Effiziente Differenzierung menschlicher pluripotenter Stammzellen in Leberzellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine monolayer, serumfreie Methode zur effizienten Erzeugung von Hepatozyten-ähnlichen Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) in 18 Tagen. Dies beinhaltet sechs Schritte, da hPSCs sequenziell in zwischengeschaltete Zelltypen wie den Primitivstreifen, das definitive Endoderm, das hintere Vorgut und die Leberknospenvorläufer differenzieren, bevor hepatozytenähnliche Zellen gebildet werden.

Zusammenfassung

Die Leber entgiftet Schadstoffe, sezerniert lebenswichtige Proteine und führt wichtige Stoffwechselaktivitäten aus und erhält so das Leben. Folglich ist Leberversagen – das durch chronischen Alkoholkonsum, Hepatitis, akute Vergiftung oder andere Beleidigungen verursacht werden kann – eine schwere Erkrankung, die in Blutungen, Gelbsucht, Koma und schließlich in todbringend gipfeln kann. Jedoch, Ansätze zur Behandlung von Leberversagen, sowie Studien über Leberfunktion und Krankheit, wurden teilweise durch das Fehlen einer reichlichen Versorgung mit menschlichen Leberzellen behindert. Zu diesem Zweck beschreibt dieses Protokoll die effiziente Differenzierung menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs) in Hepatozyten-ähnliche Zellen, geleitet von einer Entwicklungs-Roadmap, die beschreibt, wie das Leberschicksal in sechs aufeinanderfolgenden Differenzierungsschritten spezifiziert wird. Durch die Manipulation von Entwicklungssignalwegen zur Förderung der Leberdifferenzierung und zur expliziten Unterdrückung der Bildung unerwünschter Zellschicksale erzeugt diese Methode effizient Populationen menschlicher Leberknospenvorläufer und Hepatozyten-ähnliche Zellen nach Tagen 6 bzw. 18 der PSC-Differenzierung. Dies wird durch die zeitlich präzise Steuerung von Entwicklungssignalwegen erreicht, die von kleinen Molekülen und Wachstumsfaktoren in einem serumfreien Kulturmedium ausgeübt wird. Differenzierung in diesem System tritt in Monolayern auf und liefert Hepatozyten-ähnliche Zellen, die charakteristische Hepatozytenenzyme exprimieren und die Fähigkeit haben, ein Mausmodell des chronischen Leberversagens zu transplantieren. Die Fähigkeit, effizient eine große Anzahl von menschlichen Leberzellen in vitro zu erzeugen hat Auswirkungen für die Behandlung von Leberversagen, für Dask.-Screening, und für mechanistische Studien von Lebererkrankungen.

Einleitung

Der Zweck dieses Protokolls ist es, menschliche pluripotente Stammzellen (hPSCs) effizient in angereicherte Populationen von Leberknospenvorläufern und Hepatozyten-ähnlichen Zellen²zu differenzieren. Der Zugang zu einer bereiten Versorgung mit menschlichen Lebervorläufern und hepatozytenähnlichen Zellen wird die Bemühungen zur Untersuchung der Leberfunktion und -krankheit beschleunigen und könnte neue zelluläre Transplantationstherapien für Leberversagen ermöglichen^{3,4, 5}. Dies hat sich in der Vergangenheit als herausforderunglich erwiesen, da hPSCs (einschließlich embryonaler und induzierter pluripotenter Stammzellen) sich in alle Zelltypen des menschlichen Körpers differenzieren können; Folglich war es schwierig, sie ausschließlich in eine reine Population eines einzelnenZelltyps, wie Leberzellen 6, zu differenzieren.

Um hPSCs in Leberzellen genau zu differenzieren, ist es zunächst wichtig, nicht nur zu verstehen, wie Leberzellen spezifiziert werden, sondern auch, wie sich Nicht-Leberzelltypen entwickeln. Das Wissen darüber, wie sich Nicht-Leberzellen entwickeln, ist wichtig, um die Bildung von nicht-liver-Linien während der Differenzierung logisch zu unterdrücken und damit ausschließlich hPSCs zu einem Leberschicksal zu führen². Zweitens ist es wichtig, die vielfältigen Entwicklungsschritte zu abgrenzen, durch die sich hPSCs in Richtung eines Leberschicksals differenzieren. Es ist bekannt, dass hPSCs sequenziell in mehrere Zelltypen differenzieren, die als Primitivstreifen (APS), definitives Endoderm (DE), hinteres Vorgut (PFG) und Leberknospenvorläufer (LB) bekannt sind, bevor hepatozytenähnliche Zellen (HEP) gebildet werden. Frühere Arbeiten zeigten die Signale, die das Leberschicksal angeben, und die Signale, die die Bildung von alternativen Nicht-Leber-Zelltypen (einschließlich Magen,Pankreas und Darmvorläufer) bei jeder Entwicklungslinie unterdrückten^{2, 7 , 8}.

Zusammengenommen haben diese Erkenntnisse zu einer serumfreien, monolayerMethode geführt, um hPSCs in Richtung Primitivstreifen, definitives Endoderm, hinteres Vorgut, Leberknospenvorläufer und schließlich Hepatozyten-ähnliche Zellen²zu differenzieren. Insgesamt beinhaltet die Methode die Aussaat von hPSCs in einer Monoschicht mit entsprechender Dichte, die Vorbereitung von sechs Cocktails von Differenzierungsmedien (mit Wachstumsfaktoren und kleinen Molekülen, die verschiedene Entwicklungssignalwege regulieren) und diese Medien sequenziell hinzufügen, um eine Differenzierung im Laufe von 18 Tagen zu induzieren. Während des Prozesses ist keine Passierung von Zellen erforderlich. Da diese Methode explizit Signale enthält, die die Bildung von Nicht-Leberzelltypen unterdrücken, erzeugt dieser Differenzierungsansatz¹ effizienter Lebervorläufer und Hepatozyten-ähnliche Zellen im Vergleich zu Differenzierungsmethoden^2,9,10,11,12. Darüber hinaus ermöglicht das in diesem Text beschriebene Protokoll die schnellere Erzeugung von Hepatozyten, die letztlich höhere Mengen an hepatischen Transkriptionsfaktoren und Enzymen ausdrücken als die anderen Protokolle^{9,10 , 11 , 12}.

Das hier beschriebene Protokoll hat gewisse Vorteile gegenüber aktuellen Differenzierungsprotokollen. Erstens beinhaltet sie eine monoschichtige Differenzierung von hPSCs, was im Vergleich zu dreidimensionalen Differenzierungsmethoden, wie z. B. solchen, die auf embryoiden Körpern beruhen, technisch einfacher ist¹³. Zweitens nutzt diese Methode einen kürzlichen Fortschritt, bei dem definitive Endodermzellen (ein früher Vorläufer von Leberzellen) innerhalb von 2 Tagen nach hPSC-Differenzierung^2,7effizient und schnell erzeugt werden können, um so die Herstellung von Hepatozyten mit erhöhter Reinheit. Drittens produzieren die hepatozytenähnlichen Zellen, die mit dieser Methode² hergestellt werden, in Nebeneinander-Vergleichen mehr ALBUMIN und drücken höhere Konzentrationen von hepatischen Transkriptionsfaktoren und Enzymen aus als Hepatozyten, die in anderen Methoden hergestellt werden^{10, 11,12}.

Protokoll

1. Vorbereitung von Differenzierungsmedien

HINWEIS: Herstellerinformationen zu den verwendeten Materialien und Reagenzien finden Sie in der Tabelle der Werkstoffe.

1. Herstellung chemisch definierter Basismedien (CDM)
   HINWEIS: CDM2, CDM3, CDM4 und CDM5 sind chemisch definierte Medien, die als Basismedien zur Unterscheidung von hPSCs zu Leberzellen in verschiedenen Stadien verwendet werden. Die Zusammensetzung dieser Medien ist Tabelle 1zu finden.
   1. Um CDM2 oder CDM3 herzustellen, bereiten Sie eine Lagerlösung vor, die Polyvinylalkohol (PVA) enthält. Lösen Sie 0,5 g PVA-Pulver in 50 ml des modifizierten Dulbecco-Mediums (IMDM) von Iscove auf, um einen 10 mg/ml PVA-Bestand zu erzeugen.
      HINWEIS: Da sich PVA nicht leicht auflöst, bereiten Sie die PVA/IMDM-Mischung in einem konischen Kolben mit kontinuierlichem Rühren bei 50 °C auf einem Heizkissen vor; Mit einem Magnetrührer kann leicht gerührt werden.
   2. Nachdem PVA in IMDM homogen gelöst ist, entfernen Sie die PVA-Lösung aus dem Heizkissen und lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen.
   3. Verwenden Sie einen sterilen, 0,2 m-Filter, um die PVA-Lösung zu filtern.
   4. Bereiten Sie CDM2 und CDM3 vor, indem Sie die gefilterte PVA aus Schritt 1.1.1 und verschiedene kommerziell erworbene Komponenten kombinieren, wie in Tabelle 1 und der Tabelle der Materialienbeschrieben. Verwenden Sie sterile, 0,2 m Filtereinheiten, um alle Medien zu filtern.
      HINWEIS: Basismedium kann bei 4 °C gelagert werden, jedoch nicht länger als 2 Monate.
   5. Bereiten Sie die verbleibenden Basismedien CDM4 und CDM5 nach Tabelle 1vor.
2. Vorbereitung von Differenzierungsmedien
   1. Um Lagerlösungen für die kleinen Moleküle und Wachstumsfaktoren vorzubereiten, rekonstituieren Sie sie gemäß den Empfehlungen der Hersteller. Zur Lagerung in sterile Schläuche einfließen, um Gefrier-Tau-Zyklen zu reduzieren und bei -20 °C oder wie empfohlen zu halten.
      HINWEIS: Die Zusammensetzung des Differenzierungsmediums, das in verschiedenen Differenzierungsstadien verwendet werden soll, wird in Tabelle 2 und in den folgenden Schritten beschrieben.
   2. Um das Differenzierungsmedium vorzubereiten, tauen Sie zunächst die gefrorenen kleinen Moleküle und/oder Wachstumsfaktoren bei Raumtemperatur auf. Als nächstes aliquot aus der erforderlichen Menge an Basismedium. Schließlich bereiten Sie die endgültigen Differenzierungsmedien vor, indem Sie dem Basismedium die angegebenen kleinen Moleküle und Wachstumsfaktoren bei den entsprechenden Konzentrationen hinzufügen (Tabelle 2).
      HINWEIS: Frisch zubereitetes Differenzierungsmedium sollte idealerweise am selben Tag verwendet werden; andernfalls kann es bei 4 °C gelagert und innerhalb von drei Tagen verwendet werden.
   3. Mischen Sie das Differenzierungsmedium mit hilfe einer Pipettenspitze mehrmals, um sicherzustellen, dass Die Ergänzungen homogen verteilt werden, bevor sie das Medium zu den Zellen hinzufügen (z. B. fügen Sie jedem Bohrkörper einer 12-Well-Platte 1 ml Differenzierungsmedium hinzu).

2. Seed hPSCs auf Platten bei definierten Dichten zur Differenzierung

1. Mantelzellkultur Kunststoffe, die für die Aussaat mit hPSCs verwendet werden.
   1. Die Matrix (z.B. Geltrex) über Nacht bei 4 °C über Nacht vor dem Tag der Anwendung auftauen.
   2. Verdünnen Sie am nächsten Tag die Matrix 1:100, indem Sie 500 l der Matrix in 50 ml kaltes Dulbecco es Modified Eagle es Medium (DMEM)/F12 hinzufügen. Da die Matrix ein Hydrogel ist, das bei Exposition gegenüber Raumtemperatur irreversibel polymerisiert, halten Sie bei der Arbeit mit der Matrix immer die Matrixröhren und Medien auf Eis.
   3. HINWEIS: Die 1:100 in DMEM/F12 gelöste Matrix kann bei 4 °C gelagert werden, sollte aber innerhalb von 2 Monaten verwendet werden.
   4. Um eine Kulturplatte mit der Matrix zu beschichten, pipette die verdünnte Matrix in die erforderliche Anzahl von Bohrungen mit gerade genug Volumen der Matrixlösung, um die Oberfläche des Brunnens zu bedecken (z.B. 0,5 ml Matrix zu einem Bohrwert einer 12-Well-Platte oder 1 ml zu einem Brunnen eines 6- gut Platte). Schütteln Sie die Platte bei Bedarf vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Matrixlösung den Boden des Brunnens vollständig abgedeckt hat.
   5. Lassen Sie die matrixbeschichtete Platte mindestens 60 min in einem 37 °C-Inkubator. Bei dieser Temperatur polymerisiert sich die Matrix zu einem dünnen Film an der Unterseite des Brunnens.
   6. HINWEIS: Matrixbeschichtete Platten können im 37 °C Inkubator aufbewahrt und innerhalb von 3 Tagen verwendet werden, solange die Matrix nicht ausgetrocknet ist.
   7. Saugen Sie die verbleibende Matrixlösung aus den beschichteten Brunnen unmittelbar vor dem Aussaat der Brunnen mit hPSCs.
2. Passieren und Aussäen der beschichteten Platten mit hPSCsNOTE: Das Dissoziationsmittel enthält Enzyme, die Zellen dissoziieren, und es ist wichtig, hPSCs so kurz wie möglich im Dissoziationsmittel zu belassen.
   1. Um Matrix-beschichtete Kulturplatten mit hPSCs vor der Differenzierung auszusäen, wachsen sie undifferenzierte hPSCs gemäß dem Herstellerprotokoll auf >70% Konfluenz in handelsüblichem mTeSR1-Medium (Materialtabelle). Es ist wichtig, hPSCs zu durchführen, bevor sie vollständig konfluent werden, da hPSCs sich spontan bei hohem Zusammenfluss unterscheiden können.
      HINWEIS: hPSCs müssen karyotypisiert werden, um sicherzustellen, dass es keine chromosomalen Anomalien gibt, bevor sie für Experimente verwendet werden. Die für dieses Differenzierungsprotokoll verwendeten hPSCs wurden in mTeSR1-Medien beibehalten und als Klumpen mit EDTA durchzogen, um karyotypische Anomalien zu minimieren. Karotypisch-abnormale hPSCs sollten nicht zur Differenzierung verwendet werden, da sie sich ungewöhnlich schnell vermehren können; Daher sind die hier empfohlenen zellsäenden Dichten nicht für karyotypisch-abnormale Zellen geeignet.
   2. Um hPSCs zur Differenzierung auszusäen, aspirieren sie mTeSR1 aus weitgehend konfluenten hPSC-Kulturen Platte und fügen Sie kommerziell gekaufte Dissoziationsmittel (Tabelle der Materialien) hinzu, um die hPSCs zu dissoziieren, indem Sie gerade genug Dissoziationsmittel verwenden, um die Oberfläche des gut oder Schale, auf der die Zellen wachsen (z.B. 0,5 ml des Dissoziationsmittels pro Brunnen einer 12-Well-Platte, 1 ml pro Brunnen einer 6-Well-Platte oder 3 ml pro 10 cm Schale hinzufügen).
   3. HPSCs im Dissoziationsmittel bei 37 °C für 5 min oder bis einige Kolonien mit der Ablösung beginnen. Tippen Sie vorsichtig auf den Boden des Brunnens/der Platte mehrmals; nach einigen Minuten der Dissoziation sollten die meisten hPSC-Kolonien frei in Suspension kommen.
   4. Um dissoziierte hPSCs von der Platte zu lösen, fügen Sie 2 ml/Well von DMEM/F12 hinzu, wenn Sie mit einer 6-Well-Platte (oder 1 ml/gut bei Arbeiten mit einer 12-Well-Platte) arbeiten, um das Dissoziationsmittel zu verdünnen. Verwenden Sie eine 5 ml serologische Pipette, um Pipette mehrmals vorsichtig nach oben und unten zu spülen, um alle Zellen von der Oberfläche des Brunnens abzuwaschen; resuspendierte Einzelzellen in einem 50 ml konischen Rohr zu sammeln. Waschen Sie die Platte ein zweites Mal mit dem gleichen Volumen von DMEM/F12, um die Wiederherstellung aller hPSCs zu gewährleisten.
   5. Um das 50 ml konische Rohr, das die Zellen enthält, DMEM/F12 hinzuzufügen, um das ursprüngliche Volumen des Dissoziationsmittels um 1:5-1:10 zu verdünnen (z. B. wenn das ursprüngliche Volumen des Dissoziationsmittels 1 ml betrug, stellen Sie das Gesamtvolumen der Zellsuspension auf 10 ml mit DMEM/F12 der Dissoziations-Agent bei 1:10)
   6. Zentrifugieren Sie die gesammelten hPSCs in einem 50 ml konischen Rohr bei 350 x g für 3 min bei 4 °C zu Pelletzellen.
   7. Während Sie darauf warten, dass die Zellen Pellet, Aspirieren Matrix von der Platte, in der die hPSCS wird gesät werden. Als nächstes fügen Sie ausreichende Mengen an mTesR1, ergänzt mit 1 m kommerziell erhaltenem Thiazovivin (einem pharmakologischen ROCK-Hemmer), zu den Empfängerbrunnen hinzu, um sie zu bedecken (z. B. 0,5 ml ml ml TeSR1 pro Brunnen einer 12-Well-Platte oder 1 ml mTeSR1 pro Bohrung einer 6-Well-Platte hinzufügen).
      HINWEIS: Thiazovivin in geringer Konzentration ist in diesem Schritt enthalten, um das Überleben von Einzelzellen und damit die anschließende Saatdichte von hPSCs zu verbessern.
   8. Nach dem Zentrifugieren von hPSCs, saugen Sie vorsichtig den Überstand, so dass die pelleted hPSCs an der Unterseite des konischen Rohres. Der Überstand enthält Dissoziationsmittel, das die nachfolgende Haftung von hPSCs hemmt und daher ist es wichtig, die große Mehrheit des Überstandes zu aspirieren, bevor sie fortfahren.
   9. Setzen Sie das Zellpellet in mTeSR1 wieder auf, ergänzt um 1 M Thiazovivin. Mit einer p1000 Pipette 2-3 Mal sanft trituieren, um das Zellpellet gleichmäßig in eine Einzelzellsuspension zurückzusetzen. Übertrituieren Sie das Zellpellet nicht, da übermäßige mechanische Kraft hPSCs beschädigt und zu einem schlechten Zellüberleben führt.
   10. Nach Resuspension der hPSCs, sofort Pipette 10 l der Suspension in ein Hämozytometer und zählen die Anzahl der Zellen. Es ist wichtig, Pipette-Zellen so schnell wie möglich zu zählen, da die Schwerkraft dazu führt, dass sich hPSCs natürlich in den Boden des 50 ml-Rohrs absetzen, was eine genaue Zellzählung verwirrt.
   11. Passen Sie das Volumen der resuspendierten hPSCs mit thiazovivin-ergänztem mTeSR1 an, um die gewünschte Zellkonzentration für die Beschichtung zu erreichen. Zum Beispiel, nach der Anpassung des Volumens der resuspendierten hPSCs, fügen Sie 0,5 ml der Zellsuspension pro Brunnen zu Samen 160.000-250.000 Zellen in jedem Brunnen einer 12-Well-Platte, wodurch ein Gesamtvolumen von 1 ml in jedem Brunnen erreicht (0,5 ml Medien wurde dem Brunnen in Schritt 2.2.7 hinzugefügt). Wenn größere oder kleinere Brunnen verwendet werden, skalieren Sie die Zellenzahlen/Medienvolumina entsprechend nach oben oder unten.
       HINWEIS: Es ist wichtig, hPSCs bei der angegebenen Zelldichte auszusäen. Zu konfluente hPSCs differenzieren sich nicht effizient, und unterbefließende hPSCs werden während der Differenzierung nicht gut überleben.
   12. Schütteln Sie die Platte in einem Kreuzmuster (links, dann rechts; vorwärts, dann rückwärts) mehrmals, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig über die Platte/well verteilt sind. Wirbeln Sie die Platte nicht in einer kreisförmigen Bewegung, da sich die Zellen in der Mitte der Platte/Well absetzen. In der Regel beginnen hPSCs, sich innerhalb von 3-30 min an der Oberfläche des Brunnens zu halten. Lassen Sie Zellen mindestens 24 h wachsen, bevor sie die Differenzierung einleiten.

3. Differenzierung von hPSCs in endodermale Zellen und Lebervorläufer

1. Nachdem hPSCs mindestens 24 Stunden plattiert wurden (wie in Schritt 2.2.12 beschrieben), überprüfen Sie die Morphologie der Zellen unter einem Phasenkontrastmikroskop, wobei der Schwerpunkt auf dem Durchmesser und der Dichte der plattierten hPSC-Kolonien liegt.
   HINWEIS: Idealerweise sollten Klumpen leicht verteilt werden und von entsprechender Größe und Dichte im gesamten Brunnen vor Schritt 3.2 sein. Große (ca. >400 m) oder kleine Kolonien (ca. <200 m) hPSCs sind für eine Differenzierung nicht verwendbar (Abbildung 4). Differenzierungssignale wirken nicht gleichmäßig in großen hPSC-Kolonien, was zu einer ineffizienten Differenzierung führt. Kolonien, die zu klein sind, überleben in den ersten 3 Tagen der hPSC-Differenzierung in diesem Differenzierungsprotokoll nicht gut. Wenn die Dichte der gesäten hPSCs korrekt ist, bilden die hPSC-Kolonien oft "Brücken" von Zellen zwischen ihnen und der Gesamtzusammenfluss beträgt 30-50%, bevor tag1 Differenzierungsmedium hinzugefügt wird (Abbildung 4).
2. Wenn Koloniegrößen in Schritt 3.1 ideal sind, fahren Sie mit Tag 1 der Differenzierung fort, was die Differenzierung von hPSCs in vorderen Primitivstreifen (APS) mit sich bringt.
3. Bereiten Sie tag1 APS-Differenzierungsmedium vor, indem Sie alle in Tabelle 2 beschriebenen Reagenzien mit CDM 2 (Tabelle 1 und Abschnitt 1.2) als Basismedium mischen. Pipette mehrmals zu mischen, um eine gleichmäßige Verteilung der Komponenten in den Medien zu gewährleisten.
4. Aspirieren, um das Thiazovivin ergänzt emTeSR1 aus den beschichteten hPSCs zu entfernen und kurz hPSCs mit IMDM-Medien zu waschen. Nicht mit Phosphat gepufferter Saline (PBS) anstelle von IMDM waschen, da PBS keine Calciumionen (Ca²⁺⁾fehlt und somit toxisch für hPSCs ist; Es wird die Zellmorphologie stören.
5. Nach der kurzen IMDM-Wäsche, fügen Sie Tag 1 Medium zu den hPSCs hinzu. Erfassen Sie die Zeit und legen Sie Zellen wieder in den 37 °C-Inkubator
6. Fahren Sie mit den nachfolgenden Differenzierungsschritten fort, indem Sie (Tabelle 2) vorbereiten und den Zellen an den jeweiligen Tagen (in 24-stunden-Intervallen) das jeweilige Differenzierungsmedium zur gleichen Tageszeit hinzufügen (Abbildung 1). Ersetzen Sie dies täglich durch frische Medien, auch wenn aufeinander folgende Differenzierungstage die gleichen Differenzierungsmedien verwenden. Zwischen Medienwechseln, Waschen Sie Zellen einmal mit IMDM-Medien, um abgestorbene Zellen und Reste der vorherigen Medium Komponenten zu entfernen.
7. Mit fortschreitender Differenzierung über das Leberknospenstadium hinaus nehmen die Zellzahlen zu und fügen daher jedem Bohrkörper der Platte mehr Medien hinzu, um sicherzustellen, dass die Menge an Differenzierungsfaktoren und Nährstoffen nicht begrenzt wird. Zum Beispiel fügen Sie 1 ml Differenzierungsmedium zu jedem Brunnen von 12-Well zunächst an den Tagen 1 bis 6 der Differenzierung hinzu, aber 1,5-2 ml nachfolgender Differenzierungsmedien an späteren Tagen der Differenzierung (Tage 7 bis 18 der Differenzierung).

4. Charakterisierung von endodermalen Zellen und Lebervorläufern durch Immunostainierung

1. Vorbereiten des Sperrpuffers: 10% Eselserum + 0,1% Triton X100 in deionisierter Phosphatgepufferter Salin (DPBS).
2. Bereiten Sie Färbepuffer vor: 1% Eselserum + 0,1% Triton X100 in DPBS.
3. Aspirieren Sie Medium aus Zellen in 12-Well-Platte.
4. Fügen Sie 4% Paraformaldehyd (in DPBS) für 15 min bei Raumtemperatur hinzu, um Zellen zu fixieren und dann die Zellen zweimal mit DPBS zu waschen.
5. Fügen Sie den Blockierpuffer für 1 h bei Raumtemperatur hinzu, um die festen Zellen zu blockieren und zu permeabilisieren.
6. Aspirieren Sie die Blockierlösung und fügen Sie primären Antikörper in Färbepuffer verdünnt. (Siehe Tabelle der Materialien für Verdünnungsverhältnisse von Antikörpern.)
7. Färben Sie die Zellen über Nacht bei 4 °C.
8. Waschen Sie Zellen dreimal mit 0,1% Triton X100 in DPBS.
9. Fügen Sie sekundären Antikörperfleck in den Färbepuffer für 1 h bei Raumtemperatur hinzu. (Siehe Tabelle der Materialien für Verdünnungen von sekundären Antikörpern.)
10. Entfernen Sie den sekundären Antikörper und fügen Sie DAPI für 5 min bei Raumtemperatur hinzu, um nukleare Gegenfärbung durchzuführen.
11. Zweimal mit 0,1% Triton X100 in DPBS waschen, um überschüssige Antikörper und DAPI zu entfernen.
12. Führen Sie fluoreszenzmikroskopische Daten mit einem Zeiss Observer D1 durch. Alternativ lagern Sie die Platte in 4 °C, bis die Bildgebung durchgeführt wird. Erwartete Ergebnisse finden Sie in Abbildung 3.

5. Charakterisierung von Lebervorläufern durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) Analyse

HINWEIS: Verwenden Sie FACS, um den Prozentsatz der AFP+ differenzierten LB-Zellen, die am 6. Tag der Differenzierung entstehen, genau zu quantifizieren. Befolgen Sie die gleichen Schritte, um den Prozentsatz der ALB+ differenzierten Hepatozyten bis Tag 18 der Differenzierung zu quantifizieren.

1. Konjugieren Sie einen Anti-AFP-Antikörper.
2. Fügen Sie R-Phycoerythrin zu Anti-AFP-Antikörpern in einer Konzentration von (0,55 g/l) mit R-Phycoerythrin-Konjugationskit hinzu (siehe Tabelle der Materialien).
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Antikörper gereinigt und in Puffern, die keine Aumsoen enthalten, rekonstituiert werden. Stellen Sie sicher, dass die in einer Etikettierreaktion verwendete Antikörpermenge kleiner sein muss als die Menge an PE (d. h. 60 g Antikörper mit 100 g PE). Eine schlechte Konjugation von Antikörpern kann zu unzuverlässigen Ergebnissen führen.
3. Fügen Sie 1 L Modifikator-Reagenz für 10 l Antikörper hinzu, der etikettiert werden soll. Mischen Sie sanft.
4. Entfernen Sie die R-PE-Mischung (100 l) und pipette die obige Mischung direkt in das lyophilisierte R-PE Material.
5. Legen Sie die Kappe zurück und lassen Sie die Durchstechflasche bei Raumtemperatur 3 h im Dunkeln stehen.
6. Nach der Inkubation für 3 h oder mehr, fügen Sie 1 l Quencher-Reagenz für 10 l Antikörper verwendet. Das Konjugat kann nach 30 min verwendet werden.
7. Konjugierten Antikörper bei 4 °C lagern.
8. Waschen Sie differenzierte oder undifferenzierte hPSCs im 6-Well-Format mit DMEM/F12.
9. Kurz mit Dissoziationsmittel (1 ml/gut in einer 6-Well-Platte) für 5 min bei Raumtemperatur behandeln, bis sich die Zellen lösen. Ernten und färben sowohl undifferenzierte hPSC als auch differenzierte Lebervorläuferzellen identisch und analysieren parallel im selben Experiment, um die Spezifität der Antikörperfärbung zu gewährleisten.
10. Tippen Sie vorsichtig auf Petrischale, um Zellen zu lösen. Verwenden Sie eine p1000 Pipette, um Zellen von der Platte zu lösen und Zellen in einem 50 ml konischen Rohr zu sammeln. Stellen Sie sicher, dass sich die Zellen größtenteils gelöst haben, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Anschließend spülen Sie Brunnen zweimal mit 1xDPBS Puffer, um Restzellen zu sammeln.
11. In der 50ml konischen Röhre, verdünnt Dissoziationsmittel in 5 Volumen von 1x DPBS Puffer. Trituieren Sie 3-4 Mal mit einer p1000 Pipette, um sicherzustellen, dass alle Zellen in einzelne Zellen getrennt werden.
    HINWEIS: Es ist zwingend notwendig, einzelne Zellen vor der Zentrifugation zu erzeugen oder Klumpen anschließend nicht mit Leichtigkeit zu dissoziieren. Sie sollten jedoch nicht übertrituieren, da dies die Zellintegrität beeinträchtigen kann. Zählen Sie die Anzahl der Zellen und verwenden Sie den empfohlenen Anteil der Zellen an das Antikörperverhältnis, das zuvor für minimale Hintergrund- und maximale Signalerkennung optimiert wurde.
12. Zentrifugenkonusrohr mit der Zellsuspension bei 300 x g für 5 min bei 4 °C.
13. Aspirieren Sie den Überstand mit Vorsicht, um das Zellpellet nicht zu stören.
14. Zellpellet gründlich in Fixierung/Perm-Puffer aufsetzen, um eine einzellige Suspension zu erzeugen und auf Eis bei 4 °C für 20 min zu fixieren. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung eines 2 ml Mikrozentrifugenrohrs in diesem Schritt die Ablagerung des Zellpellets an der V-förmigen Ecke des Rohres, wodurch der Zellverlust während der Wähzeit minimiert wird.
15. Waschen Sie jedes Pellet mit 1,8 ml Perm/Waschpuffer zweimal. Zellpellet gründlich in Perm/Waschpuffer durch Pipette-Mischung 6 mal mit einer p1000 Pipette resuspendieren. Dann Zentrifuge, entfernen Überstand und wiederholen Sie den Waschvorgang mit 1,8 ml Perm /Waschpuffer.
16. Zellpellet im Perm/Waschpuffer wieder aufsetzen, so dass es 100 l/einzelfleck gibt, und anschließend die Zellsuspension in ein 2 ml Mikrozentrifugenrohr übertragen.
    HINWEIS: Es ist zwingend notwendig, in diesem Schritt vor der Antikörperfärbung eine einzellige Suspension zu erzeugen. Aggregate von Zellen werden nicht gefärbt und verwirren daher die FACS-Analyse. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung eines 2 ml Mikrozentrifugenrohrs in diesem Schritt die Ablagerung des Zellpellets an der V-förmigen Ecke des Rohres, wodurch der Zellverlust während der Wähzeit minimiert wird.
17. Nach der Wiederaussetzung von Zellen im FACS-Puffer, aliquot sie in einzelne 2 ml-Röhren (für ungefärbte Kontrolle und Antikörper-gefärbte Proben).
18. Stain mit Anti-AFP-PE 0,33 l pro 150.000 Zellen für 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. Zum Beispiel, für einen 100 l individuellen Fleck, Fleck wie folgt: 0,33 l a-AFP PE und 100 l Perm/Waschpuffer. Stellen Sie Zellen mit p200 Pipette gut aus, um eine gleichmäßige Färbung zu gewährleisten.
    HINWEIS: Nur Pipetten-Mix und nicht Wirbel, da dies die Proteinstabilität reduzieren kann.
19. Waschen, die Zellen zweimal in 1-2 ml Perm/Waschpuffer (1,9 ml/Einzelfleck) und Zentrifuge bei 800 x g für 5 min bei 4 °C wieder aussetzen. Waschen Sie Zellen mit nicht weniger als 1-2 ml Perm/Waschpuffer, um eine ausreichende Wäsche zu gewährleisten.
    HINWEIS: Nur Pipettenmischung und nicht Wirbel, da dies die Proteinstabilität reduzieren kann. Nach der Zentrifugierung, aspirieren Überstand sorgfältig zu verhindern, dass Zellen ausziehen und entfernen so viel Überstand wie möglich, um Antikörper-Übertragung zu minimieren und eine vollständigere Wäsche zu gewährleisten.
20. Setzen Sie jedes gewaschene Pellet in 300 l Perm/Waschpuffer aus und sanieren Sie es durch einen 100-mm-Filter in ein FACS-Rohr, um große Zellklumpen vor der FACS-Analyse zu belasten.
21. Analysieren Sie Zellen auf einer FACS Aria-Flow-Zytometrie auf dem PE-Kanal. Analysieren Sie mindestens 10.000 Ereignisse für jeden einzelnen Fleck und analysieren Sie Ereignisse gemäß der FSC-A/SSC-A-Analyse, wählen Sie Zell-Singlets durch Gating auf FSC-W/FSC-H, gefolgt von SSC-H/SSC-W.

Ergebnisse

Nach 24 h APS-Differenzierung werden Kolonien in der Regel eine andere Morphologie anwenden als undifferenzierte Kolonien, die mit einem Verlust der hellen Grenze einhergehen, die typischerweise hPSC-Kolonien umgibt. Morphologisch haben primitive Streifenzellen im Allgemeinen zerrissene Grenzen und sind stärker verbreitet und weniger kompakt als hPSCs - dies erinnert an einen epitheliaal-mesenchymalen Übergang, da sich pluripotente Epiblastzellen differenzieren und in die primitiven Strei...

Diskussion

Diese Methode ermöglicht die Erzeugung von angereicherten Populationen von Leberknospenvorläufern und anschließend hepatozytenähnlichen Zellen aus hPSCs. Die Fähigkeit, angereicherte Populationen menschlicher Leberzellen zu erzeugen, ist wichtig für die praktische Nutzung solcher Zellen. Frühere Methoden zur Erzeugung von Hepatozyten aus hPSCs ergaben unreine Zellpopulationen, die sowohl Leber- als auch Nicht-Leberzellen enthielten, die bei der Transplantation in Nagetiere neben Lebergewebe¹⁵Knoch...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Geltrex	Thermofisher Scientific	A1569601
1:1 DMEM/F12	Gibco	11320033
0,2  μ m Poren-Membranfilter	Millipore	GTTP02500
mTeSR1	Stem Cell Technologies	5850
Thiazovivin	Tocris Bioscience	3845
Accutase	Gibco oder Millipore	Gibco A11105, Millipore  SCR005
IMDM, GlutaMAX&Handel; Nahrungsergänzungsmittel	Thermofisher Scientific	31980030
Ham's F-12 Nährstoffmischung, GlutaMAX™ Nahrungsergänzungsmittel	Thermofisher Scientific	31765035
KOSR, Knockout-Serumersatz	Thermofisher Scientific	10828028
Poly(vinylalkohol)	Sigma-Aldbsp;	P8136
Transferrin	Sigma-Aldrich
chemisch definiertes Lipidkonzentrat	Thermofisher Scientific	11905031
Human Activin	R& D	338-AC
CHIR99201	Tocris	4423
PI103	Tocris	2930/1
Human FGF2	R& D	233-FB
DM3189	Tocris	6053/10
A83-01	Tocris	2939/10
Human BMP4	R& D	314-BP
C59	Tocris	5148
TTNPB	Tocris	0761/10
Forskolin	Tocris	1099/10
Oncostatin M	R& D	295-OM
Dexamethason	Tocris	1126
Ro4929097	Selleck Chem	S1575
AA2P	Cayman chemicals	16457
Human recombinant Insulin	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 11061-68-0