Method Article

Identifizierung von neuartigen CK2 Kinase Substrate mit einem vielseitigen biochemischen Ansatz

DOI:

10.3791/59037

⸱

February 21st, 2019

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Drexel University College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Ziel dieses Protokolls ist zu beschriften, zu bereichern und Substrate der Proteinkinase CK2 aus einer komplexen biologischen Probe z. B. eine Zelle lysate oder Gewebe Homogenat zu identifizieren. Diese Methode nutzt die einzigartigen Aspekte der CK2 Biologie für diesen Zweck.

Abstract

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Das Studium der Kinase-Substrat Beziehungen unbedingt ein vollständiges Verständnis der Funktionen von dieser Enzyme und ihre nachgelagerten Ziele in physiologische und pathologische Zustände zu gewinnen. CK2 ist ein evolutionär konservierte Serin/Threonin-Kinase mit einer wachsenden Liste von Hunderten von Substraten in mehreren zellulären Prozessen beteiligt. Aufgrund seiner pleiotropen Eigenschaften ist zu identifizieren und zu charakterisieren ein umfassendes Set an CK2 Substrate besonders anspruchsvoll und bleibt eine Hürde in der Studie dieses wichtigen Enzyms. Um dieser Herausforderung zu begegnen, haben wir eine vielseitige experimentelle Strategie entwickelt, die es die gezielte Anreicherung und Identifizierung von vermeintlichen CK2 Substrate ermöglicht. Dieses Protokoll nutzt die einzigartige dual Co Substratspezifität der CK2 zulassend bestimmte Thiophosphorylation der Substrate in einer Zelle oder eines Gewebes lysate. Diese Substrat Proteine werden im Anschluss alkyliert, Immunoprecipitated, und durch flüssige Chromatographie/Tandem Massenspektrometrie (LC-MS/MS) identifiziert. Wir haben früher dieser Ansatz erfolgreich CK2 Substrate von Drosophila Eierstöcken identifizieren und hier verlängern wir die Anwendung dieses Protokolls zu menschlichen Glioblastom-Zellen, illustrieren die Anpassungsfähigkeit dieser Methode zu untersuchen, die biologische Rollen dieser Kinase in verschiedenen Modellorganismen und experimentellen Systemen.

Introduction

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Proteinkinasen sind Schlüsselkomponenten der Transduktion Signalkaskaden. Phosphorylierung von Proteinen Substrat durch diese Enzyme entlockt biologische Reaktionen, die kritische Ereignisse, die Kontrolle der Zellteilung, Stoffwechsel und Differenzierung, unter anderem zu regulieren. CK2 ist ein ubiquitär ausgedrückt, acidophilen Serin/Threonin-Kinase, die ist von Hefe für den Menschen erhalten und spielt eine wichtige Rolle in vielen zellulären Prozessen von transcriptional Regelung bis hin zu Zellzyklus Progression zu Apoptose1 ,2,3. Das Enzym ist ein Heterotetramer bestehend aus zwei katalytischen α (oder α') Untereinheiten und zwei regulatorischen β Untereinheiten4. Abgesehen davon, dass hoch pleiotrope, Exponate CK2 zwei andere ungewöhnlichen Eigenschaften, die ihre Analyse erschweren nämlich konstitutive Aktivität5 und dual Co Substrat Spezifität6. Diese letztere Eigenschaft verleiht CK2 mit der Fähigkeit, GTP sowie ATP für die Phosphorylierung von Proteinen Substrat verwenden.

Genetische Löschung der katalytischen oder regulatorischen Untereinheiten der CK2 bei Mäusen führt zu embryonalen Tödlichkeit darauf hinweist, dass es entscheidende Rolle bei der Entwicklung und Organogenese7,8 spielt. CK2 ist auch in verschiedenen Arten von Krebs überexprimiert und stellt damit eine vielversprechende therapeutische Ziel9,10,11. In der Tat spezifische Inhibitoren dieses Ziel CK2-Kinase-Aktivität werden derzeit untersucht für diesen Zweck12,13,14. Während Hemmung der CK2 ist ein gangbarer Weg, angesichts seiner pleiotrope Natur, eine Alternative und rationaler Ansatz vielleicht wäre auf kritische CK2 Substrate, die das Fortschreiten bestimmter Krebsarten zugrunde liegen. Daher wäre die umfassende Identifizierung und Charakterisierung von CK2 Substrat Proteine von erheblichem Nutzen für die Aufklärung die spezifische Funktion(en) von dieser Kinase innerhalb eines bestimmten Gewebes oder Tumor-Typs.

Hier beschreiben wir eine vielseitige biochemische Methode zur Identifizierung CK2 Substrate aus einer komplexen biologischen Probe wie einer Zelle oder eines Gewebes lysate. Dieses Protokoll nutzt die dual Co Substratspezifität der CK2 durch Verwendung der GTP-Analogons GTPγS (Guanosin-5'-[γ-thio]triphosphate), die anderen endogenen Kinasen verwenden können. Dadurch können effektiv die Kinase, "seine Substrate innerhalb dieses Beispiel für nachträgliche Isolierung und Identifizierung zu kennzeichnen".

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Protocol

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Hinweis: Sicherstellen, dass die benötigten Materialien zur Verfügung und richtig vorbereitet sind (siehe Tabelle der Materialien).

1. Vorbereitung

  1. Mechanisch lösen Gewebeprobe (1-2 mg Gewebe in 100 µL der Lyse Puffer, Tabelle 1) oder kultivierten Zellen (10 cm-Platte, die 80-90 % Zusammenfluss in 350 µL Lyse Puffer ist), mit dem Ziel, insgesamt 900 µL Probe für das Experiment zu sammeln. Beachten Sie, dass dieses Volumen in leichten Überschuss ist an was für die nachfolgend beschriebenen Experiment benötigt wird.
  2. Spin-down der Proben durch Zentrifugation bei 17.500 X g für 3 Minuten bei 4 ° C. Übertragen Sie nach der Fertigstellung 270 µL des Überstands auf jedes der drei neuen 1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Es werden ca. 90 µL bleiben. Entfernen Sie 40 µL als "Eingangskontrolle" und Platz in einen neuen Schlauch verwendet werden. Legen Sie alle Proben auf Eis.

(2) Kinase Assay: Thiophosphorylation und Alkylierung

  1. Die drei Röhrchen mit 270 µL wie folgt zu kennzeichnen: "Kinase Rxn", "GTPγS", und "PNBM (p-Nitrobezyl-Mesylat) nur". Bereiten Sie die Kinase-Reaktionen.
    1. Fügen Sie mit dem "Kinase Rxn" Rohr 2,7 µL (gleichbedeutend mit 1.350 U) CK2, dann 2,7 µL 2,5 mM GTPγS.
    2. Fügen Sie mit dem "Nur GTPγS" Rohr 2,7 µL 2,5 mM GTPγS hinzu, und fügen Sie 2,7 µL Lyse Puffer.
    3. Das "PNBM nur" Rohr fügen Sie 5.4 µL Lyse Puffer hinzu. Streichen Sie alle Röhren zu mischen und dann sofort auf Eis legen.
  2. Inkubieren Sie alle drei Röhren für 1 min in einem 30 ° C-Wasserbad. Fügen Sie nach Inkubation 13,5 µL von 12 mg/mL PNBM alle drei Röhren hinzu. Invertieren, Proben zu mischen. Inkubieren Sie diese Proben bei Raumtemperatur 1 h.
  3. Nach dem Start der Inkubation in Schritt 2.2, bereiten Sie die Entsalzung Spalten so bald wie möglich, wie der Prozess dauert etwa 45 Minuten.

3. Vorbereitung der Entsalzung Spalten

  1. Zunächst bereiten Sie Spalten (3 für dieses Beispiel-Experiment) durch invertieren jeder Spalte mehrmals erneut aussetzen der Sephadex G-25 Harz in den Puffer speichern. Das Harz zu begleichen, indem eine Klammer Stand jede Spalte zuweisen und lassen es ca. 5 min. lang ungestört sitzen zu ermöglichen.
  2. Nach Absetzen der Sephadex G-25 Harz, entfernen Sie die Kappen von oben und unten in der Spalte erlauben den Puffer speichern zu entleeren durch die Schwerkraft und haben eine Röhre unterhalb der unteren Öffnung der durchströmten verwerfen zu sammeln.
  3. Sobald Speicher Puffer aufgebraucht ist, fügen Sie hinzu, ca. 2,7 mL Lyse-Puffer um die Spalten equilibrate. Die Flow-through zu sammeln und entsorgen. Wiederholen Sie 3 Mal. Im Anschluss an die letzte Gleichgewichtherstellung sind die Spalten bereit für Schritt 4.1.

4. Entfernung von PNBM

  1. Nach 1 h Inkubation (Schritt 2.2) und Spalte Vorbereitung (Schritt 3) abgeschlossen sind, gelten Sie die Proben für die Spalten. Jede Spalte wie folgt zu kennzeichnen: "Kinase Rxn", "Nur GTPγS" und "Nur PNBM". Laden Sie alle jede Probe auf der jeweiligen Spalte. Sammeln Sie und entsorgen Sie den Durchfluss.
  2. Waschen Sie Proben, indem Sie jede Spalte 420 µL Lyse Puffer hinzufügen. Lyse Puffer durch die Spalte filtern und sammeln der durchströmten verwerfen zu ermöglichen. Im Anschluss an diese Waschschritt positionieren Sie Rohre für die Entnahme von Proben.
  3. Eluieren Sie Proben durch Zugabe von 500 µL Puffer Lyse zu jeder Spalte. Sammeln Sie die Durchströmung, die jetzt Thiophosphorylated und alkyliert CK2 Substrate enthält.

5. Immunopräzipitation: Teil I

  1. Bereiten Sie Proben für Immunopräzipitation, indem erste entfernen 80 µL für eine "Elution Eingabekontrolle" Probe von jedem der jeweiligen Elutions ("Kinase Rxn", "Nur GTPγS" und "Nur PNBM") in Schritt 4.3 gesammelt. Nach Entfernen der 80 µL von jeder Probe werden ca. 420 µL pro Probe bleiben.
    1. Jede Probe in 2 Röhrchen mit 200 µL aufgeteilt. Beschriften Sie jedes jeweiligen Rohr: "Kinase Rxn Anti-Thiophosphate Ester", "Kinase Rxn IgG", "GTPγS Anti-Thiophosphate Ester", "GTPγS IgG", "PNBM Anti-Thiophosphate Ester" und "PNBM IgG".
  2. 2.8 µg Anti-Thiophosphate Ester Antikörper gegen jedes Anti-Thiophosphate Ester beschriftet Rohre und 2,8 µg Isotype Kontrolle Antikörper zu jedem der IgG-Label Rohre hinzufügen. Ein Rotator bei 4 ° C für 2 h Rohre aufsetzen.
  3. Beginnen Sie Vorbereitung von Protein A/G Perle während den letzten 15 Minuten der 2 h Inkubation im Schritt 5.2.

(6) Protein A/G Agarose Bead Vorbereitung

  1. Kurz Wirbel der Lagerung Röhre um Perlen zu gewährleisten sind vollständig wieder ausgesetzt. Schneiden Sie das Ende einer P200 Pipettenspitze mit einer sauberen Rasierklinge Erhöhung messen Größe. Pipettieren 100 µL der Wulst Gülle pro Immunopräzipitation zu einem neuen 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch. In diesem Beispiel werden insgesamt 6 Rohre benötigt.
  2. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 17.500 X g für 1 min bei 4 ° C. Den Überstand entfernen und entsorgen. Wieder aussetzen Sie, die Perlen in 200 µL kurz Lyse Puffer und Wirbel. Wiederholen Sie den Spin und waschen Sie Schritte zu 3-Mal.
  3. Legen Sie nach dem letzten Waschen die Perlen auf Eis, bis die Inkubation im Schritt 5.2 abgeschlossen ist.

(7) Immunopräzipitation: Teil II

  1. Nach den 2 h Inkubation von Schritt 5.2 spin-down der Proben bei 17.500 X g für 3 min bei 4 ° C. Fügen Sie nach Zentrifugation 200 µL von jeder Probe auf die Rohre mit den gewaschenen Perlen hinzu. Legen Sie die Röhren auf ein Rotator bei 4 ° C für 1 h.
  2. Im Anschluss an die 1 h Inkubation Zentrifugieren der Rohre bei 17.500 X g für 1 min bei 4 ° C. Als nächstes 40 µL des Überstands von jeder Probe zu entfernen und speichern Sie als eine "Erschöpfung Control" (insgesamt 6 Röhren). Entfernen Sie den Rest des Überstandes und entsorgen. Achten Sie darauf, nicht um die Perlen zu stören.
  3. Waschen Sie die Proben durch Zugabe von 200 µL Puffer lyse und vortexen kurz. Zentrifugieren Sie bei 17.500 X g für 1 min bei 4 ° C. Den Überstand entfernen und entsorgen. Wiederholen Sie das Waschen und Schleudern Sie Schritte 3 Mal. Achten Sie darauf, nicht um die Perlen während dieser Schritte zu stören.
  4. Fügen Sie nach Abschluss der Wäsche Schritte 50 µL 2 X Probenpuffer jede Probe mit Perlen hinzu. Für alle anderen Proben hinzufügen 8 µL 6 x Probenpuffer: "Eingangskontrolle", "Elution Eingabesteuerelemente" und "Erschöpfung Steuerelemente".
  5. Sobald der Puffer an den Rohren, Pipettieren rauf und runter zu mischen und erhitzen Sie alle Proben bei 95 ° C für 5 min bevor mit SDS-PAGE hinzugefügt wird.

8. Analyse/Bewertung der Ergebnisse

  1. Überprüfen Sie erfolgreiche CK2-abhängige Thiophosphorylation und Alkylierung.
    1. Um die Wirksamkeit von CK2-vermittelten Thiophosphorylation im Schritt 2.2 zu ermitteln, führen Sie SDS-PAGE und Western blotting durch Ausführen von 15-20 µL der "Elution Eingabesteuerelemente" gesammelt im Schritt 5.1 auf einem 12,5 % Polyacrylamid-Gel.
    2. Sonde Membranen mit den folgenden Antikörper: Anti-Thiophosphate Ester, Anti-CK2α und Anti-GAPDH (oder einem anderen geeigneten laden Steuerelement). Wenn dieser Schritt erfolgreich war, sollte eine verbesserte Anti-Thiophosphate-Ester-Signal in der "Kinase Rxn" Spur im Vergleich zu den anderen zwei Fahrspuren (Abbildung 2) ersichtlich sein.
  2. Angereicherte vermeintliche Substrate der CK2 visualisieren und Protein Identität zu bestimmen.
    1. Führen Sie aus, um festzustellen, ob die Immunopräzipitation Schritte erfolgreich waren, 25-30 µL der Proben aus den Perlen im Schritt 7.4 auf einem separaten 12,5 % Polyacrylamid-Gel eluiert. Stellen Sie sicher, dass alle Geräte sauber und Handschuhe tragen zu jeder Zeit während dieses Schrittes um Kontamination zu minimieren.
    2. Färben Sie das Gel mit Coomassie Blau angereichertes Proteine aus verschiedenen Phasen des experimentellen Protokolls (Abbildung 3) zu visualisieren. Mit neuen Rasierklingen, präsentieren sorgfältig Verbrauchsteuern einzigartige Bands auf der "Kinase Rxn Anti-Thiophosphate Ester IP" Spur und in Anbetracht ihrer ungefähren Molekulargewichten.
    3. Senden Sie diese Bands für Proteinidentifizierung durch flüssige Chromatographie/Tandem Massenspektrometrie (LC-MS/MS) (Abbildung 4). Wenn Antikörper gegen die identifizierte Proteine zur Verfügung stehen, bestätigen die Ergebnisse der Massenspektrometrie von SDS-PAGE und Immunoblotting von input, erschöpft und IP-Fraktionen gesammelt im Verlauf des Protokolls (Abbildung 4).

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Results

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Eine schematische Darstellung der Versuchsanordnung ist in Abbildung 1zur Verfügung gestellt. Die zugrunde liegende Basis der Technik ist die ungewöhnliche Fähigkeit der CK2, GTP für Phosphoryl-Gruppe Übertragung verwenden. Zugabe von exogenen CK2 Holoenzym sowie das GTP-Analogon, GTPγS, zu einer Zelle lysate führt zu Thiophosphorylation von endogenen CK2 Substraten. Nachbehandlung der lysate mit alkylierende Reagenz p- Nitrobenzyl-Mesylat (PNBM) erz...

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Discussion

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Hier beschreiben wir eine relativ einfache biochemische Methode zur Identifizierung Substrate der Proteinkinase CK2 aus einer komplexen biologischen Probe. Die entscheidenden Schritte dieses Protokolls basieren auf die ungewöhnlichen enzymatischen Eigenschaften von CK2 und beinhalten CK2-abhängige Thiophosphorylation von bestimmten Substrat Proteinen mit GTPγS und deren anschließende Immunopräzipitation und Identifikation. Mit diesen Ergebnissen haben wir den nutzen und die Vielseitigkeit dieses Ansatzes gezeigt...

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

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Diese Arbeit wurde zum Teil durch einen Zuschuss der Commonwealth Universal Forschung Verbesserung von Pennsylvania Department of Health, T.I.S unterstützt

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12 mg/mL PNBMAbcamab13891040,5 & Mikro; L
2,5 mM GTP & Gamma SSigma-AldrichG8634-1MG5.4 & Mikro; L
Anti-CK2α (E-7) monoklonaler Maus-AntikörperSanta Cruz Biotechnologysc-3738941:1000 für Western Blot
Anti-GAPDH (6C5) monoklonaler Maus-AntikörperSanta Cruz Biotechnologysc-322331:1000 für Western Blot
Anti-Nukleolin polyklonaler Kaninchen-AntikörperAbcamab227581:1000 für Western Blot
Anti-Thiophosphatester [51-8] monoklonaler Kaninchen-AntikörperAbcamab92570Variiert (Endkonzentration 2,8 &Mikro; g für jede Probe)
Zentrifuge voreingestellt auf 4º CThermoScientificSorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 
cOmplete Mini EDTA-freier ProteasehemmerRoche11836170001
LysepufferSiehe Rezept untenSiehe Rezept unten 30mL
Normaler Kaninchen-IgG-Antikörper (Isotypkontrolle)Cell Signaling Technology2729S Variiert (Endkonzentration 2,8 &Mikro; g für jede Probe)
PD MiniTrap SäuleGE Healthcare28-9180-103 Säulen
Protein A/G Plus AgaroseBeads Santa Cruz Biotechnologysc-2003600 µ L
Rekombinantes humanes CK2-HoloenzymNew England BiolabsP6010S2.7 µ L
RotatorLabnet: Mini LabrollerMini Labroller SKU# H5500
T98G humane GlioblastomzellenATCCCRL-1690
Wasserbad voreingestellt auf 30º CShel LabH20 Badserie Modell# SWB15

References

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