Summary
Ex vivo культуры костных explants может быть ценным инструментом для изучения физиологии костей и потенциальной оценки препаратов в костной ремоделирования и костных заболеваний. Представленный протокол описывает подготовку и культуру кальварии, изолированных от новорожденных черепов мышей, а также их применение.
Abstract
Кость представляет собой соединительную ткань, образовавизированную из остеобластов, остеоцитов, остеокластов и минерализованной внеклеточной матрицы, что придает ей силу и гибкость и позволяет выполнять свои функции. Кость постоянно подвергается воздействию различных стимулов, которые в патологических условиях могут дерегулировать ремоделирование костей. Для изучения биологии костей и заболеваний и оценки потенциальных терапевтических агентов, было необходимо разработать в пробирке и in vivo моделей.
Данная рукопись описывает процесс вскрытия и культурные условия кальварии, изолированные от неонатальных мышей для изучения формирования костей и микроокружения костной опухоли. В отличие от моделей in vitro и in vivo, эта модель ex vivo позволяет сохранять трехмерную среду ткани, а также клеточное разнообразие кости при культивации в определенных условиях для имитации желаемой микросреды. Таким образом, можно исследовать костной ремоделирования и ее механизмы, а также взаимодействия с другими типами клеток, таких как взаимодействие между раковыми клетками и кости.
В анализах, представленных здесь, используются кальварии от 5-7-дневных мышей BALB/C. Полученные геми-кальвары культивируются в присутствии инсулина, раковых клеток молочной железы (MDA-MB-231), или обусловленной среды от культур раковых клеток молочной железы. После анализа было установлено, что инсулин индуцировал новое формирование костей, в то время как раковые клетки и их обусловленная средняя индуцированная резорбция костей. Кальвариальная модель успешно используется в фундаментальных и прикладных исследованиях для изучения развития костей и онкологических заболеваний костей. В целом, это отличный вариант для легкого, информативного и недорогого асссе.
Introduction
Кость является динамической соединительной ткани, которая имеет несколько функций, в том числе поддержку мышц, защиты внутренних органов и костного мозга, а также хранения и высвобождения кальция и факторов роста1,2. Для поддержания целостности и правильной функции костная ткань постоянно находится в процессе ремоделирования. В общих чертах цикл ремоделирования костей можно разделить на костную резорбцию и формирование костей1. Дисбаланс между этими двумя фазами ремоделирования костей может привести к развитию костных патологий. Кроме того, такие заболевания, как рак молочной железы, часто влияют на целостность костей; примерно более 70% пациентов на поздних стадиях имеют или будут иметь метастазы в кости. Когда раковые клетки молочной железы попадают в кости, они влияют на метаболизм костей, что приводит к чрезмерной резорбции (остеокластические поражения) и/или образованию (остеобластные поражения)3.
Чтобы понять биологию костных заболеваний и разработать новые методы лечения, необходимо понять механизмы, связанные с ремоделированием костей. В исследованиях рака, важно исследовать процесс метастазировать костей и его отношение к метастатической микросреды. В 1889 году Стивен Пэджет предположил, что метастазы возникают, когда есть совместимость между опухолевыми клетками и целевой ткани, и предположил, что метастатический сайт зависит от сродни опухоли для микросреды4. В 1997 году и Гиз ввели концепцию порочного цикла метастаз костей, чтобы объяснить, как опухолевые клетки модифицируют микроокружение костей для достижения их выживания и роста, и как микроокружение кости способствует их росту, предоставляя кальций и факторы роста5,6,7.
Для характеристики механизмов, связанных с ремоделированием костей и метастазами костей, и для оценки молекул с возможным терапевтическим потенциалом, необходимо разработать модели in vitro и in vivo. Тем не менее, эти модели в настоящее время представляют собой множество ограничений, таких как упрощенное представление микроокружения кости, и их стоимость8,9. Культура костных экскультур explants ex vivo имеет то преимущество, что поддерживает трехмерную организацию, а также разнообразие костных клеток. Кроме того, можно контролировать экспериментальные условия. Модели explant включают культуру плюсневых костей, бедренных головок, calvarias, и mandibular или trabecular сердечников10. Преимущества моделей ex vivo были продемонстрированы в различных исследованиях. В 2009 году Nordstrand и сотрудники сообщили о создании модели кокультуры, основанной на взаимодействии между клетками костей и рака предстательной железы11. Кроме того, в 2012 году Кертин и его коллеги сообщили о разработке трехмерной модели с использованием ex vivo cocultures12. Цель таких моделей ex vivo – как можно точнее воссоздать условия микроокружения костей, чтобы иметь возможность охарактеризовать механизмы, участвующие в нормальной или патологической ремоделировании костей, и оценить эффективность новых терапевтических агентов.
Настоящий протокол основан на процедурах, опубликованных Гарреттомичем и Мохаммадом и др.14. Неонатальные мыши кальварии культуры были использованы в качестве экспериментальной модели, так как они сохраняют трехмерную архитектуру кости в стадии разработки и костных клеток, в том числе клеток на всех стадиях дифференциации (т.е., остеобласты, остеокласты, остромальные клетки), которые приводят к зрелым остеокластам и остеообластов, а также минерализованной матрицы14. Модель ex vivo не представляет патологический процесс костных заболеваний полностью. Тем не менее, влияние на костной ремоделирования или рак индуцированного костного остеолиза могут быть точно измерены.
Кратко, этот протокол состоит из следующих шагов: вскрытие calvarias от 5-7 дней мышей, кальварии прекультуры, кальварии культуры приложений (например, культура в присутствии инсулина, раковых клеток или условных среды, и даже агентов с терапевтический потенциал, в соответствии с целью исследования), фиксация костей и декальцинации кальварии, обработка тканей, гистологический анализ, и интерпретация результата.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все мыши, используемые в этих анализов были получены из BALB/c штаммов мышей, используя мужчин и женщин мышей без разбора. Предыдущие эксперименты культуры также были выполнены с использованием других штаммов, таких как FVB, швейцарских мышей, CD-1, и CSA мышей11,12,14. Все мыши были размещены в соответствии с Национальными институтами здравоохранения (NIH) руководящие принципы, Приложение No. Процедуры с участием животных субъектов были одобрены институционального ухода за животными и использования комитета (IACUC) в Центре научных исследований и высшего образования в Энсенаде (CICESE).
1. Кальварское вскрытие
- Стерилизовать приборы для вскрытия (например, 1 х 2 щипцы ткани зубов, прямые хирургические ножницы, рассекающие ножницы, тонко опрокинутые пинцеты, тонкий изогнутый кончик рассекающие щипцы, рассекающие щипцы, рассекающие щипцы, скальпель). Стерильная дистиллированная вода может быть использована для очистки хирургических инструментов между каждым вскрытием, а стерильные 1x PBS могут быть использованы для очистки каждой геми-кальварии.
- Поместите стерильные приборы для вскрытия, воду, 1x PBS и необходимые материалы для проведения процедуры (например, микропипеты, осаждаемые стаканы, стерильные блюда Петри) в ламинарный капюшон.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите всю процедуру в стерильных условиях. - Добавьте 12 мл стерильных 1x PBS в две 10 см посуды Петри.
- Выберите щенков и поместите их рядом с капотом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вскрыть calvarias от 5-7 дней старых щенков. - Выберите и удерживайте мышь тщательно с помощью рассекающихщися щипц.
- Обезглавить мышь, используя рассекающие ножницы и поместите голову в чашку Петри с PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обезглавливание не подходит для пожилых мышей. Если эксперимент должен быть сделан со взрослыми мышами, метод эвтаназии должен быть изменен в соответствии с правилами экспериментов на животных. - Держите голову твердо области носа с 1 х 2 щипцвыще й 2 ткани зубов и удалить кожу над черепом, пока кальвария не видна.
- Определите швы (т.е. сагиттал, коронал и лямбдоид) черепа на открытой кальварии.
- Проникать кончиком микросцизоров примерно на 2 мм за швом лямбдоида и сделайте прямой разрез рядом с ним.
- Вставьте кончик микросцизоров на задней стороне черепа. Сделайте прямой разрез вдоль дистальной стороны шва лямбдоида к корональном шву. Продолжить аналогичным образом с другими лямбдоидный шов.
- Сделайте еще один разрез (под углом 45 градусов), чтобы соединить конец разреза, сделанного с разрезом передней фонтана.
- Повторите шаги 1.10 и 1.11 с другим швом lambdoid.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно определить швы, чтобы сделать соответствующие сокращения и быть в состоянии выполнять адекватные встраивания и анализа данных. - Используйте тонкие наконечникщины, чтобы удалить кальварию и поместить его в чашку Петри. С помощью скальпеля, сделать прямой разрез из задней фонтанеля вдоль сагитального шва через корональный шов и заканчивается в передней фонтанель, чтобы получить два геми-кальварии.
- Возьмите каждый из геми-кальварии с тонкой наконечником пинцета и поместите их в новое блюдо Петри, содержащее PBS.
2. Культура Кальварии
- Добавьте 1 мл высокоглюкозного Среднего DMEM, дополненного 0,1% бубовой сыворотки альбумина (BSA) и 1% антибиотик/антимикот (т.е. пенициллина и стрептомицина) в колодцах 24 скважины. С тонкой кончик щипцы, забрать каждый hemi-calvaria и поместить его в колодец.
ПРИМЕЧАНИЕ: Положите геми-кальварии вогнутой стороны вниз. - Инкубировать геми-кальварии для 24 ч при 37 C с 5% CO2.
- Удалите культурную среду из каждого колодца и добавьте 1 мл свежих носителей, содержащих соединение, для тестирования или условных носителей из других клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте по крайней мере три геми-кальварии для каждой группы лечения и использовать отрицательные и положительные элементы управления. - Инкубировать геми-кальварии в течение 7 дней, меняя средства массовой информации каждые 2-3 дня.
3. Культура с раковыми клетками
- Выберите чашку Петри с раковыми клетками при слиянии 80-90% и протрите их. Чтобы попробовать промывку, мыть раковые клетки 1x с помощью PBS (5 мл на 75 см2 колбы), а затем инкубации в растворе HBSS, содержащем 0,05% трипсин и 0,53 мм EDTA (2 мл на 75 см2 колбы).
- Перенесите суспензию клетки в коническую трубку 15 мл и центрифугу при 800 х г в течение 5 мин при комнатной температуре (RT).
- Удалите и отбросьте супернатант.
- Приостановить гранулы в 2 мл DMEM, содержащий 2% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) и 1% антибиотик / антимикотический. Считайте живые клетки.
- Присваивайте геми-кальварии каждой исследуемой группе (т.е. группе отрицательного контроля и кокультуры для анализа РНК или гистологии).
- Удалите культуры средств массовой информации из геми-кальварии и добавить 1 мл DMEM, содержащий 2% FBS и 1% антибиотик / антимикотические дополнены или не дополнены раковыми клетками.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ячеек, чтобы добавить может меняться в зависимости от клеточной линии испытания. С раковыми клетками, такими как MDA-MB-231 или PC-3, 500 000 клеток на хорошо работают надлежащим образом. - Инкубировать в течение 24 ч при 37 градусах Цельсия с 5% CO2. Передайте каждую геми-кальварию новому колодцу, чтобы сохранить только раковые клетки, которые придерживались костной ткани.
- Инкубировать в течение 7 дней при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 и менять средства массовой информации каждые 2-3 дня.
4. Фиксация
- Вырезать квадраты бумаги ткани, чтобы обернуть геми-кальварии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Биопсия пены колодки или стальные капсулы для небольших биопсий также могут быть использованы. - Используйте прямые тонкой кончик щипцы, чтобы забрать каждый hemi-calvaria от sagittal шов, место на бумаге ткани, и оберните.
- Поместите завернутый геми-кальвария внутри помечены встраивая кассету.
- Поместите кассету в контейнер с 10% фосфат-буфером формалина.
- Исправить 24 ч при 4 градусах Цельсия.
5. Декальциация
- Удалить формалин, добавить 1x PBS, и агитировать ткани в течение 30 минут, чтобы промыть геми-кальварии.
- Удалить PBS и добавить 10% EDTA (pH 8, 0,34 М).
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что раствор покрывает ткани полностью. - Декальцифифицировать ткани в течение 48 ч при 4 градусах Цельсия.
- Откажитесь от раствора EDTA и добавьте 1x PBS, чтобы промыть ткань.
- Храните геми-кальварии в 70% этанола до гистологии обработки.
6. Обработка тканей
- Обезвоживать ткани с раундами 96% этанола, 60 мин (3x), а затем 100% этанола, 60 мин (3x).
- Замените этанол на 100% ксилена, 60 мин (3x).
- Инкубировать кассеты в парафиновый воск, 60 мин (2x).
7. Встраивание
- Откройте кассеты, аккуратно удалите бумажную ткань и разверните кальварию.
- Возьмите каждую кальварию тщательно и стек все hemi-calvarias из той же группы в той же ориентации.
- Положите парафина в форму.
- Возьмите все геми-кальварии с щипками и поместите их в форму с sagittal шов вниз к основанию формы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ориентация геми-кальварии в плесени во время включения имеет решающее значение для получения последовательных гистологических разделов и воспроизводимых результатов, потому что эта ориентация позволит задней идентификации передней и теменной кости из calvarias и коронарный шов, облегчающий количественную оценку. - Отпустите щипц и убедитесь, что геми-кальварии остаются на месте.
- Поместите помеченную кассету поверх формы и заполните ее более парафина, чтобы покрыть геми-кальварии.
- Переместите формы на холодную поверхность.
8. Секция
- Обрезка 500-600 мкм сагитального шва с микротомом.
- Вырезать 4 мкм толщиной разделов, и собирать разделы необходимо.
- Обрезать еще 300 мкм.
- Вырезать и собрать еще шесть 4 мкм толщиной разделов.
- Обрезать блок 300 мкм дальше и собрать больше разделов.
- Установите разделы на стеклянные слайды микроскопа.
- Сухие слайды на RT.
9. Окрашивание
- Погрузите секции в 100% ксилена в течение 3 мин.
- Погрузите в 100% этанол в течение 1 мин.
- Слияние в 96% этанола в течение 1 мин.
- Погрузитесь в 80% этанола в течение 1 мин.
- Погрузите в 70% этанола в течение 1 мин.
- Промыть в воде 3 мин.
- Погрузите в гематоксилин в течение 3 мин.
- Промыть в воде, пока раздел не прояснил.
- Погрузите в насыщенный раствор карбоната лития в течение 10 сек.
- Промыть в воде 3 мин.
- Погрузить в 96% этанола в течение 1 мин.
- Погрузиться в эосин в течение 3 мин.
- Погрузитесь в 96% этанола в течение 1 мин.
- Погрузите в 100% этанол в течение 1 мин.
- Погрузите в 100% ксилена в течение 3 мин.
- Добавьте некоторые на монтировку среды на слайд и защитить его с coverslip.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вы можете дополнить гематоксилин и эозин (H и E) окрашивания с терпящей устойчивостью кислоты фосфатазы (TRAP) окрашивания для оценки остеокласта и остеолиза.
10. Количественная оценка: определение области для анализа
- Изучите разделы с низкой мощностью (т.е. 4x), чтобы определить ориентацию и швы.
- Определите коронарный шов и определите длинную поверхность кости с одной стороны и короткую поверхность с другой.
- Определите коронарный шов под 40-кратным увеличением и переместите два или три оптических поля от шва вдоль длинной поверхности. Захват изображений этой области для анализа.
- Определите старую область кости и новую область кости. Eosin Y с оранжевым G пятна старой кости темнее и новой кости светлее.
- Измерьте общую площадь кости старой и новой кости с помощью программного обеспечения Image J с помощью инструмента цветового порога. Выражение результатов как мкм2.
11. Анализ данных
- Анализ результатов с помощью статистического программного обеспечения. Значительные различия между группами могут быть определены с помощью соответствующих тестов (например, непараметрический тест Манн-Уитни U, как это делается herel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для оценки формирования костей в кальвариальной модели мы культивировали геми-кальварии в средствах массовой информации с 50 мкг/мл инсулина. Ткань разделы были подготовлены и окрашены н И Е. В этих условиях гистология показала, что совсежся структурная целостность кондиционной кости, что позволяет идентифицировать ее различные компоненты(рисунок 1). Calvarias лечение инсулином представил увеличение количества костной ткани по сравнению с контролем(Рисунок 2A). Количественный гистоморфометрический анализ толщины и костной области геми-кальварии подтвердил значительное увеличение обоих параметров в инсулинообработанных тканях по сравнению с контролем(рисунок 2В). Эти данные указывают на осуществимость протокола модели ex vivo для воспроизведения условий формирования костей.
Кроме того, calvarial ex vivo модель может быть использована для воспроизведения рака и костной микросреды условиях. Протокол был использован для оценки влияния раковых клеток молочной железы MDA-MB-231 на муринкалькальные кальварии. Для выполнения этого, кальциевые кости были непосредственно cocultured с раковыми клетками или культивируется только с условными средствами рака клеток. После 7 дней культуры, кальварии были встроены в парафин, и Н И E окрашивания было выполнено. Кокультура с MDA-MB-231 клетки рака молочной железы, как представляется, увеличение остеолиза, как показано на снижение кости и повреждения кальцилбиальной структуры по сравнению с контролем calvarias культивируется только со средствами массовой информации (Рисунок 2A). Количественная оценка костной области кальварии показала значительное снижение общей костной площади кальварии, культивируемой раковыми клетками MDA-MB-231 по сравнению с контролем (Рисунок 2B). Эти результаты показали, что культуры раковых клеток с кальциевой тканью могут воссоздать рак и микроокружение костей и могут быть использованы для исследования механизмов остеолитический метастазирование костной ткани или для оценки возможных ингибиторов этого процесса.
Рисунок 1: Гистологическая структура камышевой кости. Представительная секция тканей геми-кальварии после окрашивания Н и Е. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Инсулин увеличил площадь костей и толщину геми-кальварий ex vivo, в то время как кокультура геми-кальварий с MDA-MB-231 раковых клеток молочной железы индуцированного остеолиза. Для модели формирования костей, геми-кальварии культивировались в присутствии или отсутствии инсулина (50 мкг/мл), в то время как для кокультуры с раковыми клетками, геми-кальварии культивировались в присутствии или отсутствии 5 х 105 MDA-MB-231 клеток в течение 7 дней и гистоморфетритром анализ был выполнен на H и E окрашенных разделах. (A) Представитель ные части ткани. (B) Гистоморфометрический анализ костной области. Результаты представлены в качестве среднего SEM (n No 3). Тест Непараметрического Манн-Уитни U. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описываем протокол для модели calvarial ex vivo для оценки формирования или резорбции костей и изучения взаимодействия раковых клеток с костью калвариальной мыши. Критическими шагами этой методики являются вскрытие, культура, встраивание и гистоморфеметрический анализ кальварий. Во время вскрытия кальварий, очень важно, чтобы сократить геми-кальварии в трапециевидных, так как это будет сильно облегчить ориентацию во время включения парафина. При изучении взаимодействия раковых клеток с кальвариями, важно использовать многоцветные пластины, которые не лечатся для клеточной культуры, чтобы предотвратить раковые клетки от припасов и растет на пластике вместо кости. Во время включения тканей важно тщательно ориентировать каждую геми-кальварию. Они должны быть размещены в вертикальном порядке с sagittal границы на внешней стороне парафиновой блока. Ориентация кости имеет важное значение для получения последовательных гистологических участков и воспроизводимых результатов. Аналогичным образом, очень важно для последовательности во время гистоморфометрического анализа определить конкретный регион в кальварии для измерения костной ремоделирования. Здесь мы определили сначала коронарный шов, а затем длинную поверхность кости, где были сделаны снимки и сделаны измерения.
Для достижения стандартизации и разработки описанных протоколов мы немного изменили некоторые установленные методологии. Во время вскрытия геми-кальварий, PBS был использован для промывки головы мыши вместо культуры средств массовой информации. Чтобы определить количество клеток, необходимых для получения влияния на кальварии, ткань была инкубирована с различнымколичествоми раковых клеток молочной железы. В целом, 5 х 105 раковых клеток хорошо работать в течение 7 дней асссе. Кроме того, во время фиксации, бумажная ткань была использована вместо губок для защиты кальварии. Ткань хорошо сохранилась в бумаге.
Описанная модель имеет некоторые ограничения. Кальварии от неонатальных мышей отсутствие некоторых компонентов костей, которые являются получателем метастазов, будь то структурные (т.е. трабекулярной кости) или клеточных компонентов, таких как иммунные клетки или другие клетки костного мозга, в том числе гематопоэтитических стволовых клеток, что раковые клетки взаимодействуют с. Культура кальварии in vitro не может имитировать полную физиопатологию. Кроме того, когда дело доходит до костных метастазов, клетки рака молочной железы редко метастазируют в кальварию, и, как правило, в пользу костей с более активной ремоделирования костей, таких как позвонки, бедро, или длинные кости рук и ног. Кроме того, кокультура геми-кальварий с раковыми клетками представляет только последние шаги метастатического каскада: колонизацию кости и рост метастазов. Кроме того, количество образцов ограничено количеством щенков на помет. Рекомендуется использовать один мусор за эксперимент и не смешивать пометы, чтобы избежать изменений в результатах. Мы получили аналогичные результаты в кости ремоделирования при использовании calvarias от BALB /c или FVB мышей, но является ли штамм влияет на время ответ кости ремоделирования в этом ассее еще предстоит определить.
Основные преимущества модели calvarial ex vivo по сравнению с моделями in vivo включают более низкую стоимость, простоту асссея и более короткое экспериментальное время для получения реакции на ремоделирование костей. Кокультура раковых клеток и кальварии позволяет изучать клетоко-контактные зависимые взаимодействия, а также влияние выделяемых факторов на ремоделирование костей, в то время как использование условных носителей позволяет сосредоточиться на влиянии растворимых факторов. Кроме того, модель прямого контакта может облегчить характеристику межклеточных взаимодействий и молекулярных механизмов микроорганизмов костной метастазы, а также изучение и оценку новых препаратов для лечения скелетных осложнений злокачественных новообразований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих интересах.
Acknowledgments
Авторы благодарят Марио Номура, доктор медицинских наук и Родольфо Диас а также Пьеррик Фурнье, доктор философии, за его ценные комментарии для улучшения качества работы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well cell culture | Corning | CLS3524 | |
| 24 well non tissue culture | Falcon | 15705-060 | |
| 2 mL cryovial | SSI | 2341-S0S | |
| Antibiotics-Antimycotic | Corning | 30-004-CI | |
| BSA | Biowest | P6154-100GR | |
| Centrifugue | Eppendorf | 22628188 | Centrifuge 5810R |
| Coverslips | Corning | 2935-24X50 | |
| Cytoseal resin | Richard Allen | 8310-10 | |
| DMSO | D2650-100ML | ||
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's PBS (10X) | Corning | 20-031-CV | |
| Ebedding Cassettes | Sigma | Z672122-500EA | |
| EDTA | Golden | 26400 | |
| Embedding Workstation | Thermo Scientific | A81000001 | |
| Eosin | Golden | 60600 | |
| Ethanol absolute | JALMEK | E5325-17P | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | BIO-S1650-500 | |
| Filters | Corning | CLS431229 | |
| Forceps and scissors | LANCETA HG | 74165 | |
| Formalin buffered 10% | Sigma | HT501320 | |
| Glass slides 25 x 75 mm | Premiere | 9105 | |
| Harris's Hematoxylin | Jalmek | SH025-13 | |
| High profile blades | Thermo Scientific | 1001259 | |
| Histoquinet | Thermo Scientific | 813150 | STP 120 |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | 16634 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Scope.A1 | |
| Microtome | Thermo Scientific | 905200 | MICROM HM 355S |
| Mouse food, 18% prot, 2018S | Harlan | T.2018S.15 | |
| Neubauer | VWR | 631-0696 | |
| Orange G | Biobasic | OB0674-25G | |
| Paraffin | Paraplast | 39601006 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Electrothermal | MH8517X1 | |
| Petri dish | Corning | CLS430167 | |
| Phloxin B | Probiotek | 166-02072 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA | Corning | 25-051-CI | |
| Wax dispenser | Electrothermal | MH8523BX1 | |
| Xylene | Golden | 534056-500ML |
References
- Boyce, B. Bone biology and pathology. Handbook of Cancer-Related Bone Disease. Coleman, R. E., Abrahamsson, P. A., Hadji, P. , 3-21 (2012).
- Clark, R. K. Anatomy and Physiology: Understanding the Human Body. 474, Jones & Bartlett Learning. (2005).
- Fournier, P. G. J., Juárez, P., Guise, T. A. Tumor-bone interactions: there is no place like bone. Bone Cancer: Primary Bone Cancers and Bone Metastases. Heymann, D. , 13-28 (2014).
- Ribatti, D., Mangialardi, G., Vacca, A. Stephen Paget and the "seed and soil" theory of metastatic dissemination. Clinical and Experimental Medicine. 6 (4), 145-149 (2006).
- Guise, T. A. The vicious cycle of bone metastases. Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interactions. 2 (6), 570-572 (2002).
- Mundy, G. R.
- Mundy, G. R. Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 584-593 (2002).
- Chong, S. K. M. Experimental models of bone metastasis: Opportunities for the study of cancer dormancy. Advanced Drug Delivery Reviews. 94 (1), 141-150 (2015).
- Deguchi, T., et al. In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts. Scientific Reports. 6 (22585), 1-13 (2016).
- Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research. BoneKEY Reports. 5, 818 (2016).
- Nordstrand, A., et al. Establishment and validation of an in vitro coculture model to study the interactions between bone and prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 26 (8), 945-953 (2009).
- Curtin, P., Youm, H., Salih, E. Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex vivo cocultures of live calvaria bones and cancer cells. Biomaterials. 33 (4), 1065-1078 (2012).
- Garret, R. Assessing bone formation using mouse calvarial organ cultures. Bone Research Protocols. Helfrich, M. H., Ralston, S. H. , Humana press. Totowa, New Jersey. 183-198 (2003).
- Mohammad, K. S., Chirgwin, J. M., Guise, T. A. Assessing new bone formation in neonatal calvarial organ cultures. Methods in Molecular Biology. 455 (1), 37-50 (2008).
