Summary
O objetivo do presente protocolo é rotular, enriquecer e identificar substratos de proteína quinase CK2 de uma amostra biológica complexa como um lisado celular ou homogeneizado de tecido. Este método utiliza aspectos únicos da biologia CK2 para essa finalidade.
Abstract
O estudo das relações de quinase-substrato é essencial para uma compreensão completa das funções de enzimas e suas metas a jusante em Estados fisiológicos e patológicos. CK2 é uma quinase serina/treonina evolutivamente conservada com uma lista crescente de centenas de substratos envolvidos em vários processos celulares. Devido a suas propriedades pleiotrópicos, identificando e caracterizando um conjunto abrangente de substratos CK2 tem sido particularmente desafiador e continua a ser um obstáculo no estudo desta importante enzima. Para responder a este desafio, criámos uma estratégia experimental versátil que permite o enriquecimento de alvo e identificação de substratos de CK2 putativos. Este protocolo aproveita a único dual co especificidade de CK2 permitindo lisado thiophosphorylation específica de seus substratos em uma célula ou tecido. Estas proteínas de substrato são posteriormente alquilados, immunoprecipitated e identificados por espectrometria de massa de tandem/cromatografia líquida (LC-MS/MS). Temos anteriormente usado essa abordagem para identificar com sucesso CK2 substratos de Drosophila ovários e aqui nós estendemos a aplicação do presente protocolo para células de glioblastoma humano, ilustrando a capacidade de adaptação desse método para investigar a papéis biológicos deste quinase em vários organismos modelo e sistemas experimentais.
Introduction
Quinase de proteína é componentes-chave de cascatas de transdução de sinal. Fosforilação de proteínas de substrato por estas enzimas elicia respostas biológicas que regulam eventos críticos, controlando a divisão celular, metabolismo e diferenciação, entre outros. CK2 é uma quinase serina/treonina ubiquitously expressa, acidófilo que é conservada do fermento aos seres humanos e que tem um papel importante em muitos processos celulares, variando de regulamento transcriptional a progressão do ciclo celular a apoptose1 ,2,3. A enzima é uma heterotetramer composta por dois α catalítico (ou α') subunidades e dois de subunidades reguladoras β4. Além de ser altamente pleiotrópicos, CK2 exibe dois outras incomuns características que complicam a sua análise, ou seja, atividade constitutiva5 e especificidade de substrato co dupla6. Esta última Propriedade dota CK2 com a capacidade de usar o GTP, bem como ATP por fosforilação de proteínas de substrato.
Exclusão genética das subunidades catalíticas ou regulamentares da CK2 em camundongos resulta em embrionária letalidade indicando que ele tem um papel crucial durante o desenvolvimento e organogênese7,8. CK2 também é overexpressed em vários tipos de câncer e, portanto, representa um promissor alvo terapêutico9,10,11. Com efeito, inibidores específicos dessa atividade de quinase CK2 alvo estão atualmente sob investigação por este propósito12,13,14. Enquanto a inibição da CK2 é uma opção viável, dada a sua natureza pleiotrópicos, alternativa e talvez a abordagem mais racional seria alvo de substratos CK2 críticos que sustentam a progressão de certos tipos de câncer. Portanto, o abrangente identificação e caracterização das proteínas de substrato CK2 seria um benefício significativo para elucidar as funções específicas deste quinase dentro de um determinado tipo de tecido ou tumor.
Aqui, descrevemos um método bioquímico versátil para identificar substratos CK2 de uma amostra biológica complexa como uma célula ou tecido lisado. Este protocolo aproveita a especificidade de substrato co dual de CK2 pelo uso do análogo de GTP GTPγS (guanosina 5'-[γ-thio]triphosphate) que não podem usar outras cinases endógenas. Efetivamente, isso permite que a quinase de "rotular" seus substratos dentro desta amostra para posterior isolamento e identificação.
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Protocol
Nota: Certifique-se que os materiais necessários estão disponíveis e devidamente preparados (ver Tabela de materiais).
1. preparação
- Lyse mecanicamente a amostra de tecido (1-2 mg de tecido em 100 µ l de tampão de Lise, tabela 1) ou cultura de células (placa de 10 cm que é confluente de 80-90% em 350 µ l de tampão de Lise), com o objetivo de coletar um total de 900 µ l de amostra para o experimento. Note que este volume é em ligeiro excesso do que é necessário para o experimento descrito abaixo.
- Gire para baixo as amostras por centrifugação a 17.500 x g durante 3 minutos a 4 ° C. Após a conclusão, transferi 270 µ l do sobrenadante para cada um dos três novos tubos de microcentrifuga 1,7 mL. Haverá aproximadamente 90 µ l restantes. Remova 40 µ l para ser usado como um "controle de entrada" e coloque em um tubo de novo. Coloque todas as amostras no gelo.
2. quinase: thiophosphorylation e alquilação
- Rotular os três tubos contendo 270 µ l da seguinte forma: "quinase rxn", "Só GTPγS", e "PNBM (p-nitrobezyl mesilato) só". Prepare as reações da quinase.
- Para o tubo "quinase rxn", adicione 2,7 µ l (equivalente a 1.350 U) de CK2 e, em seguida, adicione 2,7 µ l de 2,5 mM GTPγS.
- Para o tubo "Só GTPγS", adicione 2,7 µ l de 2,5 mM GTPγS e adicione 2,7 µ l de tampão de Lise.
- Para o tubo "Só PNBM", adicione 5,4 µ l de tampão de Lise. Filme de todos os tubos para misturar e coloque imediatamente no gelo.
- Incube a todos os três tubos por 1 min em um banho de água de 30 ° C. Após incubação, adicione 13,5 µ l de 12 mg/mL PNBM para todos os três tubos. Invertido para misturar as amostras. Incube as amostras à temperatura ambiente durante 1 h.
- Depois de iniciar a incubação no passo 2.2, prepare as colunas do desalting tão logo possíveis, pois o processo leva aproximadamente 45 min.
3. preparação de dessalinização colunas
- Inicialmente prepare colunas (3 para este experimento de exemplo), invertendo-se cada coluna várias vezes para re-suspender o Sephadex G-25 resina no buffer de armazenamento. Permitir que a resina de anexar cada coluna a um carrinho de grampo e deixá-lo sentar-se sem ser perturbado por aproximadamente 5 min.
- Após a liquidação da resina Sephadex G-25, remova as tampas de parte superior e inferior da coluna para permitir que o buffer de armazenamento de drenagem por gravidade e ter um tubo colocado sob a abertura do fundo para coletar o escoamento para descarte.
- Quandoo buffer de armazenamento, adicione aproximadamente 2,7 mL de tampão de Lise, a fim de equilibrar as colunas. Coletar o escoamento e descarte. Repeti 3 vezes. Após o equilíbrio final, as colunas estão prontas para etapa 4.1.
4. remoção de PNBM
- Após a incubação de 1 h (passo 2.2) e preparação de coluna (etapa 3) estão completas, aplicam-se as amostras para as colunas. Etiquete cada coluna como segue: "quinase rxn", "Só GTPγS" e "Só PNBM". Carrega todos de cada amostra para sua respectiva coluna. Recolher e descartar o escoamento.
- Lave as amostras adicionando 420 µ l de tampão de Lise para cada coluna. Permitir que o tampão de Lise filtrar a coluna e coletar o escoamento para descarte. Após esta etapa de lavagem, coloque os tubos na posição para coleta de amostras.
- Eluir amostras adicionando 500 µ l de tampão de Lise para cada coluna. Colete o escoamento que agora contém thiophosphorylated e substratos de CK2 alquilados.
5. imunoprecipitação: Parte I
- Prepare amostras para a imunoprecipitação por µ l 80 removendo primeiro para uma amostra de "controle de entrada de eluição" de cada um dos respectivos elutions ("quinase rxn", "Só GTPγS" e "Só PNBM"), coletados na etapa 4.3. Após a remoção de 80 µ l de cada amostra, haverá cerca de 420 µ l, permanecendo por amostra.
- Dividi cada amostra em 2 tubos contendo 200 µ l. Etiquete cada respectivo tubo: "quinase rxn antitiofosfato ester", "quinase rxn IgG", "Éster de antitiofosfato GTPγS", "GTPγS IgG", "Éster de antitiofosfato PNBM" e "PNBM IgG".
- Adicione 2,8 µ g de anticorpo antitiofosfato éster cada um dos tubos antitiofosfato éster-etiquetadas e 2,8 µ g do isotipo anticorpo de controle para cada um dos tubos de IgG-rotulados. Coloque os tubos em rotacao a 4 ° C por 2 h.
- Começa a preparação do grânulo de A/G de proteína durante o último 15 min de incubação na etapa 5.2 h 2.
6. preparação de grânulo de agarose A/G de proteína
- Brevemente o vórtice o tubo de armazenamento para assegurar grânulos são completamente re-suspenso. Cortar a extremidade de um P200 ponta da pipeta usando uma lâmina de barbear limpa para aumentar o medidor de tamanho. Pipetar 100 µ l do chorume grânulo por imunoprecipitação em um novo tubo de microcentrifuga 1,7 mL. Para este exemplo, são necessários um total de 6 tubos.
- Centrifugar os tubos a 17.500 x g por 1 min a 4 ° C. Retire o sobrenadante e descarte. Re-suspenda as contas em 200 µ l de tampão de Lise e brevemente vórtice. Repetir a centrifugação e lavar passos 3 vezes.
- Após a lavagem final, coloque as contas no gelo até a incubação na etapa 5.2 está completa.
7. imunoprecipitação: Parte II
- Após a incubação de 2h de passo 5.2, spin para baixo as amostras a 17.500 x g durante 3 min a 4 ° C. Após centrifugação adicione 200 µ l de cada amostra para os tubos com os grânulos lavados. Coloque os tubos em rotacao a 4 ° C, durante 1 h.
- Após a incubação de 1 h, centrifugar os tubos a 17.500 x g por 1 min a 4 ° C. Em seguida remover 40 µ l do sobrenadante de cada amostra e salve como um controle de"esgotamento" (total de 6 tubos). Remova o restante do líquido sobrenadante e descarte. Tome cuidado para não perturbar os grânulos.
- Lave as amostras adicionando-se 200 µ l de tampão de Lise e num Vortex brevemente. Centrifugar a 17.500 x g por 1 min a 4 ° C. Retire o sobrenadante e descarte. Repita a lavagem e girar passos 3 vezes. Tome cuidado para não perturbar os grânulos durante essas etapas.
- Depois de concluir as etapas de lavagem, adicione 50 µ l de tampão de amostra x 2 para cada amostra contendo grânulos. Para todas as outras amostras, adicionar 8 µ l de 6 x amortecedor da amostra: "controle de entrada", "controles de entrada de eluição" e "controles de esgotamento".
- Uma vez que a reserva é adicionada aos tubos, pipetar acima e para baixo para misturar e aquecer todas as amostras a 95 ° C por 5 min antes de prosseguir com o SDS-PAGE.
8. análise/validação dos resultados
- Valide a alquilação e bem sucedida CK2 dependente thiophosphorylation.
- Para determinar a eficácia da thiophosphorylation mediada por CK2 no passo 2.2, execute SDS-PAGE e mancha ocidental por 15-20 µ l de "eluição controles de entrada" coletados na etapa 5.1 em um gel de poliacrilamida de 12,5% em execução.
- Sonda de membranas com os seguintes anticorpos: antitiofosfato éster, anti-CK2α e anti-GAPDH (ou outro controle de carregamento apropriado). Se essa etapa foi bem sucedida, um sinal de éster de antitiofosfato reforçada deve ser aparente na faixa "quinase rxn" em comparação com as outras duas pistas (Figura 2).
- Visualizar enriquecidos substratos putativos de CK2 e determinar a identidade da proteína.
- Para avaliar se as etapas de imunoprecipitação foram bem sucedidas, execute 25-30 µ l das amostras eluída dos grânulos na etapa 7.4 em um gel de poliacrilamida de 12,5% separados. Garantir que todo o equipamento está limpo e usar luvas o tempo todo durante essa etapa para minimizar a contaminação.
- Manche o gel com Coomassie blue para visualizar proteínas enriquecidas de vários estágios do protocolo experimental (Figura 3). Usando lâminas novas, cuidadosamente faixas originais de impostos especiais de consumo apresentam na faixa "quinase rxn antitiofosfato éster IP", observando seus pesos moleculares aproximados.
- Submeta essas bandas para identificação de proteínas por espectrometria de massa de tandem/cromatografia líquida (LC-MS/MS) (Figura 4). Se os anticorpos contra as proteínas identificadas estão disponíveis, confirmar os resultados da espectrometria de massa por SDS-PAGE e immunoblotting de entrada, esgotado, e frações IP coletados durante o curso do protocolo (Figura 4).
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Representative Results
Um diagrama esquemático do procedimento experimental é fornecido na Figura 1. A base subjacente da técnica é a capacidade incomum de CK2 usar GTP para transferência de grupo de fosforilo. Adição de exógenos CK2 holoenzima, juntamente com o análogo de GTP, GTPγS, para um lisado celular resulta em thiophosphorylation de substratos endógenos de CK2. Tratamento subsequente do lisado com o alquilantes reagente p- nitrobenzil mesilato (PNBM) gera um moiety do éster tiofosfato sobre essas proteínas substrato específico que pode então ser immunoprecipitated usando um anticorpo de éster de antitiofosfato e, finalmente, identificados por espectrometria de massa. A Figura 2 mostra um resultado positivo, após a adição de CK2 e GTPγS e, em seguida, PNBM para T98G lisado celular total (glioblastoma). Estes resultados demonstram que CK2 dependente thiophosphorylation e alquilação subsequente foram bem sucedidos. Como esperado, um sinal de éster de antitiofosfato reforçada pela mancha ocidental é observado apenas na faixa que contém a reação completa da quinase e não no GTPγS única - e amostras tratadas somente de PNBM. Mostrado na Figura 3 é um gel manchado de azul de Coomassie do immunoprecipitated e proteínas eluted usando controle do isotipo IgG ou anticorpos de éster de antitiofosfato na presença ou ausência de excesso CK2 e/ou GTPγS. Estes dados demonstram também um resultado positivo como múltiplas faixas originais são evidentes somente na faixa IP antitiofosfato éster na qual o lisado foi incubado com exógena CK2 e GTPγS. A banda indicada com um asterisco foi extirpada do gel e enviada para identificação de proteínas por espectrometria de massa. A Figura 4 ilustra dados representativos obtidos pela análise espectrometria de massa, incluindo a identificação de proteínas, cobertura percentual e número de peptídeos exclusivos identificado por proteína dentro da banda. São mostrados os hits top 10 da banda apresentada (Figura 3) e informações relacionadas ou não a proteína foi anteriormente identificada como um substrato de CK215,16,17. A identidade de um dos substratos immunoprecipitated conhecido CK2, nucleolin15, foi confirmada por SDS-PAGE e immunoblotting das frações indicadas usando um anticorpo anti-nucleolin.
Figura 1: diagrama esquemático da estratégia experimental. O análogo de GTP, GTPγS, juntamente com excesso recombinante CK2 holoenzima é adicionado a uma célula ou tecido lisado e permite thiophosphorylation de substratos por CK2, mas não por outras cinases endógenas. Thiophosphorylated substratos são em seguida alquilados com PNBM, gerando um moiety do éster tiofosfato sobre essas proteínas, que são então capturados através da imunoprecipitação (IP) para posterior identificação por espectrometria de massa em tandem-cromatografia líquida ( LC-MS/MS). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: validação de thiophosphorylation CK2 dependente no lisado celular. Lisado celular total preparado a partir de células T98G foram incubado com o GTPγS na presença (reação de quinase) ou ausência (GTPγS somente) de recombinante exógena CK2 holoenzima. PNBM posteriormente foi adicionado às reações indicadas, e amostras foram resolvidas por SDS-PAGE seguido immunoblotting com anticorpos indicados. Marcadores de peso molecular da proteína são indicados em kDa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: imunoprecipitação de proteínas de substrato putativos CK2. Enriquecimento e visualização dos putativos CK2 substratos (terceira pista) manifesta-se como múltiplas faixas originais seguindo imunoprecipitação com os anticorpos antitiofosfato éster. Immunoprecipitates foram resolvidos por SDS-PAGE e o gel estava manchado com azul de Coomassie. A banda marcada com um asterisco foi extirpada do gel e enviada para identificação de proteínas por espectrometria de massa. Marcadores de peso molecular da proteína são indicados em kDa. IP = imunoprecipitação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Identificação e confirmação de proteínas como substratos de CK2 em vitro. Dados obtidos por espectrometria de massa demonstram que anteriormente conhecido15,16,17 , bem como romance putativo CK2 substratos foram identificados usando esta abordagem experimental. O top dez proteínas identificadas da banda extirpada (topo) são mostrados. A identidade de nucleolin, um substrato de CK2 conhecido, foi confirmada pelo immunoblotting das frações indicadas usando um anticorpo anti-nucleolin (parte inferior). Marcadores de peso molecular da proteína são indicados em kDa. IP = imunoprecipitação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Reagente de concentração das ações | Concentração Final de reagente | Exemplo de volumes adicionados com base em concentrações estoque |
| 1 M Tris pH 7,4 | 20.0 mM | 200 Μ l |
| 4 M NaCl | 20.0 mM | 50 Μ l |
| 20% Triton X-100 | 0,50% | 250 Μ l |
| 1 M MgCl2 | 10,0 mM | 100 Μ l |
| 1 M DTT | 0.5 mM | 5 Μ l |
| 200 mM at3VO4 | 1.0 mM | 50 Μ l |
| 500mm NaF | 10,0 mM | 200 Μ l |
| β-glicerol fosfato de 500 mM | 10,0 mM | 200 Μ l |
| H2O | 8,945 mL | |
| + 1 completa Mini guia/10 mL | 1 comprimido |
Tabela 1. Receita de tampão de Lise (10 mL, 1 X).
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Discussion
Aqui, descrevemos um método relativamente simples e bioquímico para identificar substratos de proteína quinase CK2 de uma amostra biológica complexa. Os passos críticos do presente protocolo são baseados nas propriedades enzimáticas incomuns de CK2 e incluem thiophosphorylation CK2 dependente das proteínas de substrato específico usando GTPγS e sua subsequente imunoprecipitação e identificação. Com estes resultados, nós Demonstramos a utilidade e versatilidade desta abordagem como temos agora aplicado esta estratégia em células de glioblastoma humano e Drosophila ovários18.
Um número de estudos publicados anteriormente usando abordagens quantitativas phosphoproteomics na verdade têm sido bem sucedido na identificação de romance CK2 substratos19,20,21,22, 23. no entanto, algumas destas estratégias fazem uso de matrizes de substrato imobilizado, e é possível que a conformação de uma proteína imobilizada pode tornar um local potencial de fosforilação inacessíveis para a quinase. A técnica descrita aqui permite fosforilação dentro de um ambiente mais fisiológica ou nativa (ou seja, um lisado celular), desse modo reduzindo a probabilidade de inacessibilidade do local. Outro benefício desta estratégia é que, uma vez que a identificação da proteína é determinada por espectrometria de massa, validação de putativo CK2 substratos facilmente pode ser executada em amostras coletadas durante o procedimento, se os anticorpos dirigidos contra o substrato somáticas de interesse estão disponíveis. Por exemplo, usando o padrão de mancha ocidental, um deve observar uma redução do nível da proteína relevante nas amostras empobrecido (post-IP) e sua presença no antitiofosfato éster immunoprecipitates como temos demonstrado para o conhecido CK2 nucleolin de substrato (Figura 4).
Uma notável limitação desse método é que a etapa final do processo antes da análise por espectrometria de massa depende da capacidade de discernir diferenças discretas na borda padrão em um gel. Assim, é certamente possível que específico CK2 substratos podem ser perdidos se eles são de baixa abundância e, portanto, abaixo do limite de detecção visual. Se um está preocupado com esta possibilidade, um método mais sensível, como coloração de prata pode ser usado para visualizar estas proteínas em vez de usar o azul de Coomassie. Uma consideração adicional que deve ser reconhecida é que um número de substratos CK2 não pode ser identificado usando esta estratégia desde os sites fisiologicamente relevantes já será fosforilada na vivo. Isto é quase certamente o caso dada a atividade constitutiva da CK2. Finalmente, também deve ser notado que esta metodologia só identifica proteínas como substratos putativos de CK2 em vitro. Ensaios subsequentes para validar que estas são substratos fisiologicamente relevantes de CK2 na vivo são necessários e devem implicar a identificação de sítios de fosforilação dependente CK2 e avaliar se a fosforilação destes resíduos particular é alterada em resposta à manipulação da atividade da quinase de CK2.
Em resumo, esta estratégia juntamente com abordagens experimentais a jusante (mapeamento de site fosforilação pela análise de truncamento/exclusão mutagenesis local-dirigido, ensaios in vitro e em vivo funcionais, etc.) irá facilitar o estudo desta incomum quinase e irá aumentar a nossa compreensão dos vários papéis que CK2 atua em vários sistemas biológicos.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado em parte por uma subvenção da Comunidade Universal do realce de pesquisa do departamento da saúde de Pensilvânia para T.I.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mg/mL PNBM | Abcam | ab138910 | 40.5 µL |
| 2.5 mM GTPγS | Sigma-Aldrich | G8634-1MG | 5.4 µL |
| Anti-CK2α (E-7) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-373894 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody | Abcam | ab22758 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab92570 | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| Centrifuge pre-set to 4ºC | ThermoScientific | Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 | |
| cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Lysis Buffer | See recipe below | See recipe below | 30 mL |
| Normal rabbit IgG antibody (isotype control) | Cell Signaling Technology | 2729S | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| PD MiniTrap Column | GE Healthcare | 28-9180-10 | 3 columns |
| Protein A/G Plus Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | 600 µL |
| Recombinant human CK2 holoenzyme | New England Biolabs | P6010S | 2.7 µL |
| Rotator | Labnet: Mini Labroller | Mini Labroller SKU# H5500 | |
| T98G human glioblastoma cells | ATCC | CRL-1690 | |
| Water bath pre-set to 30ºC | Shel Lab | H20 Bath Series Model# SWB15 |
References
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