Summary
Aqui, apresentamos um protocolo de fluxo cytometric para identificar CD4+ e CD8+ T células, as células γδ T, células B, células NK e monócitos no sangue periférico humano usando apenas dois fluorochromes em vez de sete. Com esta abordagem, cinco marcadores adicionais podem ser gravadas na maioria dos citômetros.
Abstract
Caracterização de células imunes depende fortemente de citometria de fluxo multicolor para identificar subpopulações baseadas na expressão diferencial de marcadores de superfície. A instalação de um painel multicolor clássico exige instrumentos high-end, anticorpos etiquetados personalizados e cuidadoso estudo design para minimizar a sobreposição espectral. Desenvolvemos uma análise Multiparamétrico para identificar grandes populações imunes humanas (CD4+ e CD8+ T células, as células γδ T, células B, células NK e monócitos) no sangue periférico pela combinação de sete marcadores de linhagem usando apenas dois fluorochromes. Nossa estratégia é baseada na observação de que marcadores de linhagem constantemente são expressos em uma combinação única de cada população de células. Combinar essas informações com uma titulação cuidadosa dos anticorpos permite que os investigadores gravar cinco marcadores adicionais, ampliando o limite óptico da maioria dos citômetros. Head-to-comparação demonstrou que a grande maioria das populações de células imunes no sangue periférico pode ser caracterizada com precisão comparável entre nosso método e a clássico "abordagem um fluorocromo-um marcador", embora este último ainda é mais precisos para a identificação de populações, tais como células NKT e γδ T células. Combinar sete marcadores usando dois fluorochromes permite a análise de populações de células imunes complexos e amostras clínicas em 6-10 acessível fluorocromo citômetros e até mesmo em instrumentos de campo 2-3 fluorocromo em áreas com recursos limitados. Instrumentos high-end podem também beneficiar esta abordagem usando fluorochromes extras para realizar análise de citometria de fluxo mais profunda. Essa abordagem também é muito bem adequada para a seleção de várias populações de células, no caso de amostras clínicas, com número limitado de células.
Introduction
Citometria de fluxo é uma técnica que foi desenvolvida para analisar vários parâmetros em partículas simples a uma taxa de vários milhares de eventos por segundo1. Exemplos de espécimes analisados por citometria de fluxo incluem, mas não estão limitados a, células, miçangas, bactérias, vesículas e cromossomos. Um sistema fluídico direciona as partículas no ponto de interrogação, onde cada partícula cruza seu caminho com lasers de um ou mais, e vários parâmetros são gravados para posterior análise. Espalha para a frente e lateral, gerada pela dispersão da luz do laser puro, é usadas para identificar a população-alvo e recuperar informações sobre o tamanho relativo e a complexidade interna/granularidade de partículas, respectivamente. Todos os outros parâmetros, que representam a maioria dos dados em uma análise do fluxo cytometric, são derivados pelo fluorocromo-rotulado de sondas que reconhecem e ligam para alvos específicos das partículas de interesse.
Citometria de fluxo é uma principal ferramenta para estudos imunológicos identificar e caracterizar as populações de células. Para dissecar a complexidade do sistema imunológico, multicoloridos painéis estão constantemente evoluindo para ampliar o número de marcadores simultaneamente gravada para immunophenotyping profunda da célula populações1. Isso está levando ao desenvolvimento de instrumentos mais capazes e fluorochromes, com recentes citômetros high-end, excedendo 20 parâmetros fluorescentes. Isso resulta em projeto de estudo complexo devido à sobreposição espectral fluorocromo e em custos mais elevados associados com operadores qualificados e rotulagem de anticorpo personalizado. Em vários casos, complexidade e os custos são reduzidos usando painéis separados de marcadores para populações de células diferentes. Esta abordagem, no entanto, está sujeita a erros, reduz as informações em cada painel e pode ser difícil de aplicar a amostras com um número limitado de células. Além disso, aumentar o número de marcadores impede profunda immunophenotyping em instrumentos com menos parâmetros fluorescentes. Anteriormente desenvolvemos um protocolo de coloração para identificar grandes populações imunes humanas (CD4+ e CD8+ T células, as células γδ T, células B, células NK e monócitos) em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) pela combinação de sete marcadores de linhagem usando apenas duas fluorochromes em vez dos sete necessário usando o tradicional "um fluorocromo-um marcador" abordagem (www.hcdm.org)2,3. Nosso relatório inicial explorado e validado a noção da combinação de sete marcadores em dois fluorochromes para immunophenotyping profundo. Neste relatório, nós apresentamos um protocolo passo a passo para isolar e manchar as células do sangue periféricas, enfocando o aspecto prático e solução de problemas etapas para alcançar uma coloração bem sucedida.
Este protocolo é baseado na observação de que os marcadores de linhagem tem uma expressão constante na superfície das células e que cada população de células tem uma exclusiva combinação de marcadores de linhagem. Em PBMC, CD3 expressão subdivide as células imunes em duas categorias principais: linfócitos T CD3 positivo e células CD3-negativo. Dentro do subgrupo positivo CD3, CD4+, CD8+ e células γδ T podem ser separadas usando anticorpos que se destinam exclusivamente a CD4, CD8 e o receptor do γδ. De forma comparável, dentro do subgrupo negativo CD3, células B, células NK e monócitos podem ser identificados exclusivamente usando anticorpos contra CD19, CD56 e CD14, respectivamente. Em uma abordagem padrão um fluorocromo-um marcador, anti-CD3,-CD4,-CD8, - CD14,-CD19-CD56 e - TCR γδ anticorpos são detectados com sete diferentes fluorochromes. Nossa abordagem combina anti-CD3 - CD56 e anticorpos de - TCR γδ em um fluorocromo (rotulada para fluorocromo conveniência A) e anti-CD4,-CD8, - CD14 e - CD19 anticorpos em um fluorocromo diferente (fluorocromo B). Isto é possível por uma combinação de titulação de anticorpos e expressão diferencial do antígeno. Ambos os CD4+ e CD8+ T células são positivas para o anticorpo anti-CD3 em fluocromo A, mas eles podem ser separados em fluorocromo B maximizar a expressão do sinal CD8 ao colocar, com uma titulação ad hoc, o sinal de CD4 entre o CD8 e as células de CD3 positivo-CD4/CD8 dupla negativa. As pilhas de T do γδ expressa o nível superior de CD3 CD4 e CD8, e, portanto, eles podem ser identificados como CD3 alta4. Este sinal é ainda mais impulsionado pela rotulagem γδ células T em fluocromo A com um anticorpos anti-TCR γδ, melhorando assim, a separação entre as pilhas de T CD3 baixas e as células de alta γδ T CD3. As células B podem ser identificadas como CD3– no fluocromo A e CD19+ em fluorocromo B. Para separar pilhas NK CD3 negativas de células B, um anticorpo anti-CD56 foi usado em fluocromo A como o anti-CD3. Isso é possível porque o CD56 expressa na célula NK em um nível muito inferior CD3 na T células5. Finalmente, os monócitos podem ser identificados através de uma combinação de propriedades de dispersão de lado para a frente e expressão de CD14 em fluorocromo B.
A ideia de combinar até quatro marcadores usando dois fluorochromes tem sido tentada já com êxito antes de7,6,8e tem sido usada em um protocolo clínico para identificar populações linfocítica malignas9 . Um relatório anterior combinada também sete marcadores (com diferente especificidade dos marcadores do que usamos em nosso protocolo) usar dois fluorochromes, mas esta abordagem baseou-se em um complexo de rotulagem de cada anticorpo com quantidade variável de fluorocromo10. Isto está em contraste com o nosso método que utiliza anticorpos comercialmente disponíveis e pode ser adaptado para a configuração do instrumento e pode tirar proveito da nova geração de fluorochromes de polímero.
O objetivo geral desta metodologia é expandir os limites ópticos da maioria dos citômetros, permitindo a gravação de cinco marcadores adicionais para interrogar populações de células complexas. Como consequência, avançado análise imunológica pode ser realizada em 6-10 acessível fluorocromo citômetros, e instrumentos de campo 2-3 fluorocromo podem alcançar resultados notáveis em áreas com recursos limitados. Instrumentos high-end podem também beneficiar esta abordagem usando fluorochromes extras para realizar análise de citometria de fluxo mais profunda e criar modular fluxo cytometric painéis como alvo várias linhagens no mesmo tempo11. Potencialmente, isso pode reduzir o número de painéis utilizados em citometria de fluxo immunophenotyping modular e reduzir custos, erros e tempo de manuseio. Essa abordagem também é muito bem adequada no caso de amostras clínicas, com número limitado de células.
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Protocol
Todos os estudos de materiais humanos foram aprovados pela Johns Hopkins institucional Review Board sob o Health Insurance Portability and Accountability Act. Amostras do paciente e controle foram de identificados. PBMC e sangue de controles saudáveis foram obtidos pelo consentimento informado.
Nota: Este protocolo foi testado em fresco ou congelado isoladas células de sangue periféricas e sangue total.
1. preparação da pilha
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Isolamento de células de sangue periféricos (PBMC) de sangue total
- Tirar sangue em um tubo de verde-top 10 mL contendo heparina de sódio. Depois que o tubo foi preenchido com sangue, imediatamente inverta o tubo várias vezes para evitar a coagulação.
Nota: Tubos contendo outro anticoagulante como ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) ou citrato de sódio podem ser usados com resultados comparáveis. Se uma quantidade diferente de sangue é coletada, as seguintes etapas no protocolo devem ser dimensionadas em conformidade. - Transferi cuidadosamente desenhada de sangue em um tubo cónico de 50 mL. Dilua o sangue com uma quantidade igual de solução salina tamponada fosfato (PBS) sem cálcio e magnésio.
- Adicionar 15 mL de meio de gradiente de densidade (por exemplo, Ficoll) para o fundo de um novo tubo cónico de 50 mL e cuidadosamente o sangue diluído em cima médio gradiente de densidade, evitando qualquer mistura de sobreposição entre o médio gradiente de densidade e o sangue diluído.
Nota: Este é um passo crítico para uma separação adequada de PBMC de células vermelhas. - Centrifugar a 400 x g durante 30 min à temperatura ambiente (RT), com nenhum freio para evitar o rompimento da interface.
- Após a centrifugação, cuidadosamente Aspire a camada superior, usando uma pipeta e descartá-lo, prestando atenção para não remover células na interface entre o plasma e densidade gradiente meio, que é onde PBMCs estratifica. Recolha o maior número de células possível através da interface sem tocar o pellet de células vermelhas na parte inferior do tubo cónico de 50 mL e transferência para um novo tubo cónico de 50 mL.
- Adicione PBS para trazer o volume final de 25 mL e inverter várias vezes para misturar. Centrifugar a x g durante 10 minutos a RT com o freio para remover qualquer contaminação médio gradiente de densidade da suspensão celular.
- Cuidadosamente Aspire o sobrenadante sem perturbar centrifugado. Adicione PBS para trazer o volume final de 25 mL e inverter várias vezes para misturar. Centrifugar a 200 x g durante 10 minutos a RT com o freio para remover as plaquetas.
- Aspire cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o centrifugado. Resuspenda PBMCs em 1 mL de PBS/0.1% de azida de sódio. Azida de sódio reduz tampando, derramamento, internalização dos anticorpos e aumento celular de recuperação, mas sua toxicidade pode prejudicar a viabilidade celular. Por esta razão, azida de sódio deve ser evitada em todas as etapas se as células vão ser cultivadas para experiências posteriores. Cela de isolamento e coloração sem azida sódica deram resultados semelhantes à mancha realizada na presença de azida de sódio.
Atenção: Azida de sódio pode causar a morte por afetar o sistema nervoso central. Contato pode causar queimaduras de pele e olhos. - Dilua as células de contagem através da transferência de 30 µ l de PBMC em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Em seguida, adicione 120 µ l de PBS e 150 µ l de Trypan azul para determinar o número de telemóvel e viabilidade (diluição de pilha 01:10). Resuspenda cuidadosamente.
- Transferi 10 µ l para um hemocytometer, contagem de células em conformidade para a contagem usado câmara e determinar o número de células viáveis. Células viáveis = número de Trypan azuis células negativas total x 10 (o fator de diluição usado neste protocolo) x 104.
Nota: Em média, 7-15 x 106 de PBMC devem ser coletadas de 10 mL de sangue. - Ressuspender as células em 10 x 106 de PBS/0.1% de azida de sódio por mL
Nota: PBMC pode ser congelado e armazenado em nitrogênio líquido, por um período prolongado de tempo. No entanto, a expressão de marcadores, tais como receptores de chemokine pode ser alterada por este procedimento.
- Tirar sangue em um tubo de verde-top 10 mL contendo heparina de sódio. Depois que o tubo foi preenchido com sangue, imediatamente inverta o tubo várias vezes para evitar a coagulação.
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Preparação de células de PBMC congelado
Nota: diferentes procedimentos de congelamento podem afetar12, de recuperação e viabilidade celular. PBMC por estas experiências foram congelado especialmente formulado de congelação mídia ou soro fetal bovino (FBS)/10% dimetilsulfóxido (DMSO) com resultados semelhantes.
Atenção: DMSO pode ser um pouco perigoso em caso de inalação (irritante pulmonar), contato (irritativa, permeator), de olhos (irritante), de ingestão de pele.- Remover PBMC congelado de nitrogênio líquido e coloque no gelo. Transferi o cryovial do gelo diretamente em banho-maria a 37 ° C. Manter o cryovial na superfície da água e agite-os frascos até que uma bola de gelo pequenas permanecem. Transferi o cryovial volta no gelo.
- Remova toda a água com uma toalhita de pulverizado de etanol 70%. Lentamente, adicione 1 mL de PBS/0.1% de azida de sódio a 4 ° C e transferir cuidadosamente a célula para um tubo cônico de 15 mL. Adicione lentamente o frio PBS/0.1% de azida de sódio a 4 ° C, para alcançar um volume final de 15 mL.
- Centrifugar x g por 10 min. Retire cuidadosamente o sobrenadante, Ressuspender as células em 1 mL de PBS/0.1% de azida de sódio.
Nota: As células também podem ser resuspended em RPMI 10% FBS com resultados semelhantes. - Dilua a célula para a contagem através da transferência de 30 µ l de PBMC em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Em seguida, adicione 120 µ l de PBS e 150 µ l de Trypan azul para determinar o número de telemóvel e viabilidade (diluição de pilha 01:10). Resuspenda cuidadosamente.
- Transferi 10 µ l para um hemocytometer, contagem de células em conformidade para a contagem usado câmara e determinar o número de células viáveis. Células viáveis = número de Trypan azuis células negativas total x 10 (o fator de diluição usado neste protocolo) x 104.
- Ressuspender as células em 10 x 106 / mL em PBS/0.1% de azida de sódio.
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Preparação de células de sangue total
- Tirar sangue em um tubo de verde-top 10 mL contendo heparina de sódio. Depois que o tubo foi preenchido com sangue, imediatamente inverta o tubo várias vezes para evitar a coagulação.
Nota: Tubos contendo anticoagulante outro como EDTA ou citrato de sódio pode ser usado com resultados comparáveis. Se uma quantidade diferente de sangue é coletada, as seguintes etapas no protocolo devem ser dimensionadas em conformidade. - Transferência de 200 µ l de sangue total para um tubo 12 x 75 mm tampado, adicionar 2 µ l de azida de sódio e vórtice delicadamente por 2 s.
- Tirar sangue em um tubo de verde-top 10 mL contendo heparina de sódio. Depois que o tubo foi preenchido com sangue, imediatamente inverta o tubo várias vezes para evitar a coagulação.
2. coloracao celular
Nota: Escolher os pares de fluorochromes com sobreposição praticamente não espectral é importante para reduzir a propagação de dados devido a alta repercussões de um fluorocromo no outro detector fluorocromo. Para conseguir uma identificação ideal da al os subconjuntos de célula, fluorochromes com um rendimento quântico alta devem ser usados como pares de anticorpo BV421-PE e PE-APC.
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Coloração de PBMC fresco e congelado
- Transferi 100 µ l de PBMC (1 x 106 células) para uma placa de V-fundo de 96 poços.
Nota: Qualquer número de células inferiores a 1 x 106 pode ser usado com resultados similares2. - Centrifugar a 350 x g por 3 min em RT e Aspire cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o centrifugado. Adicione a cada bem 100 µ l de PBS contendo um corante fixável ao vivo/morto que reage com a amina livre em proteínas para 10 min rotular as células mortas.
- Prepare-se para cada μL de amostra 30 de uma mistura que contém todos os anticorpos (anti-CD3.-CD56, TCRγδ na fluorchrome e anti-CD4, CD8, CD19, CD14 em fluorchrome B). Concentração de anticorpos são indicadas na tabela 1 e tabela2. Nesta fase, titulação de anticorpos contra moléculas-alvo diferentes e em diferentes fluorochromes podem ser adicionados também (por exemplo, a tabela 3).
Nota: Concentração de anticorpos pode variar dependendo do fabricante e número de lote. Portanto, testes preliminares devem ser feitos para conseguir o melhor sinal. PBS, PBS/0.5% BSA, azida sódica PBS/0.2% ou PBS/0.5% BSA/0.1% azida foram utilizados com resultados semelhantes para diluir a anticorpos2. Célula pode também ser manchada em volumes diferentes de 30 µ l de facilmente integrar esta metodologia para já existentes protocolos de coloração. - Centrifugar a 350 x g por 3 min em RT e Aspire cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o centrifugado. Adicione o cocktail de anticorpo a cada poço e ressuspender cuidadosamente sem gerar bolhas. Incube durante 30 min à RT no escuro.
Nota: É possível manchar as amostras a 4 ° C, com resultados semelhantes. - Adicionar 150 µ l de buffer de coloração e centrifugar a 350 x g por 3 min em RT e Aspire cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o centrifugado. Ressuspender as células em 200 µ l de PBS e aquisição de dados em um citômetro de fluxo. Se coloração volumes forem alterados, por favor certifique-se de pelo menos uma 20-fold diluição do anticorpo mix original usada para lavar o excesso de anticorpos.
Nota: Células coradas podem ser corrigidas com em PBS/2% paraformaldeído, conservadas no frigorífico a 4 ° C durante a noite e depois, no dia seguinte, adquiridas em um citômetro de fluxo.
Atenção: Paraformaldeído é prejudicial se ingerido e pode causar irritação da pele
- Transferi 100 µ l de PBMC (1 x 106 células) para uma placa de V-fundo de 96 poços.
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Mancha de sangue total
- A cada tubo 12 x 75 mm tampado, adicionar o coquetel de anticorpos (anti-CD3.-CD56, TCRγδ na fluorocromo e anti-CD4, CD8, CD19, CD14 em fluorocromo B) e incubar a RT por 30 min em RT no escuro. Concentração de anticorpos são indicadas na tabela 4. Nesta fase, titulação de anticorpos contra moléculas-alvo diferentes e em diferentes fluorochromes podem ser adicionados também. Concentração de anticorpo pode variar dependendo do fabricante e número de lote. Portanto, testes preliminares devem ser feitos para conseguir o melhor sinal.
Nota: É possível ficar manchado amostras a 4 ° C, com resultados semelhantes. - Centrifugar a 350 x g por 3 min em RT e Aspire cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o centrifugado. Fazer uma solução de 1x da lise de células vermelhas do sangue, seguindo as instruções do fabricante.
Nota: A solução de lise de RT deve atingir antes de usar. - Adicionar 2,0 mL de 1x tampão de lise de células vermelhas do sangue a cada tubo, tampe bem e inverter várias vezes para misturar. Cubra com papel alumínio e deixe descansar por 15 min.
- Spin para baixo a 300 x g por 5 min. Aspire cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o centrifugado.
- Adicione 2 mL de PBS e centrifugar a 300 x g por 5 min.
Nota: neste ponto, o centrifugado deve ter uma coloração branca pálida, indicando uma lise de sucesso células vermelhas do sangue. Aspire cuidadosamente o sobrenadante para não perturbar o centrifugado e suavemente Ressuspender as células em 200 µ l de PBS. - Coe as células através de tubos de 12 x 75 mm com 40 µm tampões de filtro para remover agregados de células e aquisição de dados em um citômetro de fluxo.
- A cada tubo 12 x 75 mm tampado, adicionar o coquetel de anticorpos (anti-CD3.-CD56, TCRγδ na fluorocromo e anti-CD4, CD8, CD19, CD14 em fluorocromo B) e incubar a RT por 30 min em RT no escuro. Concentração de anticorpos são indicadas na tabela 4. Nesta fase, titulação de anticorpos contra moléculas-alvo diferentes e em diferentes fluorochromes podem ser adicionados também. Concentração de anticorpo pode variar dependendo do fabricante e número de lote. Portanto, testes preliminares devem ser feitos para conseguir o melhor sinal.
3. titulação de anticorpos
Nota: Titulação de anticorpos é o passo mais crítico para a obtenção de dados de alta qualidade, pode ser reproduzidos. Titulação de anti-CD3,-CD8,-CD14, - CD19 e - TCR γδ segue o procedimento padrão pelo qual a concentração de anticorpo para separar otimamente picos positivos e negativos é derivada por máximo índice13,14de coloração. Diluições no pico ou perto do pico do lado ascendente da curva de índice de mancha devem ser selecionado (Figura 1A-C). O anticorpo anti-CD4 é titulado para colocar o pico da população positiva entre CD3 única populações positivas e CD3 CD4 + células T CD8 +, mais perto para o CD3 único sinal positivo para melhor discriminar as populações de CD8dim (células γδ T CD8 + e células NK-T). Células ao longo da mesma linha, entre o CD3 de CD56 titulação visa posição NK CD56+ + e o CD3 população– .
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Curva de índice máximo mancha
Nota: titulação de anti-CD3,-CD8,-CD14, - CD19 e - TCR γδ segue o procedimento padrão pelo qual a concentração de anticorpo para separar otimamente picos positivos e negativos é derivada por coloração índice curva15no máximo. Se os anticorpos contra outros marcadores são adicionados ao painel, eles também precisam ser titulado com uma curva de índice de coloração máxima.- Prepare uma diluição 2 vezes anticorpo preenchendo 10 poços de uma placa de 96 poços com 40 µ l de tampão de coloração. No primeiro poço, aumentar o volume final de 80 µ l de tampão de coloração e adicione o anticorpo de interesse numa concentração 4 vezes a concentração sugerida pelo fabricante.
- Misture bem e transfira 40 µ l para o segundo bem. Misture bem e repita este passo para todos os outros poços.
- Mancha de 10 amostras de sangue total ou de PBMC com 30 µ l de 10 diferentes diluições 2 vezes de anticorpos seguindo o protocolo descrito antes.
- Aquisição de dados com um citômetro de fluxo e traçar o sinal de cada diluição (figura 1A).
- Portal sobre as populações de negativas e positivas para cada concentração de anticorpo. Aumento da concentração de anticorpos pode levar a um plano superior. Portanto, redimensione o portão negativo nesse sentido.
- Para cada concentração de anticorpo, extrair informações sobre a mediana e o desvio-padrão para a intensidade fluorescente da população negativa e a mediana para a intensidade fluorescente da população positiva. Calcular, para cada concentração de anticorpos, o índice de mancha com esta fórmula: (mediana intensidade fluorescente da população positiva — intensidade fluorescente mediana da população negativa) ÷ (desvio-padrão da intensidade fluorescente de 2 x a população de negativo) (figura 1B).
- Plotar a mancha índice vs. a concentração de anticorpos expressada como fração da diluição do anticorpo (por exemplo, 01:10 diluição = 0,1) e identificar a concentração do anticorpo com o valor de índice máximo mancha (Figura 1).
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Titulação de anticorpos anti-CD4 e - CD56
Nota: titulação de anticorpos Anti-CD4 e - CD56 baseia-se na titulação anterior os outros marcadores no painel dois-fluorocromo. Para o anticorpo anti-CD4 a titulação visa colocar o anti-CD4 do sinal entre o CD8 duplo+/CD3+ sinal e o CD3 única população positiva (Figura 1).- Titula-se o anti-CD4 e CD56 anticorpos com uma estratégia de diluição 2 vezes como descrito antes, adicionando concentrações adicionais para identificar finamente o intervalo de concentração que permitem separar CD4+ T células e células NK da outra célula populações.
- Titula-se o anticorpo anti-CD4, colocando o sinal do anti-CD4 entre o CD8 duplo+/CD3+ sinal e o CD3 única população positiva (Figura 1).
Nota: Cuidado especial deve ser feito para separar claramente CD4+ T células de CD8+ dim populações. - Titula-se o anticorpo anti-CD56 seguindo uma estratégia semelhante à titulação de anticorpos anti-CD4, colocando as células NK entre o CD3-negativo e as populações de CD3-positivo.
4. estratégia de retenção
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Identificação de populações de célula linfocítica e monocítica e remover as células mortas e a maioria das células vermelhas do sangue residuais da análise.
- Selecione toda a população contendo linfócitos e monócitos, baseados na área de dispersão de lado frente vs (FSC-A vs CCD-A). Remova agregados de células da análise através de dispersão frente altura vs dispersão frente largura (FSC-H vs FSC-W) e lado dispersão altura vs lado dispersão largura (SSC-H vs CCD-W).
- Use um marcador de discriminação ao vivo/morto para excluir brilhantes positivas células mortas e células vermelhas do sangue residuais da análise. Portão em linfócitos e monócitos, baseados no perfil FSC-A e SSC-A diferente.
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Dois-fluorocromo sete-marcador estratégia associada das populações linfocítica.
Nota: dentro do subgrupo positivo CD3, CD4+, CD8+ e células γδ T podem ser separadas usando anticorpos que se destinam exclusivamente a CD4, CD8 e o receptor do γδ. De forma comparável, dentro do subgrupo negativo CD3, células B, células NK e monócitos podem ser identificados exclusivamente usando anticorpos contra CD19, CD56 e CD14, respectivamente.- Selecione o portão de linfócitos e criar um ponto de enredo com em cada eixo, um dos dois fluorochromes usados no presente protocolo (Figura 2B).
- Portão em CD8+ T células identificadas como CD3+/CD8+ duplo células positivas no canto superior direito da trama do ponto (Figura 2B). Exclua a população de CD8 ofuscante que pode conter células NKT. Portão em CD4+ T células identificadas como população entre CD8+ T células e o CD3 único positivo das populações. Portão em pilhas de T do γδ identificados como células CD3 elevada. Subdivida as pilhas de T do γδ em CD8 positivas e negativas de CD8.
- Porta identificadas como a população entre CD3 positivo de células NK e células CD3-negativo. Subdivida as células NK em CD8 positivas e negativas de CD8. Portão em células B, identificado como negativo CD3 CD19+ população no canto inferior direito da trama do ponto.
- Selecione os portões de monócitos e criar um ponto de enredo com em cada eixo, um dos dois fluorochromes usados no presente protocolo (Figura 2). Portal sobre o CD3–/CD14+ população.
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Representative Results
Configuração e análise de um experimento de citometria de fluxo das células do sangue periféricos humanos manchado com sete marcadores de linhagem (anti-CD3,-CD4,-CD8, - CD14,-CD19-CD56 e TCR - anticorpos γδ) usando apenas dois fluorochromes são apresentados.
Resultados representativos são descritos para anti-CD8 e - titulação de anticorpos CD56. Para cada anticorpo (neste exemplo, anti-CD8), dados de dez diluições sucessivas de 2 vezes foram gravados para calcular uma curva de índice de mancha (Figura 1A-C). Concentração de anticorpo foi determinada pela mancha máximo índice sinal13,14. Diluições no pico ou perto do pico do lado ascendente da curva de índice de mancha devem ser selecionadas. Anti-CD4 e - CD56 anticorpos foram titulados pela coloração de células do sangue periféricas junto com os outros marcadores no painel dois-fluorocromo (titulado anteriormente). Para o anticorpo anti-CD4, a titulação deve visar colocando o sinal do anti-CD4 entre o CD8 duplo+/CD3+ sinal e o CD3 única população positiva (Figura 1). Cuidado especial deve ser feito para separar claramente CD4+ T células de CD8+ dim populações. PBMC foram corado com concentração ideal dos marcadores indicados e diferentes concentrações de anti-CD4. Código das concentrações de cor: verde indica concentrações que resultam em uma separação ideal de CD4+ T células de outros CD3 a+populações; laranja indica concentrações que resultam em uma separação aceitável, mas não é o ideal; vermelho indica concentrações que resultam na separação pobre de CD4+ T células de ofuscante células CD8 ou populações de dupla negativa de CD4/CD8. A titulação de anti-CD56 foi feita em uma maneira similar como o anticorpo anti-CD4, colocando as células NK entre o CD3 negativo–e as populações de CD3-positivo.
Representante de gating estratégia mostra como identificar as populações de célula linfocítica e monocítica e remover as células mortas de análise e a maioria das residuais células vermelhas do sangue (Figura 2A). Todas as análises subsequentes baseava-se esta estratégia associada. Representante de retenção de estratégia é usada para identificar o CD4+ e CD8+ T células, as células γδ T, células B, células NK e monócitos em dois sete fluorocromo marcador coloração (Figura 2B-C).
Resultados negativos representativos são a derivação de preparação inadequada da amostra e titulação de anticorpos CD56 e - anti-CD4. Falta de adequada titula-se resultados de CD4 em separação pobre de CD4 células de+ T de CD8+ T células (Figura 3A), enquanto uma pobre titulação de CD56 pode levar a uma separação pobre da NK de células B e células negativas para todos os marcadores no painel (coloração Figura 3B). Lise de RBC pobre pode ocorrer com mancha de sangue total. Se o principal objetivo do protocolo é calcular a porcentagem da população de células diferentes (por exemplo, % de CD4+ T células), contaminação com células de dupla negativa de RBC, que aparecerá na trama do ponto como população de dupla negativa, deve ser excluída a análise (Figura 3). Baseado em nossa experiência com este protocolo, notamos que exata separação entre as células B e NK CD8+ células podem ser verificadas usando outros marcadores. Como exemplo, as células NK são dupla negativa para HLA-DR e CCR6, enquanto as células B são duplo positivo (Figura 3D).
O protocolo apresentado neste manuscrito destina-se a ser parte de um painel de coloração multicolor para interrogar várias populações imunes em amostras com número limitado de células. Usando essa abordagem, nós investigamos dinâmica em populações imunes das amostras longitudinais dos doadores com mieloma múltiplo recebendo um transplante de células estaminais (Clinicaltrials.gov NCT0056609816). PBMC congelado foram coletadas e analisadas por citometria de fluxo no dia 0, 14, 28, 60, 180, 360 após transplante. Usando essa abordagem, fomos capazes de interrogar várias populações de linfócitos, focando seu perfil ingênuo/memória (CD45RA, CCR7), ativação e célula estado de exaustão (HLA-DR, CD57, CD45RA + memória efetoras, CD16) e T efetoras fenótipo (CCR4, CCR6, CXCR3) em um único painel17,18,19,20,21,22,23,24,25 de coloração , 26. isto tem sido particularmente útil, Considerando que o número de células coletadas para alguns dos pacientes e pontos de tempo era mal suficiente para apenas um único painel de coloração. Representante gating estratégia (Figura 4) e a dinâmica das populações de célula selecionada (Figura 5) de um paciente Policondrite ao longo do tempo. No mieloma múltiplo B células podem expressar o marcador NK CD56. Para excluir esta possibilidade, costumávamos HLA-DR e CCR6 para mais diferenciar as células B de células NK (Figura 4B). CD8+ memória e ingênuo células T foram identificadas pela expressão de CD45RA e CCR7: ingênuo (CD45RA+/CCR7+), memória central (CM, CD45RA–/CCR7+), memória efetoras (EM, CD45RA–/CCR7- ) e memória efetoras CD45RA+ (EMRA, CD45RA+/CCR7+) (Figura 4). Expressão de HLA-DR e CD57 em CD8+ ingênuo, células T de memória total (que compõem o CM, EM e EMRA), CM, EM e EMRA (Figura 4). CD4+ memória e ingênuo células T foram identificadas pela expressão de CD45RA e CCR7: ingênuo (CD45RA+/CCR7+), memória central (CM, CD45RA–/CCR7+), memória efetoras (EM, CD45RA–/CCR7- ) e memória efetoras CD45RA+ (EMRA, CD45RA+/CCR7+) (Figura 4E). Expressão de HLA-DR e CD57 em CD4+ população ingênua e memória (que compõem o CM, EM e EMRA), CM, EM e EMRA (Figura 4F). CCR4 e CCR6 foram usados como marcadores para identificar dentro da população de memória Th9 CD4+ T células (Figura 4). Th1, 17/Th1, Th2 e Th17 CD4+ T subpopulações auxiliar foram identificadas pela expressão de CCR4, CCR6 e CXCR3 (Figura 4 H). CD16 e CD57 expressão nas células NK (Figura 4I). Transplante de células-tronco resultou em uma sustentada CD4+ e CD8+ ativação de célula T, conforme mostrado pelo aumento da expressão de HLA-DR e CD57 e em uma inclinação do ajudante de T para um fenótipo Th1. Em 60 dias, a percentagem de células B dramaticamente aumentada prevendo a recaída paciente (Figura 5).
Figura 1: titulação de anticorpos representativo. (A) Dot plot mostra expressão CD8 em PBMC fresco manchado com a concentração indicada do anticorpo. (B) tabela representa a mediana e desvio padrão de intensidade fluorescente do CD8+, mediana intensidade fluorescente CD8 população– e o índice de mancha derivada para cada concentração testada. (C) o gráfico mostrado como derivado da concentração ideal em função do índice de mancha do anticorpo. (D) representante titulação de anticorpos CD4. Painel D foi modificado de 2017 Boin et al2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: representante gating estratégia e resultados de discriminação subpopulação. (A) representação esquemática da exclusão de gibão, discriminação de células vivas e tamanho-base retenção de linfócitos e monócitos. (B) subpopulações de linfócitos identificadas com a abordagem de dois fluorocromo. (C) monócitos identificaram com a abordagem de dois fluorocromo. A figura foi modificada de 2017 Boin et al2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: resultados representativos obtidos de separação inadequada da amostra e titulação de anticorpos errado. (A) titulação incorreta dos resultados de anticorpos CD4 na resolução pobre entre CD4+ e CD8+ populações. (B) pobre CD56 titulação pode levar a uma separação ruim da NK de células B. (C) efeito de Lise incompleta RBC na discriminação de subpopulações. (D) exemplo de uso de outros marcadores para verificar a exata separação entre as células B e células NK: as células B são HLA-DR e CCR6 duplo positivo, Considerando que as células NK são dupla negativa. Painel D foi modificado de 2017 Boin et al2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: estratégia para analisar amostras de um paciente com mieloma múltiplo de Gating. (A) linfócitos foram bloqueados com base nos seu FSC-A e SSC-área e seu perfil de fluxo cytometric com a coloracao de imune-celular dois-fluorocromo é mostrado. (B) separação de NK e B células usando CCR6 e HLA-Dr. (C) Gating estratégia para identificar CD8+ células T de memória e ingênuo. (D) expressão de HLA-DR e CD57 em CD8+ células T de memória e ingênua. (E) Gating estratégia para identificar CD4+ células T de memória e ingênuo. (F) HLA-DR e CD57 expressão em CD4+ células T de memória e ingênua. (G) identificação de CD4 Th9+ T células (H) identificação do Thelper CD4+ célula T subpopulações (eu) CD16 e CD57 expressão nas células NK. A figura foi adaptada de Boin et al 20172. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: dinâmica da população celular em paciente com mieloma múltiplo. (A) dinâmica de populações de linfócitos grandes em PBMC isolado e criopreservadas no dia indicado após transplante de células estaminais (SCT). (B) caracterização de subpopulações de CD8 ao longo do tempo. (C) caracterização de subpopulações CD4 ao longo do tempo. (D) análise de subconjuntos de NK. Dados têm sido plotados com GraphPad Prism. A figura foi adaptada de Boin et al 20172. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Alvo | Clone | Fluorocromo | Fornecedor | Concentração | Finalidade |
| CD3 | UCHT1 | BV421 | BD | 1/20 | Linhagem |
| CD56 | NCAM16.2 | BV421 | BD | 1/900 | |
| TCRΓΔ | B1 | BV421 | Bio | 1/30 | |
| CD4 | RPA-T4 | PE | BD | 1/450 | |
| CD8 | RPA-T8 | PE | BD | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | PE | BD | 1/15 | |
| CD19 | HIB19 | PE | BD | 1/300 | |
| Células mortas | L/D azul | LT | 1/300 | Discriminação ao vivo/morto | |
| BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Life Technologies | |||||
Tabela 1: Painel de anticorpo usado para a coloração de imune-pilha da dois-fluorocromo de PBMC (combinação de BV421-PE).
| Alvo | Clone | Fluorocromo | Fornecedor | Concentração | Finalidade |
| CD3 | UCHT1 | APC | BD | 1/20 | Linhagem |
| CD56 | NCAM16.2 | APC | BD | 1/60 | |
| TCRΓΔ | B1 | APC | Bio | 1/30 | |
| CD4 | RPA-T4 | PE | BD | 1/450 | |
| CD8 | RPA-T8 | PE | BD | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | PE | BD | 1/15 | |
| CD19 | HIB19 | PE | BD | 1/300 | |
| Células mortas | L/D azul | LT | 1/300 | Discriminação ao vivo/morto | |
| BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Life Technologies | |||||
Tabela 2: Painel de anticorpo usado para a coloração de imune-pilha da dois-fluorocromo de PBMC (combinação de APC-PE).
| Alvo | Clone | Fluorocromo | Catálogo | Fornecedor | Concentração | Finalidade |
| CD3 | UCHT1 | BV421 | 562426 | BD | 1/20 | Linhagem |
| CD56 | NCAM16.2 | BV421 | 562751 | BD | 1/900 | |
| TCRΓΔ | B1 | BV421 | 331217 | Bio | 1/30 | |
| CD4 | RPA-T4 | PE | 555347 | BD | 1/450 | |
| CD8 | RPA-T8 | PE | 555367 | BD | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | PE | 555398 | BD | 1/15 | |
| CD19 | HIB19 | PE | 555413 | BD | 1/300 | |
| CCR7 | G043H7 | AF647 | 353217 | Bio | 1/30 | Diferenciação |
| CD45RA | HI100 | APC-H7 | 560674 | BD | 1/60 | |
| CCR4 | 1-1 | PE-Cy7 | 561034 | BD | 1/60 | Subconjuntos de th |
| CCR6 | G034-E3 | BV605 | 353419 | Bio | 1/30 | |
| CXCR3 | 1C 6/CXCR3 | AF488 | 561730 | BD | 1/30 | |
| CD57 | NK-1 | PE-CF594 | 562488 | BD | 1/900 | Ativação/exaustão |
| HLA-DR | G46-6 | BV510 | 563083 | BD | 1/30 | |
| CD16 | 3-8 | BUV395 | 563784 | BD | 1/30 | NK, ativação de monócitos |
| Células mortas | L/D azul | L-23105 | LT | 1/300 | Discriminação ao vivo/morto | |
| BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Life Technologies | ||||||
Tabela 3: Painel de anticorpo usado para manchar congelado PBMC de um paciente com mieloma múltiplo.
| Alvo | Clone | Fluorocromo | Fornecedor | Concentração | Finalidade |
| CD3 | UCHT1 | BV421 | BD | 1/80 | Linhagem |
| CD56 | NCAM16.2 | BV421 | BD | 1/400 | |
| TCRΓΔ | B1 | BV421 | Bio | 1/200 | |
| CD4 | RPA-T4 | PE | BD | 1/1200 | |
| CD8 | RPA-T8 | PE | BD | 1/100 | |
| CD14 | M5E2 | PE | BD | 1/80 | |
| CD19 | HIB19 | PE | BD | 1/300 | |
| Células mortas | L/D azul | LT | 1/300 | Discriminação ao vivo/morto | |
| BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Life Technologies | |||||
Tabela 4: Painel de anticorpo usado para os dois-fluorocromo imune-pilha manchando de sangue total (combinação de BV421-PE).
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Discussion
O protocolo apresentado aqui tem demonstrado ser bastante flexível e insensível às mudanças de coloração, o amortecedor, a temperatura e a preparação de células do sangue periférico, devido a alta expressão de marcadores de linhagem na superfície das células. O passo mais crítico para a obtenção de dados de alta qualidade, pode ser reproduzidos é a titulação de anticorpos. Digno de nota, desde que a titulação de anticorpos deve sempre ser executada durante a instalação de um painel de fluxo cytometric, esta etapa não adicionar banco-tempo extra para nossa abordagem dois-fluorocromo. Titulação de anti-CD3,-CD8,-CD14, - CD19 e - TCR γδ segue o procedimento padrão pelo qual a concentração de anticorpo para separar otimamente picos positivos e negativos é derivada por máximo índice13,14de coloração. Diluições no pico ou perto do pico do lado ascendente da curva de índice de mancha devem ser selecionado (figura 1A-C). Por outro lado, uma ad hoc titulação de anticorpos anti-CD4 e anti-CD56 precisa ser executada. O anticorpo anti-CD4 é titulado para colocar o pico da população positiva entre CD3 única populações positivas e CD3 CD4+/CD8+ T células, mais perto para o CD3 único sinal positivo para melhor discriminar o CD8dim populações ( Células γδ T CD8+ e células NK-T). Células ao longo da mesma linha, entre o CD3 de CD56 titulação visa posição NK CD56+ + e a população de CD3. A expressão naturalmente inferior de CD56 facilita a titulação de anticorpos esta com a concentração para usar perto do valor obtido em uma curva de saturação. Usar fluorochromes de rendimento quântico de alta é outro fator crítico para uma separação ideal de vários marcadores/populações no detector mesmo. Obtivemos resultados bem sucedidos com APC, BV421 e PE, mas outros fluorochromes, tais como a nova geração de tinta de polímero, devem dar resultados comparáveis. Para diminuir a possibilidade de artefatos devido à compensação, também é importante escolher um par de fluorochromes com pouco, se houver, sobreposição espectral, como PE e APC, ou PE e BV421. Escolher os pares de fluorochromes com virtualmente nenhuma compensação é importante para reduzir a propagação de dados devido a alta repercussões de um fluorocromo no outro detector fluorocromo. Espalhando a redução facilita a retenção de subpopulações imunes, minimizando a distorção do sinal e permite a utilização desta metodologia, se limitado a dois fluorochromes, sem necessidade de controles de compensação.
A combinação de marcadores que propusemos é altamente personalizável, com base nos requisitos do investigador. Com efeito, alguns dos marcadores podem ser excluídas da análise se eles não se referem a uma população de interesse. Por exemplo, é possível remover o anticorpo anti-CD19 para excluir as células B, ou o anticorpo anti-CD4 para focar apenas o CD8+ T células. Digno de nota, anticorpo anti-CD8 é importante identificar o CD8+ NK células e células γδ T e, portanto, não deve ser removido do painel. Para melhorar a separação de populações de células raras, outras fluorochromes/detectores pode ser usados para alguns dos marcadores de coloração do dois-fluorocromo. Como exemplo, CD56 pode ser movida para um detector de diferente para detectar células NKT, que não é possível com o painel de dois-fluorocromo. Enquanto é possível reduzir o número de marcadores do painel, cuidado deve ser exercido em adicionando, alterando ou marcadores de comutação.
Desde que o conjunto de instrumentação, anticorpos e habilidade necessário, a abordagem padrão um fluorocromo um marcador ainda é a maneira mais exata para identificar várias populações imunes e discriminar subpopulações raras, tais como NKT ou γδ células T. No entanto, o principal objetivo desse método é não para substituir a abordagem clássica, mas sim para alcançar uma profunda immunophenotyping ao trabalhar com instrumentos com um baixo número de detectores, ou amostras com um número limitado de células, reduzindo a complexidade e custo na implementação do sistema experimental. Fizemos uma extensa seleção de amostras clínicas de doentes com mieloma múltiplo, esclerose sistêmica, Dermatomiosite e doença de Lyme, mostrando que este procedimento de coloração pode melhorar o interrogatório simultâneo de várias populações com limitada número de células. Nossos resultados até agora têm mostrado que este procedimento é insensível à ativação imune crônica ou doença infecciosa, mas testes preliminares devem ser conduzidos para avaliar a exatidão do presente protocolo em diferentes doenças.
Direções futuras para fortalecer ainda mais o potencial deste protocolo incluem estudos de caracterização de linfócitos infiltrante em tecidos primários de amostras clínicas. Isto é relevante para o tumor e Imunologia de doença auto-imune onde esta abordagem pode fornecer informações valiosas para a análise de amostras com material limitado. Estamos planejando para testar este painel em pilhas permeabilized para expandir a potencialidade para detectar a expressão de citocinas e moléculas sobre as mesmas amostras clínicas de sinalização. Finalmente, deve notar-se que abordagens similares, destinadas a aumentar o número de marcadores de recordable, também poderiam ser desenvolvidas usando diferentes conjuntos de marcadores e também podem ser desenvolvidas normas modelos animais.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este estudo foi suportado pelo Instituto Nacional de artrite e doenças de pele e osteomuscular < https://www.niams.nih.gov/>, prêmio número P30-AR053503; A Fundação Stabler, www.stablerfoundation.org; Nacionais Instituto de alergia e doenças infecciosas, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; Nina Irlanda programa para saúde de pulmão (NIPLH), https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD3 | BD Biosciences | 562426 | Antibody for staining RRID: AB_11152082 |
| CD56 | BD Biosciences | 562751 | Antibody for staining RRID: AB_2732054 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331217 | Antibody for staining RRID: AB_2562316 |
| CD4 | BD Biosciences | 555347 | Antibody for staining RRID: AB_395752 |
| CD8 | BD Biosciences | 555367 | Antibody for staining RRID: AB_395770 |
| CD14 | BD Biosciences | 555398 | Antibody for staining RRID: AB_395799 |
| CD19 | BD Biosciences | 555413 | Antibody for staining RRID: AB_395813 |
| CD3 | BD Biosciences | 555335 | Antibody for staining RRID: AB_398591 |
| CD56 | BD Biosciences | 555518 | Antibody for staining RRID: AB_398601 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331211 | Antibody for staining RRID: AB_1089215 |
| CCR7 | Biolegend | 353217 | Antibody for staining RRID: AB_10913812 |
| CD45RA | BD Biosciences | 560674 | Antibody for staining RRID: AB_1727497 |
| CCR4 | BD Biosciences | 561034 | Antibody for staining RRID: AB_10563066 |
| CCR6 | BD Biosciences | 353419 | Antibody for staining RRID: AB_11124539 |
| CXCR3 | BD Biosciences | 561730 | Antibody for staining RRID: AB_10894207 |
| CD57 | BD Biosciences | 562488 | Antibody for staining RRID: AB_2737625 |
| HLA-DR | BD Biosciences | 563083 | Antibody for staining RRID: AB_2737994 |
| CD16 | BD Biosciences | 563784 | Antibody for staining RRID: AB_2744293 |
| Dead cells | Life technologies | L-23105 | Live/dead discrimination |
| Falcon 5 mL round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Falcon 5 mL round-bottom polystyrene test tube | BD Bioscience | 352001 | to stain whole blood |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo fisher | 12648010 | Freezing cells |
| 96-well V-bottom plate | Thermo fisher | 249570 | plate for staining |
| FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| FCS Express 6 | De Novo Software | FACS analysis | |
| Graphpad Prism | GraphPad software | Data analysis |
References
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