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Methodenartikel

Immobilisierung von Live Caenorhabditis Elegans Einzelpersonen, die eine ultraflache Polydimethylsiloxan Mikrofluidik-Chip mit Wassereinlagerungen

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DOI:

10.3791/59008

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19. März 2019

 ,  , 
1Department of Radiation-Applied Biology Research, Takasaki Advanced Radiation Research Institute, National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology (QST-Takasaki)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Eine Reihe von Immobilisierung Methoden wurde gegründet, um die gezielte Bestrahlung von live Caenorhabditis Elegans ermöglichen Einzelpersonen mit einer neu entwickelten ultra-dünnen Polydimethylsiloxan mikrofluidischen chip mit Wassereinlagerungen. Dieser Roman auf dem Chip Immobilisierung ist auch ausreichend für imaging-Beobachtungen. Die ausführliche Behandlung und Anwendungsbeispiele des Chips werden erläutert.

Zusammenfassung

Strahlung ist weit verbreitet, für Anwendungen in der Biologie und Ionenstrahl-Zucht, und unter diesen Verfahren Microbeam Bestrahlung stellt ein mächtiges Mittel der Identifizierung von strahlenempfindlichen Websites in lebenden Organismen. Dieses Papier beschreibt eine Reihe von auf dem Chip Immobilisierung Methoden zur gezielten Microbeam Bestrahlung von live Individuen von Caenorhabditis Elegansentwickelt. Insbesondere die Behandlung von Polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluidischen Chips, die wir zuvor entwickelt, um C. Elegans Personen ohne die Notwendigkeit zu immobilisieren, für Anästhesie detailliert erklärt wird. Dieser Chip, genannt ein Wurm-Blatt ist anfällig für mikrofluidische Kanäle erweitert werden können und die Elastizität erlaubt Tiere sanft umhüllt werden. Auch können aufgrund der selbständigen Aufnahmekapazität von der PDMS Tiere verschlossen ist in den Kanälen durch Abdecken der Wurm Blechoberfläche mit einer dünnen Abdeckfolie, in denen Tiere nicht in die Kanäle für das Gehäuse gedrückt werden. Durch Drehen des Deckels film über, können wir leicht die Tiere sammeln. Darüber hinaus das Wurm-Blatt zeigt Wassereinlagerungen und ermöglicht C. Elegans Einzelpersonen mikroskopische Beobachtung über einen längeren Zeitraum unter live-Bedingungen ausgesetzt sind. Darüber hinaus ist das Blatt nur 300 µm dick, so dass schwere Ionen wie Kohlenstoff-Ionen passieren das Blatt umschließt die Tiere, so dass die Ionen Teilchen erkannt werden und die angewandte Strahlendosis genau gemessen werden. Denn Auswahl der Abdeckung Filme verwendet zum umschließen die Tiere sehr wichtig für erfolgreiche langfristige Immobilisierung, wir haben die Auswahl der geeigneten Abdeckfolien und zeigte ein empfehlenswertes Hotel bei einigen Filmen. Als Anwendungsbeispiel des Chips haben wir bildgebende Beobachtung der muskuläre Aktivitäten der Tiere umschließt des mikrofluidischen Kanals das Wurm-Blatt sowie die Microbeam Bestrahlung eingeführt. Diese Beispiele zeigen, dass der Wurm Blätter erheblich die Möglichkeiten für biologische Experimente erweitert haben.

Einleitung

Strahlung, einschließlich Röntgenstrahlen, Gammastrahlen und Schwerionen-Balken, ist weit verbreitet für biologische Anwendungen wie z. B. Krebsdiagnose und Behandlung und für die Ionenstrahl-Zucht. Zahlreiche Studien und technische Entwicklungen konzentrieren derzeit über die Auswirkungen von Strahlung1,2,3. Microbeam Bestrahlung ist ein mächtiges Mittel identifizieren strahlenempfindlichen Standorte in lebenden Organismen4. Die Takasaki Advanced Strahlung Institut des nationalen Forschungsinstitute für Quantum und radiologischen Science and Technology (QST-Takasaki) entwickelt eine Technologie, um einzelne Zellen unter mikroskopischer Beobachtung mit Schwerionen-Bestrahlung Microbeams5, und hat Methoden zur gezielten Microbeam Bestrahlung von mehreren Modell Tieren, wie dem Fadenwurm Caenorhabditis Elegans4,6, Seidenraupen7und Oryzias aktivieren Latipes (japanische Medaka)8. Gezielte Microbeam Bestrahlung von Nematoden C. Elegans ermöglicht die effektive Knockdown von bestimmten Regionen, wie den Nerv-Ring im Kopfbereich, damit um die Rollen dieser Systeme in Prozesse wie Fortbewegung zu identifizieren.

Eine Methode für die auf dem Chip Immobilisierung von C. Elegans Personen ohne die Notwendigkeit für die Anästhesie wurde entwickelt, um Microbeam Bestrahlung4zu ermöglichen. Darüber hinaus zur Verbesserung der in der vorherigen Studie4verwendeten mikrofluidischen Chips entwickelten vor kurzem wir benetzbar, Ion-durchlässig, Polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluidischen Chips, bezeichnet als Wurm Blätter (siehe Tabelle der Materialien), für C. Elegans Individuen9Immobilisierung. Diese bestehen aus ultra-dünnen weichen Laken (Dicke = 300 µm; Breite = 15 mm; Länge = 15 mm) mit mehreren (20 oder 25) gerade mikrofluidischen Kanälen (Tiefe 70 µm; = Breite = 60 µm oder 50 µm; Länge = 8 mm) an der Oberfläche (Abb. 1A-D). Mikrofluidische Kanäle sind offen und können mehrere Tiere gleichzeitig in ihnen eingeschlossen werden (Abbildung 1E). Die Blätter sind anfällig für mikrofluidische Kanäle (von ca. 10 %, Abbildung 1F) erweitert werden können und die Elastizität erlaubt Tiere sanft umhüllt werden. Auch können aufgrund der selbständigen Aufnahmekapazität von der PDMS Tiere verschlossen ist in den Kanälen durch Abdecken der Wurm Blechoberfläche mit einer dünnen Abdeckfolie, in denen Tiere nicht in die Kanäle für das Gehäuse gedrückt werden. Durch Drehen des Deckels film über, können wir leicht die Tiere sammeln.

Die Kanäle nicht zu verletzen die Würmer wenn sie eingeschlossen werden oder wenn sie gesammelt werden. Darüber hinaus sind die Blätter aus PDMS, die im wesentlichen hydrophob ist, aber Wassereinlagerungen durch Vermittlung von Hydrophilie des Materials erreicht werden kann. Die Wassereinlagerungen und Dicke sind günstige Eigenschaften der Wurm Blätter. Die Wassereinlagerungen Kapazität verhindert Austrocknung der Tiere nach längerer Immobilisierung und ermöglicht langfristige Beobachtungen durchgeführt werden.

Darüber hinaus sind bereits9beschrieben, die Blätter nur 300 µm dicken, schwere Ionen wie Kohlenstoff-Ionen (mit einer Reichweite von ca. 1 mm im Wasser) ermöglichen das Blatt umschließt die Tiere durchlaufen. Dadurch können die Ionen Teilchen erkannt werden und die angewandte Strahlendosis genau gemessen werden. Darüber hinaus die Wurm-Blätter können wiederverwendet werden und sind somit wirtschaftlich. Mit der herkömmlichen Injektionsverfahren die Tiere eingeschlossen sind manchmal tot und sie können nicht aus dem Kanal genommen werden; Ihre Eier können auch die Kanäle verstopfen. Dies macht den Chip unbrauchbar. Chips sind daher grundsätzlich Einweg und das Kosten-Nutzen-Verhältnis ist schlecht.

In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir im Detail eine Reihe von Methoden für die auf dem Chip Immobilisierung von live C. Elegans Einzelpersonen mit Wurm Sheets. Durch Fortbewegung Proben von Tieren 3 h nach auf Chip Immobilisierung haben wir die geeigneten Abdeckfolie ausgewertet. Darüber hinaus haben wir die Beispiele der Immobilisierung auf dem Chip für bildgebende Beobachtungen und Microbeam Bestrahlung gezeigt.

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Protokoll

(1) Stämme und Wartung

  1. Wählen Sie eine geeignete Belastung von C. Elegans und Escherichia coli (Lebensmittel) abhängig vom Zweck des Experiments.
    Hinweis: In der vorliegenden Arbeit Wildtyp N210C. Elegans (Abb. 2A) wird im Allgemeinen verwendet, und HBR4:goeIs3 [Pmyo-3::GCamP3.35::unc-54 - 3' Utr, unc-119(+)] V11 ist nur für imaging-Assay eingesetzt. E. Coli OP50 diente als Nahrung für C. Elegans. Einige Mutanten mit abnormen Körperform, wie z. B. die unc-119(e2498) III -Mutante mit aufgerollter Form (Abbildung 2B), können auch in der geraden mikrofluidische Kanäle (Abbildung 2C) eingeschlossen werden.
  2. Pflegen der C. Elegans bei 20 ° C auf 6 cm Petrischalen mit 10 mL der Nematoden Wachstumsmedium (NGM) verteilt über Nacht inkubiert (37 ° c) E. Coli wie zuvor beschrieben10. Wenn möglich, synchronisieren Sie die Entwicklungsstadien von C. Elegans aus dem Embryonalstadium.
  3. Verwenden Sie wohlgenährt adulter Tiere, ca. 3-4 Tage nach dem Schlupf mit einer Breite von etwa 50-60 µm, die optimal auf die Größe der mikrofluidische Kanäle in die Wurm-Blätter sind.

2. Auswahl der Pufferlösung für Immobilisierung auf chip

  1. Verwenden Sie für benetzbar Wurm Blätter Pufferlösung abhängig vom Zweck der Experimente.
    Hinweis: Geeignete Pufferlösungen für auf Chip Immobilisierung auf PDMS mikrofluidischen Chips wurden zuvor definierten9 und die folgenden Pufferlösungen zeigten, haben keinen Einfluss auf die Bewegungsfähigkeit der Tiere nach Immobilisierung: S basale Puffer Lösung (5,85 g NaCl, 1 mL des Cholesterins (5 mg/mL in Ethanol), 50 mL 1 M pH 6.0 Kalium Phosphat, H2O, 1 L; durch Autoklavieren sterilisiert)10 , enthält eine große Menge an NaCl, M9-Phosphat-Puffer-Lösung (5 g NaCl , 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 1 mL 1 M MgSO4H2O, 1 L; durch Autoklavieren sterilisiert)10, waschen-Puffer-Lösung (5 mL 1 M pH 6.0 Kalium Phosphat, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL 1 M MgSO4, Pf Gelatine 0,5 g, H2O, 1 L; durch Autoklavieren sterilisiert)12 mit Gelatine , und Reinstwasser9. In der vorliegenden Arbeit waschen Pufferlösung wird normalerweise verwendet, und S basale Pufferlösung wird nur für die Bewertung der auf dem Chip Immobilisierung mit verschiedenen Abdeckfolien im Abschnitt 3 eingesetzt.
  2. Verwenden Sie für konventionelle mikrofluidischen Chips ohne Benetzbarkeit ein Puffer Waschlösung, die bietet die effektivsten Mittel zur Aufrechterhaltung der Feuchtigkeit in den mikrofluidischen Kanälen des Chips und verhindert so das Trocknen von C. Elegans Einzelpersonen ( unabhängig von der Benetzbarkeit der mikrofluidischen Chips).

3. Auswahl des geeigneten Deckelfolie für Immobilisierung auf chip

  1. Anderes Cover Filme wie folgt vorbereiten. Basierend auf die einfache Handhabung, schneiden die folgenden transparent, biokompatible Abdeckfolien auf eine geeignete Größe (d.h. 10-15 mm Breite und Länge von 30-50 mm): 130-170 µm dicken Deckglas, 125 µm dicken Polyester (PET) Film und ~ 130 µm dicken Polystyrol (PS) Film.
  2. Durchzuführen Sie 3 h auf dem Chip Immobilisierung mit verschiedenen Abdeckfolien wie folgt. Anhand der Schritte 4.1-4.6, umschließen ≥10 adulter Tiere (3,5 Tage nach dem Schlupf) in die Wurm-Blatt mit jeder Abdeckfolie bzw. gewaschen und lassen für 3 h.
  3. Erlauben Sie zu Vergleichszwecken 3 h des freien Warenverkehrs wie folgt. Ort ≥10 gewaschen ausgewachsene Tiere auf einer 3,5 cm Platte mit 3 mL frische NGM mit einem Deckel abdecken und für 3 h zu verlassen.
  4. Sammeln Sie Tiere sofort nach 3 h auf dem Chip Immobilisierung nach Schritte 5.1-5.3. Entfernen Sie die Deckfolie aus dem Wurm Blatt und Tropfen Sie einen Pufferlösung auf jedes Tier. Tiere, die schwimmen in die Tropfen ein Platina-Picker mit abholen und übertragen Sie sie auf eine 3,5 cm Platte mit 3 mL frische NGM ohne Nahrung (Assay Platte).
  5. Tiere nach 3 h des freien Warenverkehrs zu sammeln. Tropfen Sie einen Pufferlösung auf jedes Tier. Nehmen Sie Tiere schwimmen in das Tröpfchen auf der NGM-Platte und übertragen Sie sie auf einem Assay-Platte mit ein Platina-Picker.
  6. Bewerten Sie die Auswirkungen der Deckfolie auf Motilität (Fortbewegung Assay).
    1. Mindestens 5 min nach dem Transfer an der Assay-Platte, Graf ' Körper Kurven (definiert als die Anzahl der Biegungen in der vorderen Körperregion in Abständen von 20-s) manuell unter einem Mikroskop-13.
    2. Führen Sie Fortbewegung Assays fünfmal unabhängig für jede Abdeckfolie.
      Hinweis: In den Experimenten in die repräsentativen Ergebnisse gezeigt, wurden 10 Tiere für jedes Experiment ausgewertet, in denen mehrere Tiere gleichzeitig im Vergleich mit nur fünf Tiere, die in der vorherigen Studie13gezählt eingeschlossen wurden.
    3. Berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl der Körper Kurven für die 10 Tiere in jeder Gruppe für jedes Experiment. Dann die Mittelwerte von fünf unabhängigen Experimenten, die Auswirkungen der auf dem Chip Immobilisierung zu bewerten. Analysieren Sie die Daten statistisch mit einem One-Way Varianzanalyse (ANOVA) Test in ein Tabellenkalkulationsprogramm Ebene Bedeutung von 0,01 und 0,05.
      Hinweis: Anhand dieser Experimente, ein PS-Abdeckfolie mit hohen Sauerstoffdurchlässigkeit wurde als geeignet (siehe die repräsentativen Ergebnisse). Diese PS-Filme sind mit dem Wurm-Blätter enthalten. PET-Folie, die geringe Sauerstoffdurchlässigkeit hat, wurde nicht geeignet erachtet, weil die Tiere dazu neigten, ersticken, wenn sie langfristige Immobilisierung auf den Wurm-Blättern bedeckt. Es ist auch wichtig, dass die Deckfolie nicht während einer Reihe von Verfahren zu brechen; Glasabdeckungen wurden daher auch nicht geeignet (siehe die repräsentativen Ergebnisse).

(4) auf dem Chip Immobilisierung

Hinweis: Zur Vermeidung einer Kontamination der Wurm Blätter sollten Einweg, sterile Handschuhe getragen werden.

  1. Legen Sie eine dünne transparente Folie wie eine PS oder Glas Abdeckung Folie hat keine Autofluoreszenz zur Verwendung als Abdeckung eine Unterfolie auf der experimentellen Schreibtisch oder die mikroskopisch kleinen Bühne. Legen Sie ein Wurm Blatt sanft auf die Unterfolie, Abdeckung mit einer flachen Pinzette.
    Hinweis: Neben den Wurm mit 60 µm-weite mikrofluidische Kanäle (geeignet für Erwachsene 3-4 Tage nach dem Schlupf), Blätter mit 50 µm-weite Kanäle (geeignet für junge Erwachsene 3 Tage nach dem schlüpfen und Mutanten mit kleinen Körper im erwachsenen Stadium) können auch eingesetzt werden. Wählen Sie einen geeigneten Plan basierend auf der Größe der Tiere verwendet werden.
  2. Um Tiere zu sammeln, holen Sie eine einzelne Erwachsene C. Elegans aus der Kultur-Platte unter einem Stereomikroskop mit Platina Kommissionierer ab. Wiederholen Sie den Vorgang, wenn mehrere Tiere benötigt werden.
  3. Waschen Sie die Tiere zur Nahrung (Bakterien) zu entfernen.
    1. Legen Sie mindestens drei Tropfen Pufferlösung (5 µL Tropfen) auf die Oberfläche einer 6 cm unbehandelten (wasserabweisend) Petrischale.
    2. Übertragen Sie die Tiere auf ein Tröpfchen mit einem Platina-Picker und es ermöglichen Sie ihnen, jede Nahrung schwimmend zu entfernen. In zwei separaten Tropfen zweimal waschen Sie und spülen Sie die Tiere in einem anderen Tropfen.
      Hinweis: Es ist notwendig, üben Sie dieses Verfahren, um es schnell ausführen, bevor Sie irgendwelche Experimente durchführen zu können.
  4. Legen Sie 2-3 µL Pufferlösung auf die Oberfläche eines Blattes Wurm. Nehmen Sie die gewaschenen Tiere aus der Tropfen auf der Petrischale und übertragen Sie sie auf das Droplet auf dem Wurm-Blatt.
  5. Setzen Sie Tiere in mikrofluidische Kanäle wie folgt. Ein PS-Abdeckfolie über den Wurm-Bogen mit einer flachen Pinzette und drücken Sie sanft über die Kanäle von einem Ende des Blattes zur anderen weiterhin Feuchtigkeit (wie zuvor beschrieben4,9).
    Hinweis: Tiere sind nach dem Zufallsprinzip in den Kanälen eingeschlossen. Tröpfchen mit Tieren verteilen sich auf das Wurm-Blatt bedeckt das Blatt, was in Tröpfchen wird weithin erstreckte sich über mehrere Kanäle. Jedes Tier kann in einem dieser Kanäle eingeschlossen werden. Der wichtige Punkt bezüglich der Benutzung des Schaublatts Wurm für Immobilisierung auf dem Chip ist, dass mehrere Kanäle über ein weites Gebiet zur Verfügung stehen.
  6. Sofort nach umschließt die Tiere in mikrofluidischen Kanälen, bestätigen, dass sie am Leben sind, durch Bewegung des Kopfes unter dem Mikroskop werden gesucht (z. B. 1 X oder 2 X Vergrößerung).
  7. Des Tieres Stellung, zur gleichen Zeit wie die Durchführung Schritt 4.6 aufnehmen und beachten Sie die folgenden auf einem dedizierten Blatt Papier (ergänzende Datei 1): Nummer des Kanals, in dem das Tier umschlossen ist; Position des Tieres in den Kanal (links/Mitte/rechts); und die Richtung des Kopfes.
  8. Zeichnen Sie einen Pfeil markieren Sie die Position der einzelnen Tiere in den Kanal mit der Richtung des Pfeils, den Kopf des Tieres entspricht.
    Hinweis: Die Kanalnummern (z. B. 1, 5, 10, 15, 20, 25) auf der Oberfläche des Blattes Wurm am linken und rechten Rand der mikrofluidische Kanäle (Abbildung 1B) eingraviert sind. Diese Informationen auf dem eigenen Blatt erlaubt Tiere schnell, damit des Prozess effizienter, und auch verhindert, dass Leckstrahlung während der nachfolgenden Schritte.

(5) Sammlung von Tieren aus einem Wurm-Blatt

  1. Unmittelbar nach Immobilisierung entfernen Sie die Deckfolie aus dem Wurm-Blatt mit einer flachen Pinzette.
  2. Fallen Sie 10-15 µL Pufferlösung auf mikrofluidische Kanäle umschließt die Tiere und beobachten Sie die Tiere in den Tröpfchen unter einem Stereomikroskop schwimmen ab.
    Hinweis: Die Tiere beginnen schwimmen in der neuen Tropfen auf ihre eigenen ohne zusätzlichen Druck, Hilfe oder drücken. So fallen einige Puffer auf ihnen ist genug, um sie aus dem Kanal zu schwimmen. Ein Tier möglicherweise nicht in der Lage, in einem Tropfen zu schwimmen, wenn es äußerst durch Bestrahlung im Schritt 7,9 oder durch den Prozess der Immobilisierung in Schritten 4,2-4,5 beschädigt wurde, obwohl dies selten ist. Wenn das Tier die Deckfolie befestigt, bleibt wenn es entfernt wird, Hinzufügen der Tröpfchen auf der Abdeckfolie statt in die Kanäle.
  3. Die Tiere schwimmen in den Tropfen mit einem Platina Picker holen und auf einem Assay Teller legen.

6. Anwendung der Wurm Blätter für imaging-Beobachtungen

Hinweis: Wurm Blätter können in mikroskopischen Beobachtungen verbreitet werden. Der Chip kann Wasser binden und hat keinen Einfluss auf die Motilität von C. Elegans Individuen nach 3 h auf dem Chip Immobilisierung9. Darüber hinaus hat der Chip selbst kein Autofluoreszenz, eignet sich somit für den Einsatz in Fluoreszenz imaging-Assays. Eine Beispielanwendung für Fluoreszenz-imaging-Assay ist unten angegeben.

  1. Wählen Sie ein Fluoreszenzmikroskop und eine Digitalkamera oder digitale Videokamera am Mikroskop zu erfassen Bilder oder Videos, bzw. zu montieren(Abb. 3).
    Hinweis: Der Arbeitsabstand (WD) des Mikroskops ist mehr als 0,2 mm je nach Objektiv-Spezifikation (siehe Abbildung 3B, C). Die Spezifikation des Systems der Fluoreszenz-Mikroskop verwendet in diesem Papier wird in der Tabelle der Materialienangezeigt. Die Spezifikation ist jedoch nicht beschränkt auf unser Beispiel denn es hängt von dem Zweck der Beobachtung oder / und Benutzer.
  2. Wählen Sie alle fluoreszierenden Stamm von C. Elegans und pflegen Sie wie in Abschnitt 1 beschrieben.
    Hinweis: Wenn es notwendig, die Körperwand Muskelkontraktion zu beobachten (siehe repräsentative Ergebnisse), junge Erwachsene HBR411C. Elegans, in denen ein Reportergen verwendet wird, um das Kalzium-Kennzeichen GCaMP3.35 in allen Muskelzellen der Körperwand express verwenden. Es ist wichtig, junge Erwachsene (≤3 Tage nach dem Schlupf) verwenden, die dünner sind als die Breite der mikrofluidische Kanäle (50 oder 60 µm) von dem Wurm-Blatt. Der kleine Abstand führt dazu, dass die Tiere leicht werden macht es möglich gebogen können, die Muskelkontraktion und Erweiterung beim Krabbeln, beobachten mit Kalzium-Ionen-Kennzeichen.
  3. Gehege der Tiere in Abschnitt 4 des Verfahrens der Immobilisierung führen.
  4. Leuchtstoff Spots von Tieren (z. B.grün fluoreszierende Protein-markierten Stämme) mit einem Fluoreszenzmikroskop zu beobachten, und die Aufnahmen mit einer digitalen Kamera am Mikroskop montiert.
    Hinweis: Führen Sie die zuvor festgelegten Methoden14,15,16, da das Mikroskop Beobachtung Methoden (einschließlich Fluoreszenz Beobachtung) und die Spezifikation des Mikroskop-Systems richtet sich nach der Zweck der Beobachtung.
  5. Bild Kalzium-Ionen Wellenausbreitung mit Videoerfassung, um dynamische Aktivitäten, wie z. B. die Körperwand Muskelkontraktion und den Ausbau der HBR4 Worms (Video 1) zu beobachten.

7. Anwendung von Wurm Blätter für Microbeam Bestrahlung

Hinweis: Der Kollimator Microbeam Bestrahlung System5 können mehrere Schwerionen-Teilchen beschleunigt aus der azimuthally unterschiedlicher Feld Zyklotron in Takasaki-Ionenbeschleuniger für fortgeschrittene Strahlung Anwendung (TIARA) Anlage installiert QST-Takasaki (Abb. 4A). Es ist eine automatische Etappe zur Bestrahlung unter den Strahl Ausgang (Abbildung 4B). Das Verfahren für die Microbeam Schwerionen-Bestrahlung von C. Elegans mit diesem System ist wie folgt.

  1. Suchen Sie das Wurm Blatt umschließt mehrere Tiere auf einem Aluminiumrahmen für die Microbeam-Bestrahlung-Anlage nach Maß und setzen Sie ihn auf der automatischen Bühne zur Bestrahlung (Abb. 4C).
  2. Erhöhen die Bestrahlung Probe (d.h., Tiere in einem Wurm-Blatt auf einem Rahmen eingeschlossen), um sofort unter (~ 2 mm) der Strahl Ausfahrt basierend auf das Monitorbild aus einem Mikroskop befindet sich unter der automatischen Bühne (Abbildung 4D).
  3. Nach der vertikale Positionierung jedes Tier zum Ziel mit der Microbeam Bestrahlung mit der maßgeschneiderten Software für gezielte Bestrahlung von Tieren und Zellkulturen zu finden. Um jedes Tier, eingeschlossen in der Mikrofluidik-Kanal zu finden, beziehen sich auf das spezielle Blatt beschriebenen Schritt 4,7-4,8 (siehe ergänzende Datei 1) und bestätigen Sie die Kanalnummer in der Nähe der linken und rechten Rand der Kanäle.
  4. Steuern, die automatische Phase in der X und Y-Richtung zu positionieren Sie die Tiere nur unter dem Balken mit einer Funkfernbedienung verlassen und eine Lasermaus mit der Bestrahlung-Software betrieben.
  5. Befindet sich etwa Melodie Bereich Bestrahlung durch die Beobachtung der Projektion vom Mikroskop unter der automatischen Bühne der Probe und bewegen des Cursors auf die Bestrahlung Position des Tieres ins Visier genommen werden.
  6. Nach der grobe Positionierung beenden und schließen die Bestrahlung Zimmer und bewegen in den angrenzenden Kontrollraum zu bestrahlen die Betreiber.
  7. Satz ein Ion-Zähler-System die gewünschte Anzahl von Ionen Teilchen für eine Bestrahlung Verfahren entsprechend Bestrahlung einer bestimmten Region des Tieres, mit der Konsole verbunden.
    Hinweis: Dies besteht aus einem Kunststoff Szintillator und Photoelektronen Multiplikator im Kollimator Microbeam Bestrahlung System.
  8. Optimieren Sie von der Bestrahlung Leitwarte die Position der Tiere, basierend auf dem Monitorbild vom Mikroskop befindet sich unter der automatischen Phase, die das gleiche auf dem Monitor in der Bestrahlung Zimmer (Abbildung 4E) projiziert Bild.
  9. Ziel Microbeam Bestrahlung durch Klicken der Schaltfläche "Bestrahlung" der Software zur Bestrahlung.
    Hinweis: In dem Beispiel in Abbildung 4F, wir richten den Pharynx im Kopfbereich und Bestrahlen mit der entsprechenden Anzahl von Microbeam Kohlenstoff-Ionen. Da die Anzahl der Ionen Teilchen, die durch die Probe mit einem Ion-Zähler-System in Verbindung mit der Konsole und die Bestrahlung Software gezählt wird, wird die Bestrahlung nach Lieferung der gewünschten Anzahl von Ionen Teilchen gestoppt.
  10. Suchen Sie jedes Tier auf dem eigenen Blatt verzeichneten und gezielte Bestrahlung auf jedes Tier durchführen. Wiederholen Sie die Schritte 7,8 und 7,9, bis alle Tiere bestrahlt wurde.
  11. Sofort nach der Bestrahlung betreten Sie die Bestrahlung und senken Sie die automatische Bestrahlung-Bühne. Entfernen Sie die Probe auf die maßgeschneiderte Rahmen befindet sich auf der automatischen Bühne.
  12. Sammeln Sie die Tiere wie in 5.1-5.3 beschrieben.
  13. Verhaltens und/oder molekulare Analysen durchführen Sie, wie erforderlich, um die Bewertung der Auswirkungen der gezielte Bestrahlung, abhängig vom Zweck der Studie.
    Hinweis: Die Fortbewegung-Assay im Schritt 3.6 beschrieben ist eine effektive Methode zur Bewertung der Auswirkungen der Bestrahlung auf Motilität4,9.

8. Behandlung der Wurm Blätter zur wiederholten Verwendung

Bemerkung: Wurm Blätter kann wiederholt verwendet mindestens 10 Mal9 mit keine negativen Auswirkungen auf die Tiere wenn gereinigt und sterilisiert werden wie folgt nach Gebrauch ordnungsgemäß.

  1. Reinigung
    1. Legen Sie die verwendeten Wurm Blatt auf ein 6 cm Petrischale- and -drop ca. 100 µL der sterilisierten Reinstwasser auf das ganze Blatt.
    2. Paddel das Wasser auf der Oberfläche des Blattes mit Finger behandschuhten waschen Schmutz wie Staub und Bakterien Essen keine Eier gelegt in den Kanälen.
    3. Wischen Sie die Feuchtigkeit aus dem Wurm Blatt gründlich mit Einwegtücher.
  2. Sterilisation
    1. Injizieren Sie ca. 5 mL 70 % igem Ethanol in der Petrischale mit dem Wurm Blatt und paddeln Sie der Blechoberfläche mit behandschuhten Fingern den Schmutz abwaschen.
  3. Trocknung
    1. Entfernen Sie die Späne aus der Petrischale gefüllt mit 70 % Ethanol und an der Luft trocknen lassen.
  4. Lagerung
    1. Nach dem Trocknen, legen Sie das Wurm-Blatt auf eine sterile Petrischale und abdecken. Platten können auch auf eine sterile Petrischale gefüllt mit 70 % Ethanol gelagert werden.
      Hinweis: Es ist besser, den Abdeckfolien nach Gebrauch entsorgen, aber wenn sie sind wiederverwendbar, reinigen Sie sie wie gemacht für den Wurm-Bogen. Jedoch wenn Falten auf der Abdeckfolie entwickeln nach Gebrauch es haften nicht mehr an den Chip, was zu Austrocknung der Tiere, und deshalb ausgetauscht werden.

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Ergebnisse

Aktive C. Elegans Einzelpersonen konnten erfolgreich mit einer ultradünnen, benetzbar PDMS, Mikrofluidik-Chip (Wurm Blatt) immobilisiert werden. Wir untersuchten die Eignung der verschiedenen Abdeckfolien für den Wurm Dichtungsplatte, wie im Protokoll Abschnitt 3 beschrieben. Um die Abdichtung Auswirkungen der Abdeckung Filme zu bewerten, wir entschlossen die Bewegungsfähigkeit der Tiere 3 h nach auf Chip Immobilisierung mit Deckglas (Dicke: 130-170 µm), PET-Folien (Stärke: 125 µ...

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Diskussion

Auf dem Chip Immobilisierung von C. Elegans unter live-Bedingungen mit einem benetzbar PDMS-Mikrofluidik-Chip ermöglicht die effiziente zielgerichtete Microbeam Bestrahlung von mehreren Tieren. Die einfache Handhabung und Funktionen, um Austrocknen zu verhindern machen dieses System für Anwendungen geeignet, nicht nur in Microbeam Bestrahlung, sondern auch in mehreren Verhaltensstörungen Assays. Dieser Wurm Blätter haben bereits in den Handel gebracht worden und leicht zu erhalten. Konventionelle mikrofluidische...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Autoren danken Dr. Atsushi Higashitani für freundliche Beratung bezüglich der Behandlung von C. Elegans und DRS. Yuya Hattori, Yuichiro Yokota und Yasuhiko Kobayashi für wertvolle Diskussionen. Die Autoren danken den Caenorhabditis genetischen Center für die Bereitstellung von C. Elegans und E. Coli-Stämme. Wir danken die Crew des Zyklotrons TIARA bei QST-Takasaki für die freundliche Unterstützung bei der Bestrahlung Experimente. Wir danken Dr. Susan Furness zur Bearbeitung eines Entwurfs dieser Handschrift. Diese Studie wurde zum Teil durch KAKENHI (Grant-Nummern JP15K11921 und JP18K18839) von JSPS, M.S unterstützt

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
C. elegans Wildtyp-StammCaenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USAN2Wildtyp-Stamm C. elegans Stamm, der in dieser Studie im Allgemeinen verwendet wird
C. elegans unc-119(e2498) III mutierter StammCaenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USACB4845C. elegans Stamm, der nur als Beispiel für Mutanten mit abnormaler Körperform verwendet wird 
C. elegans transgener Stamm HBR4Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USAHBR4Der Genotyp dieses transgenen C. elegans Stammes ist HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54– 3' utr, unc-119(+)]V. Dieser Stamm wurde nur für die bildgebende Beobachtung eingesetzt.
E. coli StammCaenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USAOP50E. coli Stamm, der als Futter für C. elegans
Worm Sheet IR (50/60)Biocosm, Inc., Hyogo, JapanBCM17-0001Mikrofluidischer Chip mit 25 geraden 50/60-& Mikro; M breite Kanäle, die in allen Experimenten und Beobachtungen in dieser Arbeit verwendet wurden 
Worm Sheet 60Biocosm, Inc., Hyogo, JapanBCM18-0001Mikrofluidischer Chip mit 20 geraden 60 & Mikro; Kanäle mit M-Breite. Dies ist für erwachsene Tiere 3-5 Tage nach dem Schlüpfen bei 20°C möglich.
Worm Sheet 50Biocosm, Inc., Hyogo, JapanBCM18-0002Mikrofluidischer Chip mit 20 geraden 50 & Mikro; Kanäle mit M-Breite. Dies ist für erwachsene Tiere ~3 Tage nach dem Schlüpfen bei 20°C möglich.
MICRO COVER GLASMATSUNAMI GLASS IND. LTD.C030401Deckglas (Dicke: 130-170 & Mikro; m) wird in Lokomotions-Assays in Protocol 3
Polystyrene FilmBiocosm, Inc., Hyogo, Japanverwendet BCM18-0001/ BCM18-0002Gebündelte Artikel von Wurmblättern. PS filim (Dicke: ~130 µ m) wird in Fortbewegungstests im Rahmen von Protokoll 3 verwendet.
Polyesterfolie LumirrorTORAY INDUSTRIES, INC., Tokio, JapanLumirror T60 (t 125 µ m)PET Filim (Dicke: 125 &Mikro; m) wird in Lokomotions-Assays in Protokoll 3
IWAKI 60 mm/unbehandelte SchaleAGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan) verwendet.1010-060Unbehandelte Schale zur Inzuvation von C. elegans in Protokoll 1
IWAKI 35 mm/unbehandelte SchaleAGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan).1010-035Unbehandelte Schale, die in Lokomotions-Assays verwendet wird Protokoll 3
Milli-QMerck, FrankreichReinstwasser
Kimwipe S-200Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokio, Japan62020120 mm x 215 mm; 200 Blatt/Karton
WormStuff Worm PickGenesee Scientific Corporation, CA, USA)59-AWPPlatin-Picker, spezialisiert auf die Aufnahme von C. elegans
Forschung Stereomikroskop-SystemOLYMPUS CORPORATION, Tokio, JapanSZX16Mikroskop, das in allen Experimenten und Beobachtungen in dieser Arbeit verwendet wird
Motorisiertes Fokusstativ für SZX16OLYMPUS CORPORATION, Tokio, JapanSZX2-ILLBDies wurde für die Hellfeldbeobachtung in Protokoll 3-8 verwendet.
Objektiv (&mal; 1)OLYMPUS CORPORATION, Tokio, JapanSDFPLAPO1× PFNA: 0,15; W.D.: 60 mm. Dieses Darlehen wurde für die Hellfeldbeobachtung in Protokoll 3-8 verwendet.
Objektiv (&mal; 2)OLYMPUS CORPORATION, Tokio, JapanSDFPLAPO2XPFCNA: 0,3; W.D.: 20 mm. Das  Lends wurde für bildgebende Beobachtungen verwendet.
Quecksilber-LichtquelleOLYMPUS CORPORATION, Tokio, JapanU-LH100HGDas breite Emissionsspektrum ermöglicht die Durchführung einer Reihe von Fluoreszenzbildgebungsexperimenten mit allen gängigen Fluorophoren.
SZX16 Leuchtstofffiltereinheit (Hohe Leistung für YFP)OLYMPUS CORPORATION, Tokio, JapanSZX2-FYFPHQEx: 490-500 nm; Em: 510-560. Dies wurde für die bildgebende Beobachtung des HBR4-Stammes verwendet.
Digitalkamera High Speed EXILIMCASIO COMPUTER Co., Ltd, Tokio, JapanEX-F1 Die Abbildungen 1B, 1E, 1F, 2A-C und Video 1 wurden mit dieser Digitalkamera aufgenommen.
Office 2013Microsoft Co. Ltd, Redmond, WA, USAEXCEL Software für statistische Analysen

Referenzen

  1. Funayama, T., Hamada, N., Sakashita, T., Kobayashi, Y. Heavy-Ion microbeams-development and applications in biological studies. IEEE Transactions on Plasma Science. 36 (4), 1432-1440 (2008).
  2. Tanaka, A., Shikazono, N., Hase, Y. Studies on biological effects of ion beams on lethality, molecular nature of mutation, mutation rate, and spectrum of mutation phenotype for mutation breeding in higher plants. Journal of Radiation Research. 51 (3), 223-233 (2010).
  3. Ghita, M., Fernandez-Palomo, C., Fukunaga, H., Fredericia, P. M., Schettino, G., Bräuer-Krisch, E., Butterworth, K. T., McMahon, S. J., Prise, K. M. Microbeam evolution: from single cell irradiation to pre-clinical studies. International Journal of Radiation Biology. 94 (8), 708-718 (2018).
  4. Suzuki, M., Hattori, Y., Sakashita, T., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. Region-specific irradiation system with heavy-ion microbeam for active individuals of Caenorhabditis elegans. Journal of Radiation Research. 58 (6), 881-886 (2017).
  5. Funayama, T., Wada, S., Yokota, Y., Fukamoto, K., Sakashita, T., Taguchi, M., Kakizaki, T., Hamada, N., Suzuki, M., Furusawa, Y., Watanabe, H., Kiguchi, K., Kobayashi, Y. Heavy-ion microbeam system at JAEA-Takasaki for microbeam biology. Journal of Radiation Research. 49 (1), 71-82 (2008).
  6. Sugimoto, T., Dazai, K., Sakashita, T., Funayama, T., Wada, S., Hamada, N., Kakizaki, T., Kobayashi, Y., Higashitani, A. Cell cycle arrest and apoptosis in Caenorhabditis elegans germline cells following heavy-ion microbeam irradiation. International Journal of Radiation Biology. 82 (1), 31-38 (2006).
  7. Fukamoto, K., Shirai, K., Sakata, T., Sakashita, T., Funayama, T., Hamada, N., Wada, S., Kakizaki, T., Shimura, S., Kobayashi, Y., Kiguchi, K. Development of the irradiation method for the first instar silkworm larvae using locally targeted heavy-ion microbeam. Journal of Radiation Research. 48 (3), 247-253 (2007).
  8. Yasuda, T., Kamahori, M., Nagata, K., Watanabe-Asaka, T., Suzuki, M., Funayama, T., Mitani, H., Oda, S. Abscopal activation of microglia in embryonic fish brain following targeted irradiation with heavy-ion microbeam. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1-15 (2017).
  9. Suzuki, M., Sakashita, T., Hattori, Y., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, Aug 1 32-37 (2018).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  11. Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus. Worm. 1 (1), 12-14 (2012).
  12. Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. Experimental Biology. 204, Pt 10 1757-1764 (2001).
  13. Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. C. elegans locomotory rate is modulated by the environment through a dopaminergic pathway and by experience through a serotonergic pathway. Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).
  14. Momma, K., Homma, T., Isaka, R., Sudevan, S., Higashitan, A. Heat-induced calcium leakage causes mitochondrial damage in Caenorhabditis elegans body-wall muscles. Genetics. 206 (4), 1985-1994 (2017).
  15. Kerr, R. A. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. 2, 1-13 (2006).
  16. Aubry, G., Lu, H. A perspective on optical developments in microfluidic platforms for Caenorhabditis elegans research. Biomicrofluidics. 8, 011301(2014).
  17. Lumirror Catalog. TORAY. , Available from: https://www.toray.jp/films/en/products/pdf/lumirror.pdf (2018).
  18. Otobe, K., Itou, K., Mizukubo, T. Micro-moulded substrates for the analysis of structure-dependent behaviour of nematodes. Nematology. 6 (1), 73-77 (2004).
  19. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  20. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab on a Chip. 7 (11), 1515-1523 (2007).
  21. Lockery, S. R., Lawton, K. J., Doll, J. C., Faumont, S., Coulthard, S. M., Thiele, T. R., Chronis, N., McCormick, K. E., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. Artificial dirt: Microfluidic substrates for nematode neurobiology and behavior. Journal of Neurophysiology. 99 (6), 3136-3143 (2008).
  22. Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 5 (12), 1888-1902 (2010).
  23. Fehlauer, H., Nekimken, A. L., Kim, A. A., Pruitt, B. L., Goodman, M. B., Krieg, M. Using a microfluidics device for mechanical stimulation and high resolution imaging of C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (132), e56530(2018).

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