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Methodenartikel

Präklinische Modell von Hind Limb Ischemia in diabetischen Kaninchen

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DOI:

10.3791/58964

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2. Juni 2019

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1Department of Biomedical Engineering, University of Texas at Austin, 2Division of Cardiology, University of Texas McGovern Medical School, 3Center for Laboratory Animal Medicine and Care, UT Health Science Center at Houston, 4Memorial Herman Heart and Vascular Center, Texas Medical Center, 5Institute for Cellular and Molecular Biology, University of Texas at Austin, 6The Institute for Computational Engineering and Sciences, University of Texas at Austin, 7Institute for Biomaterials, Drug Delivery and Regenerative Medicine, University of Texas at Austin

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein chirurgisches Verfahren, das zur indufären Ischämie bei Kaninchen mit Hyperlipidämie und Diabetes eingesetzt wird. Diese Operation dient als präklinisches Modell für Erkrankungen der peripheren Arterienerkrankung bei Patienten. Die Angiographie wird auch als Mittel zur Messung des Ausmaßes der eingeführten Ischämie und der Wiederherstellung der Perfusion beschrieben.

Zusammenfassung

Periphere Gefäßerkrankungen sind ein weit verbreitetes klinisches Problem, das Millionen von Patienten weltweit betrifft. Eine wesentliche Folge der peripheren Gefäßerkrankungen ist die Entwicklung von Ischämie. In schweren Fällen können Patienten eine kritische Gliedmaßen entwickeln, bei der sie ständige Schmerzen und ein erhöhtes Risiko für eine Amputation der Gliedmaßen erfahren. Zu den aktuellen Therapien für periphere Ischämie gehören die Bypass-Chirurgie oder perkutane Eingriffe wie Angioplastik mit Stelzierung oder Atherektomie, um den Blutfluss wiederherzustellen. Diese Behandlungen scheitern jedoch oft an der fortgesetzten Progression von Gefäßerkrankungen oder Restenosen oder sind aufgrund der insgesamt schlechten Gesundheit des Patienten kontraindiziert. Ein vielversprechender möglicher Ansatz zur Behandlung von peripheren Ischämie ist die Induktion der therapeutischen Neovaskularisierung, um dem Patienten die Möglichkeit zu geben, eine Kollateralvaskulatur zu entwickeln. Dieses neu gebildete Netzwerk lindert die periphere Ischämie, indem es die Durchblutung des betroffenen Gebietes wiederherstellt. Das am häufigsten angewandte präklinische Modell für periphere Ischämie nutzt die Entstehung von Hinterbein Ischämie bei gesunden Kaninchen durch Oberschenkelardenliga. In der Vergangenheit gab es jedoch eine starke Trennung zwischen dem Erfolg präklinischer Studien und dem Scheitern klinischer Studien über die Behandlung von peripheren Ischämie. Gesunde Tiere haben in der Regel eine robuste Gefäßregeneration als Reaktion auf chirurgisch induzierte Ischämie, im Gegensatz zu der verminderten Vaskularität und Regeneration bei Patienten mit chronischer peripheren Ischämie. Hier beschreiben wir ein optimiertes Tiermodell für periphere Ischämie bei Kaninchen, das Hyperlipidämie und Diabetes umfasst. Dieses Modell hat die Kollateralbildung und die Blutdruck-Soche im Vergleich zu einem Modell mit einer höheren Cholesterindiät reduziert. So kann das Modell eine bessere Korrelation mit menschlichen Patienten mit kompromittierten Angiogenese aus den gemeinsamen Ko-Morbiditäten, die periphere Gefäßerkrankungen begleiten, bieten.

Einleitung

Die periphere arterielle Erkrankung (PAD) ist eine häufige Durchblutungsstörung, bei der das Fortschreiten der atherosklerotischen Plaque-Bildung zu einer Verengung der Blutgefäße in den Gliedmaßen des Körpers führt. Der jüngste Anstieg der Risikofaktoren für Atherosklerose, darunter Diabetes, Fettleibigkeit und Inaktivität, hat zu einer zunehmenden Prävalenz von Gefäßerkrankungen 1 geführt. Derzeit wird geschätzt, dass 12% – 20% der Gesamtbevölkerung über 60 Jahre alt sind, eine arterielle Erkrankung an derPeripherie haben. Eine wichtige Folge der peripheren arteriellen Erkrankung ist die Entwicklung von peripheren Ischämie, die am häufigsten in den unteren Gliedmaßen zu finden ist. In schweren Fällen können Patienten eine kritische Gliedmaßen Ischämie entwickeln, ein Zustand, in dem es aufgrund fehlender Durchblutung ständige Schmerzen gibt. Patienten mit kritischer Gliedmaßen haben eine 50-prozentige Wahrscheinlichkeit, dass ein Gliedmaßen innerhalb eines Jahres nach der Diagnose amputiert wird. Darüber hinaus haben Patienten mit Diabetes eine höhere Inzidenz von peripheren arteriellen Erkrankungen und schlechterenErgebnissennach Eingriffen zur Revaskularisierung 3,4. Zu den aktuellen Therapien für periphere Ischämie gehören perkutane Eingriffe wie Atherektomie und Stachel-oder chirurgische Umgehung. Für viele Patienten bieten diese Behandlungen jedoch nur kurzfristige Vorteile und viele sind nicht gesund genug für größere chirurgische Eingriffe. In dieser Arbeit beschreiben wir ein präklinisches Tiermodell zur Erprobung neuer Behandlungen, die auf periphere Gefäßerkrankungen abzielen und die die Entstehung von peripheren Ischämie bei Kaninchen durch chirurgische Ligation im Kontext des diabetischen Krankheitszustandes einbezieht.

Das Modell der Hinterbein bei Kaninchen wird seit über einem halben Jahrhundert mit 5,6alsphysiologisches Modell für obstruktive Gefäßerkrankungen und präklinische Vorläufer menschlicher Studien eingesetzt. Kaninchen sind aufgrund der entwickelten Muskulatur des Knöchel-und Wadenmuskels oft eine bevorzugte Spezies für Studien an peripheren Ischämie, im Gegensatz zu herkömmlichen großen Tiermodellen, die ungulat sind (Tiere mit Hufen). Mehrere aktuelle Rezensionen haben sich mit der Verwendung dieses Modells und anderer bei der Modellierung von peripheren Gefäßerkrankungen bei Menschen7,8befasst. Ähnliche Modelle mit Hinterbein Ischämie bei Kaninchen wurden in präklinischen Studien zu Wachstumsfaktoren9,10, 11,12, 13,14, 15,16,17,18, 19,20,Gentherapie21,22,23, 24,25, 26, 27,28,29,30, 31,32, 33,34, 35,36,37, 38,39, 40,41, 42,43,44, undStammzellen45,46, 47,48, 49, 50 ,51für therapeutische Neovaskularisierung in den Gliedmaßen. Leider zeigten die klinischen Studien, die auf diese erfolgreichen Tierstudien folgten, keine signifikanten Vorteile für die Patienten52.

Eine vorgeschlagene Erklärung für den Grund für dieses translationale Versagen ist, dass der Zustand der peripheren Ischämie bei menschlichen Patienten eine ist, die Resistenz gegen angiogene Signale53,54,55 , 56 , 57 , 58 , 59. Mehrere Studien haben Mängel an angiogenen Signalwegen bei Diabetes und Hyperglykämie nachgewiesen. Diabetes und Hyperlipidämie führen zu einem Verlust von Heparansulfat-Proteoglykanen und einer Zunahme von Enzymen, die Heparansulfat schneiden, was einen potenziellen Mechanismus zur Resistenz gegen therapeutische Angiogenesis/Arteriogenese mit Wachstumsfaktoren darstellt. , 61. Ein wesentliches Merkmal eines Modells für periphere Ischämie sollte daher ein Aspekt der therapeutischen Resistenz sein, damit Therapien im Zusammenhang mit dem Krankheitszustand von menschlichen Patienten bewertet werden können.

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Kaninchenmodell der peripheren Ischämie durch chirurgische Ligation der Oberschenkelarterien. In das Modell wird eine Lead-In-Phase mit der Induktion von Diabetes und Hyperlipidämie eingearbeitet. Wir verglich dieses Modell mit einem anderen Modell, das eine höhere Fettdiät ohne Diabetes beinhaltet, und stellten fest, dass das Modell mit Diabetes und niedrigerem Niveau an Hyperlipidämie effektiver bei der Verringerung des Blutgefäßwachstums war. Unser Modell kombiniert Fortschritte, die von verschiedenen Gruppen genutzt wurden, mit dem Ziel, eine praktische und standardisierte Methode zu bieten, um konsistente Ergebnisse in der Forschung an peripheren Gefäßerkrankungen zu erzielen.

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Protokoll

Studien mit Tieren wurden mit Genehmigung der University of Texas in Austin und des UTHealth Science Center in Houston Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), dem Animal Care and Use Review Office (ACURO) der US-Armee durchgeführt. Medizinische Forschung und Materialkommandariat für Forschungsschutz, und in Übereinstimmung mit NIH-Richtlinien für die Tierpflege.

1. Einführung von Diabetes und Hyperlipidämie

  1. Übergang der neuseeländischen Kaninchen (4 – 6 Monate alt) von einer Tasse Alfalfa-Chow auf 0,1% Cholesterin im Laufe von vier Tagen. Für die Tage 1 – 5, verwenden Sie Standard-Chow, um Cholesterin-Kratien von 1:0, 3:1, 1:3 und 0:1, bzw.. Nach zwei Wochen auf 0,1% Cholesterinchow, veranlassen Kaninchen zu Diabetes mit alloxan Injektion, wie in den folgenden Schritten beschrieben
  2. Die Kaninchen mit 35 – 75 mg/mL Ketamin und 1 – 2 mg/mL acepromazine über subkutane Injektion und Prep für eine IV-Injektion durch die Einführung eines Katheters in die marginale linke Ohrenvene mit einem 22 g Katheter bestücken.
  3. Sammeln Sie einen Tropfen Blut von den Kaninchen über die Nabe des Ohrendasing-Katheters für die Baseline-Blutzuckerspiegel (BGL) Messung. Jeder Standard-Glucometer kann verwendet werden. Normale Glukosewerte für ein Kaninchen liegen typischerweise im Bereich von 80 bis 150 mg/dL.
  4. Mit einer Spritzpumpe Lega bei 100 mg/kg in Salz auf ein Volumen von 8 ml langsam über einen Zeitraum von 8 Minuten durch den Ohrenkatheter injizieren.
  5. Überprüfen Sie die BGL jede Stunde für die nächsten 12 Stunden mit einem Standard-Glucometer, um Hypoglykämie zu überwachen.
    1. Das Kaninchen in einen Reststrainer legen.
    2. Das Ohr mit 2,5% Lidocaine/2,5% Prilocaincreme betäuben.
    3. Mit einer 27 G-Nadel das Blut aus der seitlichen Ohrenvene nehmen und BGL mit einem Standardmesser messen.
  6. Messen Sie die BGL zwei Mal täglich für die ersten 7 Tage. Geben Sie den Kaninchen eine Insulinspritze, wenn die BGL 350 mg/dL erreicht oder überschreitet.
  7. Bereiten Sie eine 3-mm-Edelstahlkugel für die Implantation als Größenmarkierung während der Angiogramme vor dem Tag der Operation.
    1. Schneiden Sie ein 10-mm-Rundstück aus silastischen Blechen aus einem größeren Blech mit einem Biopsie-Punch.
    2. Montieren Sie die Kugel in der Mitte des Blattes mit klarem Silikondichtmittel.
    3. Den Ball mit dem Dichtmittel komplett bedecken. Das Dichtmittel für mindestens 24 Stunden heilen lassen.
    4. Legen Sie die Kugel in einen offenen 2 Zoll x 3 Zoll großen Polyethylen-Beutel mit niedriger Dichte und legen Sie sie in einen Sterilisationstasche, um mit Ethylen-Oxidgas sterilisiert zu werden.

2. Vorbereitung des Kaninchens auf die Operation

  1. Das Kaninchen mit 20 – 40 mg/kg Ketamin und 2 mg/kg Midazolam durch subkutane Injektion anstecken. Legen Sie das Kaninchen auf 1,5% – 3% Isoofluran (in der Regel 2%) Während der gesamten ersten Sedierung mit einer Maske. Geben Sie eine Injektion von Alfaxalone, um die Anästhesie durch eine intramuskuläre Injektion von 3 mg/kg aufrechtzuerhalten.
  2. Nach der Betäubung die Maske entfernen und ein gefesseltes Endotrachealrohr in die Atemwege geben und mit einem Ventilator verbinden. Verabreden Sie Isoofluran weiterhin mit 1,5% – 3%.
  3. Sammeln Sie Blut aus der zentralen Arterie aus beiden Ohren für eine Basischemie.
  4. Legen Sie einen 22 G-Ohrvinenkatheter in die seitliche Ohrenvene, damit die Lösung von Lactated Ringer während des chirurgischen Eingriffs tropfen soll. Alternativ kann auch normales Salz (0,9% Natriumchlorid) verwendet werden.
  5. Mit der seitlichen Vene im gegenüberliegenden Ohr einen Katheter in die Vene legen und Alfaxalone bei 6 mg/kg/h liefern.
  6. Um Schmerzen und Infektionsgefahr zu begrenzen, verabreichen Sie Buprenorphin (0,01 mg/kg) und Enrofloxacin (5 mg/kg) mit einer subkutanen Injektion mit einer 25 G-Nadel.
  7. Schneiden Sie die Haare am Hals, an den rechten und linken Innenhängen und zurück mit Clippers (#40 Klinge). Das Haar wird von hinten entfernt, um den Kontakt mit dem Erdungspolster zu halten.
  8. Legen Sie eine Blutdruckmanschette auf jeden der Hinterbeine und messen Sie den anfänglichen Blutdruck. Legen Sie die Manschette knapp unter das Knie mit der Sonde knapp über dem Hock auf die Seitenoberfläche.
  9. Positionieren Sie das Kaninchen auf dem Operationstisch auf dem Rücken und schrubben und drapieren Sie die Operationsseiten. Dazu gehören der Hals für den Zugang zur Arterieur und der innere rechte Oberschenkel für den Zugang zur Oberschenkelarterie. Führen Sie die Sterilisationsschrubbe mit abwechselnden Peeling von 2% Chlorhexidin und 70% Ethylalkohol durch. Wiederholen Sie diese dreimal, dann ein abschließendes Spray mit 2% Chlorhexidin Lösung.
  10. Legen Sie eine 3-mm-Edelstahlkugel, die in einem Polyethyanerbeutel mit geringer Dichte auf das rechte (geschrubbte) Bein in der Nähe des oberen Teils des Oberschenkels sterilisiert wurde, um als Größenbeweis bei Angiogramm-Messungen zu dienen. Legen Sie eine sterile Drape über das Bein bis zur Zeit der Operation. Lassen Sie die Kugel in der sterilen Plastiktüte während des ersten Angiogramms.

3. Angiographie

  1. Die richtige gemeinsame Carotid-Arterie aussetzen
    1. Mit einem Skalpell mit – Klinge einen 4 #15 5 cm langen Schnitt nur seitlich zur Luftröhre machen.
    2. Verwenden Sie stumpfen Abschnitte, um die Carotid-Arterie zu entlarven und öffnen Sie den Schnitt mit kleinen Weitlaner-Retraktoren. Isolieren Sie die Carotid-Arterie vorsichtig von der jugulären Ader und dem Vagusnerv. Typischerweise werden für die stumpfe Abtrüsur eine geschwungene Metzenbaum-Schere und eine gebogene Mückenhungitose verwendet. Achten Sie darauf, dass die Knorpelarterie von der Nerven-und Jugulavene vollständig getrennt wird, damit die Ligaturen nur die Arterie ligieren.
  2. Legen Sie eine Ligatur mit einer 4-0 Seidennaht an den proximalen und distalen Enden der exponierten Arterie. Mit dem Knoten eines Chirurgen, gefolgt von vier quadratischen Knoten, wird das distale Ende des Carotids abgezogen. Verwenden Sie am proximalen Ende einen Ligaloop, um ihn bei Bedarf straffen oder lockern zu lassen. Die Verwendung eines Ligaloop, der am proximalen Ende der exponierten Arterie platziert wird, kann helfen, den Einführer und Katheter zu sichern.
  3. Administer 500 IU von heparin durch die IV. Verwenden Sie etwa 0,5 ml von 1% Lidocain, die entlang des exponierten Carotids aufgetragen werden, um das Gefäß zu erweitern. Eine Behandlung reicht in der Regel aus, kann aber bei Bedarf wiederholt werden. Etwa auf halbem Weg durch die Carotid-Arterie mit einer Skalpell oder Iris-Schere schneiden, dann das 4-Zoll-Drahtzeiftzüge in die Arterie legen.
  4. Füttern Sie einen 0,14 Zoll x 185 cm langen Führungsdraht durch das Einsteckwerkzeug zur Aortenverzweigung am iliakischen Kamm in der absteigenden Aorta. Entfernen Sie das Einsteckwerkzeug und legen Sie einen 3F-Pigtail-angiographischen Katheter über den Draht.
  5. Vorwärts ist der Schweineschwank-Katheter 2 cm ungefähr zur Aortenverzweigung am iliakischen Kamm in der absteigenden Aorta.
  6. Positionieren Sie die Spitze des Katheters zwischen der siebten Lendenwirbelsäule und der ersten sakralen Wirbelsäule. Testen Sie die Lage des Katheters, indem Sie eine 2 – 4 ml Kontrastmittel manuell injizieren.
  7. Administer eine intraarterielle Injektion von 100 μg Nitroglycerin durch den Katheter, um die Vasodilation zu erhöhen.
  8. Administer 0,8 mL von 1% Lidocain an das Kaninchen durch den Katheter, um bei der Vasodilation während des Angiogramms zu helfen. Befestigen Sie die Schläuche für den Injektor an den Katheter und entfernen Sie Luftblasen in der Leitung. Mit dem automatisierten angiographischen Injektor durch den Katheter 8-9 ml Kontrastmittel einschleusen.
  9. Aufzeichnung von Serienbildern der Hinterbeine mit Hilfe von Angiographie.
    1. Stellen Sie den Power-Injektor so ein, dass er den Kontrast bei 3 mL/sec für insgesamt 8-9 mL einspritzt. Führen Sie die digitale Subtraktionsangiographie mit 6 Bildern pro Sekunde durch.
    2. Wählen Sie die erstellten Serienbilder aus und ändern Sie ein Foto jedes Angiogramms mit etwa-40% Einstellung, um das Aussehen des Knochens zu minimieren und ein vollständiges Bild der Gefäßdurchmischung mit Kontrast zu erfassen. Ein Beispiel Angiogramm des Gefäßflusses nach der Oberschenkelligation/.

4. Isolierung der Oberschenkelarterie

  1. Mit einem Skalpell (#15 Klinge) einen Längsschnitt in der Haut über der rechten Oberschenkelarterie machen. Achten Sie darauf, dass der Schnitt sich von dem Leistenband, das in der Gegend nur in der Nähe der Patella (ca. 6 cm) endet, nachrangt.
  2. Verwenden Sie stumpfe Sektion mit gebogenen Metzenbaum-Scheren oder einer gebogenen Mückenhemostat, um die Oberschenkelarterie zu entlarven.
  3. Verwenden Sie Weitlaner Retraktoren, um den Schnitt offen zu halten.
  4. Fügen Sie 0,5 ml von 1% Lidocain vor Ort hinzu, um Nervenreizungen zu reduzieren und die Vasodilation zu fördern.
  5. Setzen Sie stumpfe Abschnitte des Gewebes fort, um die gesamte Länge der Oberschenkelarterie zusammen mit allen Zweigen der Oberschenkelarterie zu befreien, einschließlich der minderwertigen Epigastrischen, tiefen Oberschenkelumfang, lateralen Umgehungsarterien und oberflächlichen Epigastrischen Arterien (Abbildung 2A) .
  6. Sekten Sie weiter entlang der poplitealen und saphenösen Arterien sowie der äußeren iliakischen Arterie(Abbildung 2A). Befeuchten Sie den Bereich regelmäßig mit Salz, um vor Gewebeschäden zu schützen. Wenn die stumpfe Sektion entlang der Oberschenkelrinne (zwischen den Muskeln) durchgeführt wird, ist es nicht notwendig, den Muskel zu schneiden.
  7. Die Arterie vorsichtig von der Vene und dem Nerv trennen, wie in Abbildung 2B, C. Ligieren Sie die Arterien, die durch das Diagramm mit 4,0 Seidenähten angezeigt werden, indem Sie zwei Krawatten mit genügend Platz zwischen ihnen platzieren, um die Arterie zu schneiden. Diese Krawatten werden mit einem Surge-Knoten durchgeführt, gefolgt von vier quadratischen Knoten.
  8. Schnitt zwischen den beiden Krawatten auf den ligatierten Arterien mit der kleinen Metzenbmau-Schere. Die Oberschenkelarterie von ihrem proximalen Ursprung als Zweig der äußeren iliakischen Arterie bis zu dem Punkt distal, wo sie zu den saphenösen und poplitealen Arterien verzweigt.

5. Angiographie wiederholen

  1. Verwenden Sie 4-0 Seidennaht, um das silastische Blech zu befestigen, mit 3-mm Edelstahlkugel am oberen Teil des Quadrizeps-Muskels. Ziehen Sie die Haut über den Ball, nachdem sie an Ort und Stelle ist.
  2. Administer eine intraarterielle Injektion von 100 μg Nitroglycerin durch den Katheter, um die Vasodilation zu erhöhen.
  3. Bei Bedarf weitere 0,8 mL Lidocain mit 1% Lidocain durch den Katheter verabreichen, um die Vasodilation während des Angiogramms zu unterstützen.
  4. Mit einem automatisierten angiographischen Injektor 8-9 ml von Kontrastmitteln einschlagen.
  5. Führen Sie Angiographie, wie in Schritt 3.9 beschrieben.

6. Wundabschaltung und-verwertung

  1. Den Katheter aus der rechten Arterie nehmen. Mit der 4:0-Seidenznaht, die bereits rund um die Arterie vorhanden ist, die Arterie abziehen.
  2. Suture beide Wunden geschlossen. Schließen Sie Muskel-und Unterkuschellagen mit 4-0 Polydioxanon oder 3-0 Polyglactin 910 auf einer Tupernadel (siehe Materialtabelle) in einem durchgehenden Nahtmuster. Schließen Sie die Haut mit 4-0 Polydioxanon oder 4-0 Polyglactin 910 auf einer umgekehrten Schneidnadel (siehe Materialtabelle) in einem vergrabenen, durchgehenden subkutizulären Nahtmuster.
    Hinweis: Wenn vorhanden, wird Polydioxanon für beide bevorzugt.
  3. Administer intradermale Injektionen von 0,25% Bupivacaine in der Nähe der Einschnitte mit einer Spritze mit einer 25 G-Nadel. Legen Sie die Nadel ein und spritzen Sie 0,5 ml, während die Nadel zurückgezogen wird. Geben Sie eine Injektion pro Seite der Wunde für den Schnitt am Hals (zwei Injektionen am Hals) und zwei Injektionen pro Seite der Wunde für den Schnitt am Bein (vier Injektionen auf dem Bein; insgesamt sechs Injektionen). Das injizierte Gesamtvolumen beträgt 3 mL (0,5 mL x 6 Injektionen).
  4. Administer subkutane Injektionen von 0,5 mg/kg Meloxicam und anhaltender Freigabe Buprenorphine bei 0,12 mg/kg.
  5. Überwachen Sie das Kaninchen, wie es sich von der Narkose erholt. Das Kaninchen beginnt automatisch zu schlucken, wenn es aus der Narkose erwacht. Sobald die Schluckreaktion auftritt, entfernen Sie das endotracheale Rohr. Eine enge Überwachung und thermische Unterstützung, bis das Kaninchen in der Lage ist, die Herz-Kreislauf-Funktion und die Körpertemperatur zu erhalten. Bringe das Kaninchen in sein Gehege zurück, sobald es in der Lage ist, zu ambulant zu sein.
  6. Verwenden Sie frisches Gemüse and/oder Spritzenfutter einer kritischen Pflege Diät zusammen mit subkutanen Salzspritzen, wenn das Kaninchen nicht verträgt chow nach der Operation. Kohl, Brokkoli, Blumenkohl, Karotten oder andere in saisonalen Gemüsesorten können verwendet werden. Das Gemüse verkleinern und vermischen, um dem Kaninchen bei der Rückkehr zum Essen zu helfen.

7. Überwachung

  1. Die Kaninchen alle zwei Wochen betäuben, um den Blutdruck auf beiden Beinen zu erhalten, wie in Schritt 2.8 beschrieben. Erntedankblut aus der zentralen Arterie des Ohres für den Einsatz in Blutchemie-Assays. Alternativ sollte man Blut aus der saphenösen Vene oder aus der Kopfhaut nehmen. Nehmen Sie etwa 2 mL an jedem Zeitpunkt. Verwenden Sie für die Analyse eine Standard-Blutchemie-Tafel. Wenn nötig, fügen Sie Tests für Lipoprotein mit geringer Dichte (LDL), Lipoprotein mit hoher Dichte (HDL) oder Hämoglobin A1c (HbA1c) hinzu.
  2. Nehmen Sie eine sehr geringe Menge Blut für BGL-Messungen.

8. Behandlung

  1. Zehn Spritzen mit Behandlung, Träger und Crosslinker zubereiten. Füllen Sie jede Spritze kurz vor der Anwendung mit 100 μL Kalziumsulfat-Gülle und dann 100 μL von 2% Natriumalginat mit Wachstumsfaktoren oder anderen Behandlungen, so dass das Alginat der Spitze der Spritze am nächsten ist.
  2. Verabschiedung der einen bereitet Injektion in den Muskel, bevor die Vorbereitung der nächsten. Dadurch verkürzt sich die Zeit, in der das Alginat mit dem Kalziumsulfat in der Spritze interagiert. Die Injektionen gleichmäßig auf beiden Seiten der Oberschenkelknochen aufrichten. Um einheitliche Injektionen zu erreichen, erstellen Sie ein Silikonblech mit Löchern, um die Injektion zu leiten, wie in anderen Studien 19 beschrieben. Diese lässt sich mit einem Biopsienstich leicht aufbereiten, um Löcher in handelsüblichen Silikonblechen zu schaffen.

9. Endpunkt-Angiographie, Euthanasie, Perfusionsfixierung und Gewebeernte

  1. Führen Sie am Endpunkttermin Angiographie aus, wie in Schritt 3 beschrieben, aber verwenden Sie die linke Carotid-Arterie für den Zugang.
  2. Nach der Angiographie, bewegen Sie das Tier an den Nekropsy-Tisch und führen Perfusionsfixierung, um die Hinterbeine Gewebe zu erhalten:
    1. Erhöhen Sie das Isoofluran auf 3% – 4% und führen Sie eine Zehenspose durch, um die Anästhesie zu bestätigen, dass die Anästhesie ausreichend tief ist.
    2. Administer 1000-2000 IU von heparin intravenös.
    3. Mit einem Skalpell mit #20 Klinge einen Schnitt entlang der Mittellinie des Felsenkäfigs und die Länge des Zwerchfells erstellen.
    4. Mit dem freigelegten Rippenkäfig die Rippen links von der Mittellinie mit Rippenschneidern schneiden. Verwenden Sie Weitlaner Retrektor, um das Herz zu entlarven.
    5. Die Pumpe mit Ausgangsrohr mit einem Innendurchmesser von einem Zoll von 8 Zoll und einer 18G-Nadel am Ende aufstellen. Die Linie mit Salz vorladen und mindestens 600 ml Salz und Formalin in separaten Behältern für die Perfusion zubereiten lassen.
    6. Legen Sie die mit der Pumpe verbundene 18 G-Nadel über die Spitze des Herzens in die linke Herzkammer ein. Eine weitere 18-G-Nadel (ungebunden an irgendetwas) in das rechte Atrium einlegen und Blut in den Abzug der Nekropsisch-Tabelle fließen lassen.
    7. Verwenden Sie eine Perfusionspumpe, um den Fluss von etwa 500 ml Salz in das Herz zu steuern. Verwenden Sie eine Pumpeneinstellung, um 110 mL/min zu fließen.
    8. Sobald die Flüssigkeit aus dem Herzen klar ist, bewegen Sie die Schläuche aus dem Salzreservoir zu einem mit einer 10% Formalin-Lösung gefüllten. Das Twittern tritt in allen vier Gliedmaßen auf, wenn die Perfusion richtig funktioniert. Pumpen Sie etwa 500 ml Formalin-Lösung in die linke Herzkammer.
    9. Schalten Sie die Pumpe ab und entfernen Sie die Nadeln vom Herzen.
  3. Entfernen Sie beide Hinterbeine an der Hüfte, indem Sie das Hüftgelenk mit einem Skalpell mit #20 Klinge umschneiden. Verwenden Sie einen kleinen Rippenschneider, um die Gliedmaßen zu entfernen. Verwenden Sie das nicht-ischämische Glied als Kontrolle.
  4. Die Gliedmaßen 24 h bei 4 ° C in Formalin lagern und dann in 70% Ethanol bei 4 ° C lagern.
  5. Für die histologische Analyse nehmen Sie mehrere Biopsien aus den Gliedmaßen. Wir haben acht 6-mm-Biopsien verwendet, die in den Regionen über den Oberschenkel und das Kalb in beiden Gliedmaßen aufgenommen wurden.
    NOTE: Während Knöchelblutdruckmessung und Angiographie sind die am häufigsten verwendeten Methoden zur Messung der Wiederherstellung des Blutflusses, können andere Methoden verwendet werden, um die Genesung der Tiere zu verfolgen, einschließlich Doppler-Ultraschall, Laser-Doppler-Bildgebung, Infrarot Die Thermografie62, Mikrosphäre,bestimmtdie Perfusion 63, 64, die Computertomographie (CT)-Bildgebung und die Magnetresonanztomographie (MRT) 65.

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Ergebnisse

Nach der Induktion von Diabetes und der Einleitung der Cholesterindiät von 0,1% betrug das Gesamtcholesterin für die Kaninchen mit Diabetes und Cholesterindiät 123,3 ± 35,1 mg/dL (n = 6 männliche Kaninchen), die im Durchschnitt die Zeitpunkte und Kaninchen hatten. Der BGL-Wert für diese Kaninchen betrug 248,3 ± 50,4 mg/dL (n = 6 männliche Kaninchen). Ein Zeitverlauf für Blutchemikalien und Beinblutdruckverhältnisse in einem typischen Kaninchen wird in Abbildung 3 im Verg...

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Diskussion

Wir haben ein präklinisches Modell zur induzierten Hinterbeine bei Kaninchen mit Diabetes und Hyperlipidämie vorgestellt. In vielen Studien gibt es Unklarheiten zu der Technik, mit der bei Kaninchen eine Hinterbundsteinischämie hergestellt wird. Bei Mäusen ist die Schwere und Genesung von Hinterbein Ischämie stark abhängig von der Lage, an der die Ligation und die Technik zur Ischiere eingesetzt werden. Die Bedeutung der Technik, die in dieser Arbeit vorgestellt wird, ist, dass sie die konsequente Induktion von Ischämie ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Die Autoren bestätigen dankenswerterweise die Finanzierung durch das vom Verteidigungsministerium vermittelte Forschungsprogramm (DOD CDMRP); W81XWH-16-1-0582) zu ABB und RS. Die Autoren bestätigen auch die Finanzierung durch die American Heart Association (17IRG33410888), Der DOD CDMRP (W81XWH-16-1-0580) und die National Institutes of Health (1R21EB023551-01; 1R21EB024147-01A1; 1R01HL141761-01) bis ABB.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,9 % NatriumchloridHenry Schein Medical 1537468/ 1531434250 mL Beutel / 1000 mL Spülung BTL
1 mL SpritzeVWRBD309628
10 mL SpritzeVWRBD309695
10 % FormalinFisher-Scientific23-245684
18 G NadelVWR89219-294
20 G NadelVWR89219-340
25G NadelVWR89219-290
27G NadelVWR89219-288
5 mL SpritzeVWRBD309646
5% DextrosePatterson Veterinary07-800-9689
AcepromazinPatterson VeterinaryVEDC207
AlfaxalonePatterson Veterinary07-891-6051
AlginatSigma-AldrichPHR1471-1G
Alloxan-MonohydratSigma-AldrichA7413
Angiographie-GerätToshibaInfinix-i
Angiographie-InjektorMedrad
Anti-Maus Ab Alexa 594Thermo Fisher ScientificA-11032Sekundärantikörper für IHC
Anti-Rabbit Ab Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11008Sekundärantikörper für IHC
a-SMA AntikörperAbcamab5694Primärantikörper für IHC
BaytrilBayer Animal Health724089904201Enrofloxacin
Blood Chemistry PanelIDEXX2616Rabbit Panel
BlutdruckmanschetteWelchAllynFlexiport Einweg-Blutdruckmessgerät für Säuglinge Größe 7
Vmed TechnologyVmed Vet-Dop2
BupivacainHenry Schein Medical6023287
BuprenorphinPatterson Veterinary42023017905
Buprenorphin SRZooPharm
CalciumsulfatCB MineralienLebensmittel und pharmazeutische Qualität USP und FCC
Chlorhexidin ScrubPatterson Veterinary07-888-4598
ChloroformFisher-ScientificC298-4
CholesterinSigma-AldrichC8503
DAPIThermo Fisher Scientific62248
OhrvenenkatheterPatterson VeterinarySR-OX165Surflo IV-Katheter
EndotrachealtubusPatterson VeterinarySheridan Marke, abhängig von Kaninchengröße
BlutzuckermessgerätAmazonB001A67WH2Accu-Chek Aviva
Blutzuckermessgerät TeststreifenMcKesson Medizinisch-chirurgische788222Accu-Chek Aviva Plus
GuidewireBoston Scientific39122-01
HaarschneiderAmazonB000CQZI3QOster #40 Klinge
HeizkissenCincinnati Subzero273
HeizkissenPumpe GaymarGaymar T/Pumpe
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Referenzen

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