsor och kromosomer. En fluidic system styr partiklar vid förhör punkten där varje partikel korsar sin väg med en eller flera lasrar, och flera parametrar registreras för vidare analys. Framåt och side scatter-symboler, genereras av spridning av rena laserljuset, används för att identifiera målgruppen och hämta information om den relativa storlek och interna komplexitet/granularitet av partiklar, respektive. Alla andra parametrar, som står för merparten av data i ett flöde flödescytometrisk analys, härleds av fluorokrom-märkt sonder som känna igen och binda till specifika mål på partiklarna av intresse.
Flödescytometri är en primära verktyg för immunologiska studier för att identifiera och karaktärisera cellpopulationer. För att dissekera komplexiteten i immunsystemet, utvecklas multicolor paneler hela tiden för att utöka antalet markörer samtidigt registreras för djupa immunophenotyping cell populationer1. Detta leder till utvecklingen av mer kapabla instrument och fluorokromer, med senaste high-end flöde cytometers överstiger 20 fluorescerande parametrar. Detta resulterar i komplexa studiedesign på grund av fluorokrom spektrala överlappning och högre kostnader i samband med anpassade antikropp märkning och skickliga operatörer. I flera instanser minskas komplexiteten och kostnaderna genom att använda separata paneler av markörer för olika cellpopulationer. Detta tillvägagångssätt, dock är felbenägen, reducerar informationen i varje panel och kan vara svåra att tillämpa för prover med begränsat antal celler. Dessutom utesluter ökar antalet markörer djupa immunophenotyping på instrument med färre lysrör parametrar. Vi har tidigare utvecklat en färgning protokoll för att identifiera stora befolkningsgrupper immun (CD4+ och CD8+ T celler, γδ T-celler, B-celler, NK-celler och monocyter) i perifera mononukleära blodceller (PBMC) genom att kombinera sju lineage markörer med hjälp endast två fluorokromer istället för sju krävs med den traditionella ”en fluorokrom-en markör” tillvägagångssätt (www.hcdm.org)2,3. Vår första rapport utforskade och validerade begreppet kombinerar sju markörer i två fluorokromer för djupa immunophenotyping. I denna rapport presenterar vi ett steg-för-steg protokoll för att isolera och fläcken perifera blodkroppar, med fokus på den praktiska aspekten och felsökningssteg för att uppnå en lyckad färgning.
Detta protokoll baseras på iakttagelsen att lineage markörer har ett konstantuttryck på cellytan och att varje cell befolkningen har en exklusiv kombination av lineage markörer. I PBMC, CD3 uttryck subdivides immunceller i två huvudkategorier: CD3-positiva T-lymfocyter och CD3-negativa celler. Inom den positiva undergruppen för CD3, CD4+, CD8+ och γδ T-celler kan separeras med hjälp av antikroppar som enbart rikta den γδ-receptorn, CD4 och CD8. På ett jämförbart sätt, inom CD3 negativa undergruppen, kan B-celler, NK-celler och monocyter identifieras unikt med antikroppar mot CD19, CD56 och CD14, respektive. I en standard fluorokrom-en markör strategi, anti-CD3,-CD4,-CD8, -CD14,-CD19, - CD56 och -TCR γδ antikroppar upptäcks med sju olika fluorokromer. Vår strategi kombinerar anti-CD3 - CD56 och -TCR γδ antikroppar i en fluorokrom (märkt för bekvämlighet fluorokrom A) och anti-CD4,-CD8, -CD14 och - CD19 antikroppar i en annan fluorokrom (fluorokrom B). Detta är möjligt genom en kombination av titrering av antikroppar och differentiell antigen uttryck. Både CD4+ och CD8+ T celler är positiva för anti-CD3 antikroppen i fluorokrom A, men de kan separeras i fluorokrom B maximera uttrycket av CD8 signalen medan placera, med en ad hoc-titrering, CD4 signalen mellan CD8 och CD3 positiva-CD4/CD8 dubbel negativ cellerna. Γδ T-celler uttrycker CD3 högre än CD4 och CD8, och därför de kan identifieras som CD3 hög4. Denna signal förstärks ytterligare genom märkning γδ T-celler i fluorokrom A med en anti-TCR γδ antikroppar, därmed förbättra separationen mellan CD3 låg T celler och CD3 hög γδ T-celler. B-celler kan identifieras som CD3– i fluorokrom A och CD19+ i fluorokrom B. För att separera CD3 negativa NK-celler från B-celler, användes en anti-CD56 antikropp i fluorokrom A som anti-CD3. Detta är möjligt eftersom CD56 uttryckt på NK cell på en mycket lägre nivå än CD3 på T celler5. Slutligen, monocyter kan identifieras via en kombination av framåt-side scatter egenskaper och uttryck av CD14 i fluorokrom B.
Tanken att kombinera upp till fyra markörer med två fluorokromer har varit redan framgångsrikt försökt innan6,7,8, och har använts i ett kliniska protokoll för att identifiera maligna lymfatisk populationer9 . En tidigare rapport också kombinerat sju markörer (med olika specificitet från markörer än vi använde i vårt protokoll) med två fluorokromer, men detta tillvägagångssätt förlitade sig på en komplex märkning av varje antikropp med varierande mängd fluorokrom10. Detta är i motsats till vår metod som använder kommersiellt tillgängliga antikroppar och kan anpassas till konfigurationen av instrument och kan dra nytta av den nya generationen av polymer fluorokromer.
Det övergripande målet med denna metod är att expandera optiska gränserna för de flesta flöde cytometers möjliggör inspelning av fem ytterligare markörer att förhöra komplexa cellpopulationer. Följaktligen, avancerade immunologiska analyser kan utföras på prisvärd 6-10 fluorokrom flöde cytometers och 2-3 fluorokrom fältinstrument kan uppnå enastående resultat i områden med begränsade resurser. Avancerade instrument kan också nytta detta synsätt genom att använda extra fluorokromer att utföra djupare flödesanalys flödescytometri och att skapa modulära flöde flödescytometrisk paneler inriktning flera härstamningar på samma tid11. Detta kan potentiellt minska antalet paneler på modulära immunophenotyping flödescytometri och minska kostnaderna, fel och hanteringstid. Detta tillvägagångssätt är också mycket väl lämpad när det gäller kliniska prover med begränsat antal celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla studier av mänskligt material godkändes av Johns Hopkins institutionella i styrelsen under Health Insurance Portability och Accountability Act. Patient- och prover var avidentifierade. PBMC och blod från friska kontroller erhölls av informerat samtycke.
Obs: Detta protokoll har testats på färska eller frysta isolerade perifera blodkroppar och helblod.
1. cell förberedelse
-
Isolering av perifera blodkroppar (PBMC) från helblod
- Dra blod i en 10 mL grön-topp rör innehållande natriumheparin. Efter att röret fyllts med blod, Invertera omedelbart röret flera gånger för att förhindra koagulering.
Obs: Rör som innehåller andra antikoagulantia såsom etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) eller natriumcitrat kan användas med jämförbara resultat. Om en olika mängd blod samlas, ska följande steg i protokollet skalas med detta. - Noggrant över ritade blod till en 50 mL konisk tub. Späda ut blodet med en lika stor mängd fosfatbuffrad saltlösning (PBS) utan kalcium och magnesium.
- Tillsätt 15 mL täthet lutning medium (t.ex. Ficoll) längst ned i en ny 50 mL koniska tub och noggrant overlay utspädda blodet ovanpå täthet lutning medium, undvika någon blandning mellan täthet lutning medium och utspädda blod.
Obs: Detta är ett viktigt steg för en ordentlig separation av PBMC från röda blodkroppar. - Centrifugera vid 400 x g i 30 min i rumstemperatur (RT), med ingen broms för att undvika störningar av gränssnittet.
- Efter centrifugering, noggrant aspirera det övre lagret med pipett och kasta det, att uppmärksamma inte bort celler i gränssnittet mellan plasma och täthet lutning medium, som är där PBMC skiktas. Samla så många celler som möjligt från gränssnittet utan att röra röd cellpelleten längst ned i 50 mL koniska röret och överföring till en ny 50 mL koniska tub.
- Lägg till PBS för att föra den slutliga volymen till 25 mL och Invertera flera gånger för att blanda. Centrifugera vid 300 x g i 10 min vid RT med broms på ta bort täthet lutning medelstora föroreningar från cellsuspension.
- Sug ut supernatant utan störande cellpelleten noggrant. Lägg till PBS för att föra den slutliga volymen till 25 mL och Invertera flera gånger för att blanda. Centrifugera vid 200 x g i 10 min vid RT med bromsen vidare till ta bort trombocyter.
- Noggrant aspirera supernatanten utan att störa cellpelleten. Återsuspendera PBMC i 1 mL av PBS/0.1% natriumazid. Natriumazid minskar tak, sprider, internalisering av antikroppar och ökar cell återhämtning, men dess toxicitet kan försämra cellernas viabilitet. Av denna anledning bör natriumazid undvikas i alla steg om cellerna kommer vara odlade för efterföljande experiment. Cell isolering och färgning utan natriumazid gav liknande resultat till färgning utförs i närvaro av natriumazid.
Varning: Natriumazid kan orsaka död genom att påverka centrala nervsystemet. Kontakt kan orsaka frätskador på hud och ögon. - Späd cellerna för inventering genom att överföra 30 µL av PBMC i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör. Tillsätt sedan 120 µL av PBS och 150 µL av Trypan blå att bestämma antalet celler och livskraft (1:10 cell utspädning). Blandas noga.
- Över 10 µL till en hemocytometer, räkna cellerna följaktligen att använda räkna kammare och bestämma antalet livskraftiga celler. Viabla celler = antal Trypan blå negativa celler summa x 10 (utspädningsfaktorn används i detta protokoll) x 104.
Obs: I genomsnitt, 7-15 x 106 i PBMC bör samlas in från 10 mL blod. - Att resuspendera cellerna på 10 x 106 per mL PBS/0.1% natriumazid
Obs: PBMC kan frysas och lagras i flytande kväve för en längre tidsperiod. Uttryck av markörer såsom chemokine receptorer kan dock ändras genom detta förfarande.
- Dra blod i en 10 mL grön-topp rör innehållande natriumheparin. Efter att röret fyllts med blod, Invertera omedelbart röret flera gånger för att förhindra koagulering.
-
Beredning av celler från frysta PBMC
Obs: olika frysning förfaranden kan påverka cell återhämtning och livskraft12. PBMC för dessa experiment frystes speciellt framtagen frysning media eller fetalt bovint serum (FBS)/10% dimetyl sulfoxid (DMSO) med liknande resultat.
Varning: DMSO kan vara något farligt vid inandning (lung irriterande), hudkontakt (irriterande, permeator), av ögonkontakt (irriterande), efter intag.- Ta bort frusna PBMC från flytande kväve och placera på isen. Över cryovial från isen direkt i 37 ° C vattenbad. Hålla cryovial på vattenytan och skaka flaskorna försiktigt tills en liten is pellet återstår. Överföra cryovial tillbaka på is.
- Ta bort eventuellt vatten med en 70% etanol sprejade torka. Tillsätt 1 mL PBS/0.1% natriumazid vid 4 ° C och noggrant överföra cellen till en 15 mL koniska rör. Tillsätt långsamt kallt PBS/0.1% natriumazid vid 4 ° C att nå en slutlig volym av 15 mL.
- Centrifugera vid 300 x g i 10 min. Ta försiktigt bort den supernatant, omsuspendera cellerna i 1 mL PBS/0.1% natriumazid.
Obs: Cellerna kan också vara resuspended i RPMI 10% FBS med liknande resultat. - Späd till cellen för att räkna genom att överföra 30 µL av PBMC i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör. Tillsätt sedan 120 µL av PBS och 150 µL av Trypan blå att bestämma antalet celler och livskraft (1:10 cell utspädning). Blandas noga.
- Över 10 µL till en hemocytometer, räkna cellerna följaktligen att använda räkna kammare och bestämma antalet livskraftiga celler. Viabla celler = antal Trypan blå negativa celler summa x 10 (utspädningsfaktorn används i detta protokoll) x 104.
- Att resuspendera cellerna på 10 x 106 per mL i PBS/0.1% natriumazid.
-
Beredning av celler från helblod
- Dra blod i en 10 mL grön-topp rör innehållande natriumheparin. Efter att röret fyllts med blod, Invertera omedelbart röret flera gånger för att förhindra koagulering.
Obs: Rör som innehåller andra antikoagulantia såsom EDTA eller natrium citrat kan användas med jämförbara resultat. Om en olika mängd blod samlas, ska följande steg i protokollet skalas med detta. - Överföra 200 µL helblod till ett 12 x 75 mm tak rör, tillsätt 2 µL av natriumazid och vortexa försiktigt i 2 s.
- Dra blod i en 10 mL grön-topp rör innehållande natriumheparin. Efter att röret fyllts med blod, Invertera omedelbart röret flera gånger för att förhindra koagulering.
2. cellen färgning
Obs: Att välja par fluorokromer med praktiskt taget ingen spektrala överlappning är viktiga för att minska spridningen av data på grund av hög spridningseffekter av en fluorokrom i annan fluorokrom detektorn. För att uppnå en optimal identifiering av al cell delmängder, ska fluorokromer med en hög quantum avkastning användas till exempel antikropp par PE-BV421 och PE-APC.
-
Färgning av färska och frysta PBMC
- Över 100 µL av PBMC (1 x 106 celler) till en plattan med 96 brunnar i V-botten.
Obs: Valfritt antal celler som är lägre än 1 x 106 kan användas med liknande resultat2. - Centrifugera vid 350 x g under 3 minuter vid RT och noggrant aspirera supernatanten utan att störa cellpelleten. Lägga till varje väl 100 µL av PBS som innehåller en live/dead fastställbara färgämne som reagerar med fria aminen på proteiner för 10 min att märka döda celler.
- Förbereda för varje prov 30 µL av en blandning som innehåller alla antikropparna (anti-CD3.-CD56, TCRγδ i fluorchrome och anti-CD4, CD8, CD19, CD14 i fluorchrome B). Koncentrationen av antikroppar anges i tabell 1 och tabell 2. I detta skede titrerad antikroppar mot olika målmolekyler och i olika fluorokromer kan läggas också (t.ex. tabell 3).
Obs: Antikroppar koncentration kan variera beroende på tillverkare och partinummer. Preliminära tester bör därför göras för att uppnå optimal signal. PBS, PBS/0.5% BSA, PBS/0.2% natriumazid eller PBS/0.5% BSA/0.1% natriumazid användes med liknande resultat för att späda antikroppar2. Cellen kan också färgas i volymer skiljer sig från 30 µL att enkelt integrera denna metod till redan befintliga färgprotokoll. - Centrifugera vid 350 x g under 3 minuter vid RT och noggrant aspirera supernatanten utan att störa cellpelleten. Lägg till antikroppar cocktail till varje brunn och resuspendera noggrant utan att generera bubblor. Inkubera i 30 min på RT i mörkret.
Obs: Det är möjligt att färga proverna vid 4 ° C med liknande resultat. - Tillsätt 150 µL av färgning buffert och centrifugera vid 350 x g i 3 min vid RT och noggrant aspirera supernatanten utan att störa cellpelleten. Att resuspendera cellerna i 200 µL av PBS och förvärva data på en flödescytometer. Om färgning volymer ändras, se till att minst en 20-fold utspädning av den ursprungliga antikropp blandningen brukade tvätta överskottet av antikroppar.
Obs: Färgade celler kan vara fast med i PBS/2% paraformaldehyd, förvaras i kylskåp vid 4 ° C över natten och sedan förvärvade på en flödescytometer följande dag.
Varning: Paraformaldehyd är skadligt vid förtäring och kan orsaka hudirritation
- Över 100 µL av PBMC (1 x 106 celler) till en plattan med 96 brunnar i V-botten.
-
Färgning av helblod
- Till varje 12 x 75 mm utjämnade tube, lägga till cocktail av antikroppar (anti-CD3.-CD56, TCRγδ i fluorokrom och anti-CD4, CD8, CD19, CD14 i fluorokrom B) och inkubera vid RT i 30 min på RT i mörkret. Koncentrationen av antikroppar anges i tabell 4. I detta skede titreras antikroppar mot olika målmolekyler och i olika fluorokromer kan läggas också. Antikroppskoncentrationen kan variera beroende på tillverkare och partinummer. Preliminära tester bör därför göras för att uppnå optimal signal.
Obs: Det är möjligt att färga prover vid 4 ° C med liknande resultat. - Centrifugera vid 350 x g under 3 minuter vid RT och noggrant aspirera supernatanten utan att störa cellpelleten. Gör en 1 x lösning av röd blod cell lysis bufferten efter tillverkarens anvisningar.
Obs: Lysis lösningen bör vara RT före användning. - Tillsätt 2,0 mL 1 x lyseringsbuffert röda blodkroppar i varje rör, förslut väl och vänd flera gånger för att blanda. Täck med folie och Låt sitta i 15 min.
- Snurra ner på 300 x g för 5 min. noggrant aspirera supernatanten utan att störa cellpelleten.
- Tillsätt 2 mL PBS och centrifugera vid 300 x g i 5 min.
Obs: vid denna punkt, cellpelleten ska ha en blek vit färg som anger en lyckad röd blod cell lysis. Aspirera supernatanten för att inte störa cellpelleten noggrant och försiktigt resuspendera cellerna i 200 µL av PBS. - Sila cellerna genom 12 x 75 mm rör med 40 µm filter caps ta bort cell aggregat och förvärva data på en flödescytometer.
- Till varje 12 x 75 mm utjämnade tube, lägga till cocktail av antikroppar (anti-CD3.-CD56, TCRγδ i fluorokrom och anti-CD4, CD8, CD19, CD14 i fluorokrom B) och inkubera vid RT i 30 min på RT i mörkret. Koncentrationen av antikroppar anges i tabell 4. I detta skede titreras antikroppar mot olika målmolekyler och i olika fluorokromer kan läggas också. Antikroppskoncentrationen kan variera beroende på tillverkare och partinummer. Preliminära tester bör därför göras för att uppnå optimal signal.
3. antikroppstitrering
Obs: Titrering av antikroppar är det mest kritiska steget för att få hög kvalitet, reproducerbara data. Titrering av anti-CD3,-CD8,-CD14, - CD19 och -TCR γδ följer det normala förfarandet genom vilket koncentrationen av antikroppar mot optimalt separata positiva och negativa toppar härleds genom maximal färgning index13,14. Utspädningar på topp eller närmare toppen på fläcken index kurvan stigande sida bör vara markerad (Figur 1A-C). Anti-CD4 antikroppen titreras för att placera toppen av CD4 positiva befolkningen mellan CD3 enda positiva populationer och CD3 +/ CD8 + T celler, närmare till CD3 enda positiva signalen bättre diskriminera CD8dim befolkningarna (CD8 + γδ T-celler och NK T-celler). Längs samma linje, CD56 titrering syftar till position NK CD56+ celler mellan CD3+ och CD3– befolkning.
-
Maximala fläcken index kurva
Obs: titrering av anti-CD3,-CD8,-CD14, - CD19 och -TCR γδ följer det normala förfarandet genom vilket koncentrationen av antikroppar mot optimalt separata positiva och negativa toppar härleds av maximalt färgning index kurva15. Om antikroppar mot andra markörer läggs till på panelen, måste de också titreras med en kurva med maximal färgning i index.- Förbereda en 2-faldig antikropp utspädning genom att fylla 10 brunnar i en plattan med 96 brunnar med 40 µL av färgning buffert. I den första brunnen, öka den slutliga volymen till 80 µL av färgning buffert och Lägg antikroppen av intresse vid en koncentration av 4 gånger den koncentration som föreslås av tillverkaren.
- Blanda väl och överför 40 µL till andra väl. Blanda väl och upprepa detta för alla de andra brunnarna.
- Fläcken 10 prover av PBMC eller helblod med 30 µL av de 10 olika 2-faldig utspädningarna av antikroppar mot protokollet beskrivs innan.
- Förvärva data med en flödescytometer och rita signalen från varje utspädning (figur 1A).
- Grind på de negativa och positiva populationerna för varje koncentration. Ökad koncentration av antikroppar kan leda till en högre bakgrund. Därför, ändra storlek på negativa grinden med detta.
- För varje koncentration, extrahera information om median och standardavvikelse för fluorescerande intensiteten av negativa befolkningen och medianen för fluorescerande intensiteten av befolkningens positiva. Beräkna för varje koncentration indexet fläcken med denna formel: (median fluorescerande intensitet av befolkningens positiva — median fluorescerande intensitet av negativa befolkningen) ÷ (2 x standardavvikelsen av fluorescerande intensiteten i den negativa befolkningen) (figur 1B).
- Rita den fläck index vs. antikroppkoncentrationen uttryckt som andel av antikropp utspädning (t.ex. 1:10 utspädning = 0,1), och identifiera koncentrationen av antikroppar med maximal fläcken indexvärdet (figur 1 c).
-
Anti-CD4 och -CD56 antikroppstitrering
Obs: Anti-CD4 och -CD56 antikroppar titrering är beroende av föregående titrering andra markörer i panelen två-fluorokrom. För anti-CD4 antikroppen titreringen syftar till att placera den anti-CD4 signal mellan de dubbla CD8+/CD3+ signal och CD3 enda positiva befolkningen (figur 1 d).- Titrera den anti-CD4 och CD56 antikroppar med en 2-faldig utspädning strategi som beskrivits tidigare, lägga till ytterligare koncentrationer i mellan för att fint identifiera spänna av koncentration som gör för att separera CD4+ T-celler och NK-celler från den andra cellen populationer.
- Titrera den anti-CD4-antikroppen genom att placera anti-CD4 signalen mellan de dubbla CD8+/CD3+ signal och CD3 enda positiva befolkningen (figur 1 d).
Obs: Särskild omsorg bör göras för att klart skilja CD4+ T celler från CD8+ dim populationer. - Titrera den anti-CD56 antikroppar efter en strategi som liknar antikroppstitrering som anti-CD4, genom att placera NK celler mellan de CD3-negativa och CD3-positiva befolkningarna.
4. gating strategi
-
Identifiera lymfatisk och monocytic cellpopulationer och ta bort döda celler och de flesta av de kvarvarande röda blodkropparna från analysen.
- Välj hela befolkningen som innehåller lymfocyter och monocyter baserat på framåt vs side scatter område (FSC-A vs SSC-A). Ta bort cellen aggregat från analys via framåt scatter höjd vs framåt scatter bredd (FSC-H vs FSC-W) och side scatter höjd vs side scatter bredd (SSC-H vs SSC-W).
- Använda en live/dead diskriminering markör för att utesluta ljusa positiva döda celler och kvarvarande röda blodkroppar från analysen. Grind på lymfocyter och monocyter som bygger på olika FSC-A och SSC-profilen.
-
Två-fluorokrom sju-markör usenets strategi av lymfatisk befolkningarna.
Obs: inom den positiva undergruppen för CD3, CD4+, CD8+ och γδ T-celler kan separeras med hjälp av antikroppar som enbart rikta den γδ-receptorn, CD4 och CD8. På ett jämförbart sätt, inom CD3 negativa undergruppen, kan B-celler, NK-celler och monocyter identifieras unikt med antikroppar mot CD19, CD56 och CD14, respektive.- Välj lymfocyter grinden och skapa en dot tomt med på varje axel en av två fluorokromer används i detta protokoll (figur 2B).
- Grind på CD8+ T celler som identifierats som CD3+/CD8+ dubbel positiva celler på det övre högra hörnet av dot-tomten (figur 2B). Utesluta dim CD8 befolkningen som kan innehålla NKT-celler. Grind på CD4+ T celler som identifierats som befolkningen mellan CD8+ T celler och CD3 enda positiva populationer. Grind på γδ T-celler som identifierats som hög CD3 celler. Indela γδ T-celler CD8 positiva och CD8 negativt.
- Grind på NK identifierats som befolkningen mellan CD3-positiva och CD3-negativa celler. Dela upp NK celler CD8 positiva och CD8 negativt. Grind på B-celler som identifierats som CD3-negativ CD19+ befolkningen på den högra nedre hörnet av dot tomten.
- Välj monocyt grindarna och skapa en dot tomt med på varje axel en av två fluorokromer används i detta protokoll (figur 2 c). Grind på CD3–/CD14+ befolkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Setup och analys av ett flöde flödescytometri experiment av mänskliga perifera blodceller färgas med sju lineage markörer (anti-CD3,-CD4,-CD8, -CD14,-CD19, - CD56 och -TCR γδ antikroppar) med hjälp av endast två fluorokromer presenteras.
Representativa resultat beskrivs för anti-CD8 och -CD56 antikroppstitrering. För varje antikropp (i det här exemplet anti-CD8), data från tio successiv 2-faldig utspädning registrerades för att beräkna en fläck index kurva (Figur 1A-C). Optimal antikroppskoncentrationen bestämdes av den maximala fläck index signal13,14. Utspädningar på topp eller närmare toppen på fläcken index kurvan stigande sida bör väljas. Anti-CD4 och -CD56 antikroppar var titreras genom färgning perifera blodkroppar tillsammans med andra markörer i panelen två-fluorokrom (tidigare titrerat). För anti-CD4 antikroppen, titreringen bör sträva efter att placera anti-CD4 signalen mellan de dubbla CD8+/CD3+ signal och CD3 enda positiva befolkningen (figur 1 d). Särskild omsorg bör göras för att klart skilja CD4+ T celler från CD8+ dim populationer. PBMC var fläckad med optimala koncentrationen av de angivna markörerna och olika koncentrationer av anti-CD4. Färgkod av koncentrationer: grön anger koncentrationer som resulterar i en optimal separation av CD4+ T celler från andra CD3+populationer; orange betyder koncentrationer som resulterar i en godtagbar men inte perfekt separation; rött anger koncentrationer som resulterar i dålig separation av CD4+ T celler från dim CD8 celler eller CD4/CD8 dubbel negativ populationer. Anti-CD56 titreringen utfördes på ett liknande sätt som anti-CD4 antikroppen, genom att placera NK celler mellan CD3–negativa och CD3-positiva befolkningarna.
Representant gating strategi visar hur man identifierar lymfatisk och monocytic cellpopulationer och bort från analysen döda celler och de flesta av de kvarvarande röda blodkropparna (figur 2A). Alla efterföljande analysen baserades på denna usenets strategi. Representant gating strategi används för att identifiera CD4+ och CD8+ T celler, γδ T-celler, B-celler, NK-celler och monocyter i två fluorokrom-sju markör färgningen (figur 2B-C).
Representativa negativa resultat härleder från felaktig provberedning och titrering av anti-CD4 och -CD56 antikroppar. Underlåtenhet att korrekt titrera CD4 resulterar i dålig separation av CD4+ T celler från CD8+ T cells (figur 3A), medan en dålig CD56 titrering kan leda till en dålig separation av NK från B-celler och celler negativt för alla markörer i den färgning panel ( Figur 3B). Stackars RBC Lys kan uppstå med helblod färgning. Om det primära målet i protokollet är att beräkna procentandelen av annan cell befolkningen (t.ex. % av CD4+ T celler), förorening med RBC dubbel negativ celler, som visas i dot tomten som dubbel negativ befolkningen, bör undantas från analysen (figur 3 c). Baserat på vår erfarenhet med detta protokoll, har vi märkt att korrekt åtskillnad mellan B-celler och NK CD8+ celler kan verifieras med hjälp av andra markörer. Som ett exempel är NK-celler dubbel negativ för HLA-DR och CCR6, medan B-celler är dubbel positiv (figur 3D).
Det protokoll som presenteras i detta manuskript är tänkt att vara en del av en multicolor färgning panel att förhöra flera immun populationer i prover med begränsat antal celler. Genom att använda detta tillvägagångssätt, undersökte vi dynamics i immun populationer av längsgående prover från givare med multipelt myelom som fick en stamcellstransplantation (Clinicaltrials.gov NCT0056609816). Fryst PBMC samlades in och analyseras med flödescytometri på dag 0, 14, 28, 60, 180, 360 efter transplantation. Genom att använda detta tillvägagångssätt, vi kunde förhöra flera lymfocyter populationer med fokus på deras naiva/minne profil (CD45RA, CCR7), aktivering och cell utmattning status (HLA-DR, CD57, CD45RA + effektor minne, CD16), och T effektor fenotyp (CCR4, CCR6, CXCR3) i en enda färgning panel17,18,19,20,21,22,23,24,25 , 26. detta har varit särskilt användbart med tanke på att antalet insamlade celler för vissa patienter och tidpunkter var knappt tillräckliga för bara en enda färgning panel. Representant gating strategi (figur 4) och dynamiken i markerad cellpopulationer (figur 5) av en skovvis patient över tid. Multipelt myelom B kan celler uttrycker NK markören CD56. För att utesluta denna möjlighet, använde vi HLA-DR och CCR6 att ytterligare differentiera B-celler från NK-celler (figur 4B). CD8+ minne och naiva T-celler identifierades genom uttryck för CD45RA och CCR7: naiva (CD45RA+/CCR7+), centrala minnes (CM, CD45RA–/CCR7+), effektor minne (EM, CD45RA–/CCR7- ) och effektor minne CD45RA+ (EMRA, CD45RA+/CCR7+) (figur 4 c). Uttryck av HLA-DR och CD57 i CD8+ naiv, totalt minne T celler (som består av CM, EM och EMRA), CM, EM och EMRA (figur 4 d). CD4+ minne och naiva T-celler identifierades genom uttryck för CD45RA och CCR7: naiva (CD45RA+/CCR7+), centrala minnes (CM, CD45RA–/CCR7+), effektor minne (EM, CD45RA–/CCR7- ) och effektor minne CD45RA+ (EMRA, CD45RA+/CCR7+) (figur 4E). HLA-DR och CD57 uttryck i CD4+ naiv och minne befolkningen (som består av CM, EM och EMRA), CM, EM och EMRA (figur 4F). CCR4 och CCR6 användes som markörer för att identifiera inom minne befolkningen Th9 CD4+ T cells (figur 4 g). Th1, Th1/17, Th2 och Th17 CD4+ T helper subpopulations identifierades genom uttryck av CCR4, CCR6 och CXCR3 (figur 4 H). CD16 och CD57 uttryck i NK-celler (figur 4I). Stamceller transplantation resulterade i en ihållande CD4+ och CD8+ T cellaktivering som visas av ökat uttryck av HLA-DR och CD57 och i en snedmejsel T Helper till ett Th1-fenotypen. På dag 60 augmented procentandelen av B-celler dramatiskt att förutsäga den tålmodiga recidiv (figur 5).
Figur 1: representativa antikroppstitrering. (A) Dot tomt visar CD8 uttryck på färska PBMC färgas med den avlästa koncentrationen av antikropp. (B) tabell representerar median och standardavvikelse fluorescerande intensiteten i CD8+, median fluorescerande intensitet CD8– befolkning och härledda fläcken indexet för varje koncentration som testats. (C) diagrammet visas hur till derivat den optimala koncentrationen av antikroppen som en funktion av fläcken index. (D) representativa titrering av CD4 antikropp. Panelen D har ändrats från Boin et al. 20172. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa gating strategi och resultat av delpopulationer diskriminering. (A) Schematisk bild av doublet utslagning, levande celler diskriminering och storlek-baserade gating av lymfocyter och monocyter. (B) lymfocyter delpopulationer identifieras med två fluorokrom inställning. (C) monocyter identifierat två fluorokrom synsätt. Figuren har ändrats från Boin et al. 20172. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa resultat erhållits från felaktig prov separation och fel antikroppstitrering. (A) felaktiga titrering av CD4 antikropp resulterar i dålig upplösning mellan CD4+ och CD8+ populationer. (B) dålig CD56 titrering kan leda till en dålig separation av NK från B-celler. (C) effekten av RBC ofullständig Lys på subpopulations diskriminering. (D) exempel på användning av andra markörer att verifiera korrekt åtskillnad mellan B-celler och NK-celler: B-celler är HLA-DR och CCR6 dubbel positiv, medan NK-celler är dubbel negativ. Panelen D har ändrats från Boin et al. 20172. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Gating strategi för att analysera prover från en patient med multipelt myelom. (A) lymfocyter var gated på grundval av deras FSC-A och SSC-området och deras flöde flödescytometrisk profil med två-fluorokrom immun-cell färgningen visas. (B) Separation av NK och B celler med CCR6 och HLA-Dr (C) Gating strategi för att identifiera CD8+ minne och naiva T-celler. (D) uttryck av HLA-DR och CD57 i CD8+ naiv och minne T-celler. (E) Gating strategi för att identifiera CD4+ minne och naiva T-celler. (F) HLA-DR och CD57 uttryck i CD4+ naiv och minne T-celler. (G) identifiering av Th9 CD4+ T celler (H) identifiering av Thelper CD4+ T cell subpopulationer (jag) CD16 och CD57 uttryck i NK-celler. Figuren har anpassats från Boin et al. 20172. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: dynamiken i cell befolkningen hos patient med multipelt myelom. (A) dynamiskt av stora lymfocyter befolkningen i PBMC isolerade och fryst tillstånd på den angivna dagen efter stamcellstransplantation (SCT). (B) karakterisering av CD8 subpopulations över tid. (C) karaktärisering av CD4 subpopulations över tid. (D) analys av NK delmängder. Data har varit ritas med GraphPad Prism. Figuren har anpassats från Boin et al. 20172. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Mål | Klon | Fluorokrom | Leverantör | Koncentration | Syfte |
| CD3 | UCHT1 | BV421 | BD | 1/20 | Härstamning |
| CD56 | NCAM16.2 | BV421 | BD | 1/900 | |
| TCRΓΔ | B1 | BV421 | Bio | 1/30 | |
| CD4 | RPA-T4 | PE | BD | 1/450 | |
| CD8 | RPA-T8 | PE | BD | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | PE | BD | 1/15 | |
| CD19 | HIB19 | PE | BD | 1/300 | |
| Döda celler | L/D blå | LT | 1/300 | Live/Dead diskriminering | |
| BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Life Technologies | |||||
Tabell 1: Antikropp-panelen som används för de två-fluorokrom immun-cell färgning av PBMC (BV421-PE kombination).
| Mål | Klon | Fluorokrom | Leverantör | Koncentration | Syfte |
| CD3 | UCHT1 | APC | BD | 1/20 | Härstamning |
| CD56 | NCAM16.2 | APC | BD | 1/60 | |
| TCRΓΔ | B1 | APC | Bio | 1/30 | |
| CD4 | RPA-T4 | PE | BD | 1/450 | |
| CD8 | RPA-T8 | PE | BD | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | PE | BD | 1/15 | |
| CD19 | HIB19 | PE | BD | 1/300 | |
| Döda celler | L/D blå | LT | 1/300 | Live/Dead diskriminering | |
| BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Life Technologies | |||||
Tabell 2: Antikropp panel används för de två-fluorokrom immun-cell färgning av PBMC (APC-PE kombination).
| Mål | Klon | Fluorokrom | Katalog | Leverantör | Koncentration | Syfte |
| CD3 | UCHT1 | BV421 | 562426 | BD | 1/20 | Härstamning |
| CD56 | NCAM16.2 | BV421 | 562751 | BD | 1/900 | |
| TCRΓΔ | B1 | BV421 | 331217 | Bio | 1/30 | |
| CD4 | RPA-T4 | PE | 555347 | BD | 1/450 | |
| CD8 | RPA-T8 | PE | 555367 | BD | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | PE | 555398 | BD | 1/15 | |
| CD19 | HIB19 | PE | 555413 | BD | 1/300 | |
| CCR7 | G043H7 | AF647 | 353217 | Bio | 1/30 | Differentiering |
| CD45RA | HI100 | APC-H7 | 560674 | BD | 1/60 | |
| CCR4 | 1 G 1 | PE-Cy7 | 561034 | BD | 1/60 | Th delmängder |
| CCR6 | G034-E3 | BV605 | 353419 | Bio | 1/30 | |
| CXCR3 | 1C 6/CXCR3 | AF488 | 561730 | BD | 1/30 | |
| CD57 | NK-1 | PE-CF594 | 562488 | BD | 1/900 | Aktivering/utmattning |
| HLA-DR | G46-6 | BV510 | 563083 | BD | 1/30 | |
| CD16 | 3 G 8 | BUV395 | 563784 | BD | 1/30 | NK, monocyt aktivering |
| Döda celler | L/D blå | L-23105 | LT | 1/300 | Live/Dead diskriminering | |
| BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Life Technologies | ||||||
Tabell 3: Antikropp panel används för att färga fryst PBMC från en patient med multipelt myelom.
| Mål | Klon | Fluorokrom | Leverantör | Koncentration | Syfte |
| CD3 | UCHT1 | BV421 | BD | 1/80 | Härstamning |
| CD56 | NCAM16.2 | BV421 | BD | 1/400 | |
| TCRΓΔ | B1 | BV421 | Bio | 1/200 | |
| CD4 | RPA-T4 | PE | BD | 1/1200 | |
| CD8 | RPA-T8 | PE | BD | 1/100 | |
| CD14 | M5E2 | PE | BD | 1/80 | |
| CD19 | HIB19 | PE | BD | 1/300 | |
| Döda celler | L/D blå | LT | 1/300 | Live/Dead diskriminering | |
| BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Life Technologies | |||||
Tabell 4: Antikropp panel används för två-fluorokrom immun-cell färgningen helblod (BV421-PE kombination).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det protokoll som presenteras här har visat sig vara ganska flexibel och okänsliga för förändringar i färgning buffert, temperatur och perifera blodkroppar förberedelser på grund av det höga uttrycket av lineage markörer på cellytan. Det mest kritiska steget för att få hög kvalitet, reproducerbara data är titrering av antikroppar. Att notera, eftersom titrering av antikroppar ska alltid utföras under installationen av en flöde flödescytometrisk panel, detta steg inte till extra bänk-tid till vår två-fluorokrom strategi. Titrering av anti-CD3,-CD8,-CD14, - CD19 och -TCR γδ följer det normala förfarandet genom vilket koncentrationen av antikroppar mot optimalt separata positiva och negativa toppar härleds genom maximal färgning index13,14. Utspädningar på topp eller närmare toppen på fläcken index kurvan stigande sida bör vara markerad (figur 1A-C). Däremot, behöver en ad hoc-titrering av antikroppar mot anti-CD4 och anti-CD56 utföras. Anti-CD4 antikroppen titreras för att placera toppen av CD4 positiva befolkningen mellan CD3 enda positiva populationer och CD3+/CD8+ T celler, närmare till CD3 enda positiva signalen bättre diskriminera den CD8dim populationer ( CD8+ γδ T-celler och NK T-celler). Längs samma linje, CD56 titrering syftar till position NK CD56+ celler mellan CD3+ och CD3 befolkningen. Naturligt lägre uttrycket av CD56 enklare titrering av denna antikroppar med koncentrationen att använda nära det värde som erhålls i en mättnad kurva. Med hög quantum avkastning fluorokromer är en annan kritisk faktor för en optimal separation av flera markörer/populationer på samma detektorn. Vi fick framgångsrika resultat med APC, BV421 och PE, men andra fluorokromer, såsom den nya generationen av polymer dye, bör ge jämförbara resultat. För att minska risken för artefakter på grund av ersättning, är det också viktigt att välja ett par fluorokromer med liten, om någon, spektrala överlappning, såsom APC, eller PE, PE och BV421. Att välja par fluorokromer med praktiskt taget ingen kompensation är viktiga för att minska spridningen av data på grund av hög spridningseffekter av en fluorokrom i annan fluorokrom detektorn. Sprida minskning underlättar gating immun subpopulations genom att minimera signaldistorsion och gör det möjligt för att använda denna metod, om begränsat till två fluorokromer, utan behov av ersättning kontroller.
Kombinationen av markörer som vi föreslagit är mycket anpassningsbar utifrån krav som utredare. Faktiskt, några av markörerna kan uteslutas från analysen om de inte hänvisar till en befolkning av intresse. Det är exempelvis möjligt att ta bort anti-CD19 antikroppen att utesluta B-celler eller anti-CD4 antikroppen att fokusera endast på CD8+ T celler. Notera, anti-CD8 antikropp är viktigt att identifiera CD8+ NK celler och γδ T-celler, och bör därför inte tas bort från panelen. För att förbättra avskiljningen av sällsynta cellpopulationer, kan andra fluorokromer/detektorerna användas för vissa av markörerna för två-fluorokrom färgningen. Som ett exempel, kan CD56 flyttas till en annan detektor upptäcka NKT-celler, vilket inte är möjligt med två-fluorokrom panelen. Det är möjligt att minska antalet markörer från panelen, bör försiktighet utövas i lägga till, ändra eller byta markörer.
Förutsatt att de nödvändiga instrumentering, antikroppar och skicklighet, metoden standard en fluorokrom en markör är fortfarande det mest exakta sättet att identifiera flera immun befolkning och diskriminera sällsynta subpopulations, såsom NKT eller γδ T-celler. Det primära målet för denna metod är dock inte att ersätta den klassiska metoden, utan snarare för att uppnå en djup immunophenotyping när du arbetar med instrument med ett lågt antal detektorer eller prover med begränsat antal celler, samtidigt minska komplexiteten och kosta i inrättandet av det experimentella systemet. Vi har gjort omfattande screening av kliniska prover från patienter med multipelt myelom, systemisk skleros, dermatomyosit och Borrelia visar att denna färgningsproceduren kan förbättra samtidiga förhör av flera populationer med begränsad antalet celler. Våra resultat har hittills visat att detta förfarande är okänslig för kronisk immunsystemets aktivering eller infektionssjukdom, men Preliminär testning bör utföras för att bedöma riktigheten av detta protokoll i olika sjukdomstillstånd.
Framtida inriktningar att ytterligare stärka potentialen i detta protokoll omfattar studier för att karakterisera infiltrera lymfocyter i primära vävnader från kliniska prover. Detta är relevant för tumör och autoimmun sjukdom immunologi där detta tillvägagångssätt kan ge ovärderlig information för analys av prover med begränsat material. Vi planerar att testa denna panel på permeabilized celler att expandera potentialitet för att upptäcka cytokin uttryck och signalmolekyler på samma kliniska prover. Det bör slutligen noteras att liknande metoder, som syftar till att utöka antalet inspelningsbara markörer, skulle också kunna utvecklas med hjälp av olika uppsättningar av markörer och kan också vara utvecklade hög djurmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av National Institute of Arthritis och muskuloskeletala systemet och hudsjukdomar, < https://www.niams.nih.gov/>, award nummer P30-AR053503; Stabilare stiftelsen, www.stablerfoundation.org; Nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; Nina Irland Program för Lung hälsa (NIPLH), https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD3 | BD Biosciences | 562426 | Antibody for staining RRID: AB_11152082 |
| CD56 | BD Biosciences | 562751 | Antibody for staining RRID: AB_2732054 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331217 | Antibody for staining RRID: AB_2562316 |
| CD4 | BD Biosciences | 555347 | Antibody for staining RRID: AB_395752 |
| CD8 | BD Biosciences | 555367 | Antibody for staining RRID: AB_395770 |
| CD14 | BD Biosciences | 555398 | Antibody for staining RRID: AB_395799 |
| CD19 | BD Biosciences | 555413 | Antibody for staining RRID: AB_395813 |
| CD3 | BD Biosciences | 555335 | Antibody for staining RRID: AB_398591 |
| CD56 | BD Biosciences | 555518 | Antibody for staining RRID: AB_398601 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331211 | Antibody for staining RRID: AB_1089215 |
| CCR7 | Biolegend | 353217 | Antibody for staining RRID: AB_10913812 |
| CD45RA | BD Biosciences | 560674 | Antibody for staining RRID: AB_1727497 |
| CCR4 | BD Biosciences | 561034 | Antibody for staining RRID: AB_10563066 |
| CCR6 | BD Biosciences | 353419 | Antibody for staining RRID: AB_11124539 |
| CXCR3 | BD Biosciences | 561730 | Antibody for staining RRID: AB_10894207 |
| CD57 | BD Biosciences | 562488 | Antibody for staining RRID: AB_2737625 |
| HLA-DR | BD Biosciences | 563083 | Antibody for staining RRID: AB_2737994 |
| CD16 | BD Biosciences | 563784 | Antibody for staining RRID: AB_2744293 |
| Dead cells | Life technologies | L-23105 | Live/dead discrimination |
| Falcon 5 mL round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Falcon 5 mL round-bottom polystyrene test tube | BD Bioscience | 352001 | to stain whole blood |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo fisher | 12648010 | Freezing cells |
| 96-well V-bottom plate | Thermo fisher | 249570 | plate for staining |
| FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| FCS Express 6 | De Novo Software | FACS analysis | |
| Graphpad Prism | GraphPad software | Data analysis |
References
- Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. A deep profiler's guide to cytometry. Trends in Immunology. 33 (7), 323-332 (2012).
- Boin, F., et al. Flow cytometric discrimination of seven lineage markers by using two fluorochromes. PLoS ONE. 12 (11), (2017).
- Zola, H., et al. Leukocyte and Stromal Cell Molecules: The CD Markers. , Wiley. (2007).
- Lambert, C., Genin, C. CD3 bright lymphocyte population reveal γδ T cells. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 61 (1), 45-53 (2004).
- Ginaldi, L., et al. Differential expression of T cell antigens in normal peripheral blood lymphocytes: a quantitative analysis by flow cytometry. Journal of Clinical Pathology. 49 (7), 539-544 (1996).
- Park, J., Han, K. Single-color Multitarget Flow Cytometry Using Monoclonal Antibodies Labeled with Different Intensities of the Same Fluorochrome. Annals of Laboratory Medicine. 32 (3), 171-176 (2012).
- Mansour, I., et al. Triple labeling with two-color immunoflorescence using one light source: A useful approach for the analysis of cells positive for one label and negative for the other two. Cytometry. 11 (5), 636-641 (1990).
- Bocsi, J., Melzer, S., Dähnert, I., Tárnok, A. OMIP-023: 10-Color, 13 antibody panel for in-depth phenotyping of human peripheral blood leukocytes. Cytometry Part A. 85 (9), 781-784 (2014).
- Van Dongen, J. J. M., et al. EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia. 26 (9), 1908-1975 (2012).
- Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. Fluorescence-intensity multiplexing: Simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry. Cytometry Part A. 61 (2), 142-152 (2004).
- Rühle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry. International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).
- Hønge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., Møller, B. K., Erikstrup, C. Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry. PLOS ONE. 12 (11), e0187440 (2017).
- Roederer, M. K. FACS analysis of lymphocytes. Handbook of Experimental Immunology. 49, Blackwell Science. (1997).
- Srivastava, P., Sladek, T. L., Goodman, M. N., Jacobberger, J. W. Streptavidin-based quantitative staining of intracellular antigens for flow cytometric analysis. Cytometry. 13 (7), 711-721 (1992).
- Maecker, H. T., et al. Selecting fluorochrome conjugates for maximum sensitivity. Cytometry Part A. , (2004).
- Noonan, K. A., et al. Adoptive transfer of activated marrow-infiltrating lymphocytes induces measurable antitumor immunity in the bone marrow in multiple myeloma. Science Translational Medicine. 7 (288), (2015).
- Mahnke, Y. D., Beddall, M. H., Roederer, M. OMIP-017: Human CD4+ helper T-cell subsets including follicular helper cells. Cytometry Part A. 83 (5), 439-440 (2013).
- Bonecchi, R., et al. Differential Expression of Chemokine Receptors and Chemotactic Responsiveness of Type 1 T Helper Cells (Th1s) and Th2s. The Journal of Experimental Medicine. 187 (1), 129-134 (1998).
- Acosta-Rodriguez, E. V., et al. Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells. Nature Immunology. 8 (6), 639-646 (2007).
- Rivino, L., et al. Chemokine Receptor Expression Identifies Pre-T Helper (Th)1, Pre-Th2, and Nonpolarized Cells among Human CD4+ Central Memory T Cells. The Journal of Experimental Medicine. 200 (6), 725-735 (2004).
- Ye, Z. -J., et al. Differentiation and recruitment of Th9 cells stimulated by pleural mesothelial cells in human Mycobacterium tuberculosis infection. PloS One. 7 (2), e31710 (2012).
- Speiser, D. E., et al. Human CD8+ T cells expressing HLA-DR and CD28 show telomerase activity and are distinct from cytolytic effector T cells. European Journal of Immunology. 31 (2), 459-466 (2001).
- Caruso, A., et al. Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation. Cytometry. 27 (1), 71-76 (1997).
- Brenchley, J. M., et al. Expression of CD57 defines replicative senescence and antigen-induced apoptotic death of CD8+ T cells. Blood. 101 (7), 2711-2720 (2003).
- Palmer, B. E., Blyveis, N., Fontenot, A. P., Wilson, C. C. Functional and Phenotypic Characterization of CD57+CD4+ T Cells and Their Association with HIV-1-Induced T Cell Dysfunction. The Journal of Immunology. 175 (12), 8415-8423 (2005).
- Focosi, D., Bestagno, M., Burrone, O., Petrini, M. CD57+ T lymphocytes and functional immune deficiency. Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 107-116 (2010).
