Analyse von Sauerstoff-Verbrauch im primären kultivierten Maus neonatale Herzzellen mit einer extrazellulären Flux-Analyzer

Zusammenfassung

Dieses Protokoll soll veranschaulichen, wie zu verwenden Maus neonatale Kardiomyozyten als Modellsystem um zu untersuchen, wie verschiedene Faktoren Sauerstoffverbrauch im Herzen ändern können.

Zusammenfassung

Mitochondrien und oxidativen Stoffwechsel sind entscheidend für die Aufrechterhaltung der Funktion des Herzmuskels. Forschung hat gezeigt, dass mitochondriale Dysfunktion ein wichtiger Faktor für beeinträchtigte Herzfunktion bei Herzinsuffizienz gefunden. Im Gegensatz dazu möglicherweise Wiederherstellung defekter mitochondriale Funktion wohltuende Wirkung auf die Verbesserung der Herzfunktion bei Herzinsuffizienz. Daher könnte die regulatorischen Mechanismen und Identifizierung neuer Regler für mitochondriale Funktion Einblicke die genutzt werden könnten, um neue therapeutische Zielstrukturen für die Behandlung von Herzkrankheiten zu entwickeln. Hier ist kardialen Myozyten mitochondriale Atmung mit einer einzigartigen Zellkultursystem analysiert. Zunächst wurde ein Protokoll optimiert, um schnell zu isolieren und hohe Rentabilität Neugeborenen Maus Herzzellen Kultur. Dann ist eine 96-Well-Format extrazelluläre Flussmittel Analyzer verwendet, um den Sauerstoff-Verbrauch von diesen Kardiomyozyten zu beurteilen. Für dieses Protokoll wir säen Bedingungen optimiert und demonstrierte, dass Neugeborenen Maus Herzzellen Sauerstoff-Verbrauch leicht in eine extrazelluläre Flux-Analysator beurteilt werden kann. Wir beachten, dass unser Protokoll auf eine größere Größe der Kultur auch kann und andere Studien, wie z. B. die intrazelluläre Signal- und kontraktile Analyse Funktion.

Einleitung

Um eine stetige kardiale kontraktile Funktion aufrecht zu erhalten, müssen die Herzzellen eine konstante Versorgung mit zellulären Energie hauptsächlich in Form von ATP¹pflegen. Im Herzen entsteht etwa 95 % der ATP durch Mitochondrien, vor allem durch Oxidative Phosphorylierung, zeigt, dass Mitochondrien Herzfunktion^2,3bioenergetische maßgeblich beteiligt. Unterstützen diese Vorstellung ist, dass Dysregulation der mitochondrialen Funktion zu Kardiomyopathie und Herzinsuffizienz^4,5führen kann. Umgekehrt, Wiederherstellung der Fun....

Protokoll

Für die Arbeit mit Neugeborenen Mäusen Bitte verweisen auf lokale Hochschulinstitut Leitlinien Satz her durch die Pflege der Tiere-Programme und die institutionellen und anderen einschlägigen Bestimmungen einhalten. Alle in diesem Protokoll beschriebene Methoden wurden von der UC San Diego institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt und Bundes- und einzelstaatlichen Vorschriften einhalten.

1. Vorbereitung der Reagenzien

1. 25 mL Pre Aufschlusslösungvorbereiten: HBSS (ohne Ca^{2 +} und Mg^{2 +}) ergänzt mit Trypsin (0,5 mg/mL). Sterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,22 µm-Filt....

Ergebnisse

Mithilfe des Protokolls beschrieben, waren die Herzen von Tag 0 neugeborenen Welpen isoliert. 5 x 10⁵ Zellen/Pup stammen, und Herzmuskelzellen bei dichten von 10 x 10³, 20 x 10³oder 30 x 10³ Zellen/Brunnen, in 96-well-Platten (Abbildung 2A) ausgesät wurden. Nach Übernachtung Kultur fanden sich Kardiomyozyten Kunststoff beschichteten Oberfläche gut an und es gab sehr wenige ungebundene Zellen (ungebunden Zellen werde.......

Diskussion

In dieser Studie haben wir ein einfaches Protokoll für die Isolierung und Kultivierung Maus neonatale Kardiomyozyten etabliert. Durch die Verwendung dieser Kardiomyozyten, haben wir auch die Voraussetzungen für die Sauerstoff-Verbrauch messen mit einem extrazellulären Flussmittel Analyzer System optimiert. Das Protokoll erlaubt verwenden Maus neonatale Kardiomyozyten als Modellsystem um zu untersuchen, wie verschiedene Faktoren Sauerstoffverbrauch in den wichtigsten arbeitenden Zellen des Herzens, vergleichbar mit, was i.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Antimycin A	SIGMA	A8674	Hemmt den Komplex III der Mitochondrien
Zellsieb 100 μ m Poren	FALCON	352360	Zur Erfassung von unverdauter
Gewebe Kollagenase Typ II	Worthington	LS004176	Zur Herstellung von Kollagenase-Aufschlusslösung
D-Glucose	SIGMA	75351	Zur Herstellung von mitochodriellen Stresstests Medium
DMEM High Glucose	Life Technologies	11965-092	Zur Herstellung von Zellkulturmedium
DMEM ohne NaHCO3, Glukose, Pyruvat, Glumanin und Hepes	SIGMA	D5030-10X1L	Zur Herstellung des mitochodnialen Stresstestmediums
FCCP (Carbonylcyanid 4-(trifluormethoxy)phenylhydrazon)	SIGMA	C2920	Entkoppelt die mitochondriale Atmung
Fötales Rinderserum (FBS)	Life technologies	26140-079	Zur Herstellung von Zellkulturmedium
Fibronektin aus Rinderplasma	SIGMA	F1141-5MG	Zur Herstellung von Beschichtungslösung für Gewebekulturplatten
Feine Schere	Fine Sciences Tools	14060-10	Zum Sezieren von Herzen
Gelatine aus Schweinehaut	SIGMA	G-1890	Zur Herstellung von Beschichtungslösung für Gewebekulturplatten
HBSS (Hank's balanced salt solution, ohne Ca2+, Mg2+)	Cellgro	21-022-CV	Zum Waschen von Herzen und zur Herstellung von Lösung für den Vorverdauungs- und Collagnase-Aufschluss
HEPES (1 M)	Fisher Scientific	15630080	Zur Herstellung eines mitochodnialen Stresstestmediums
Pferdeserum	Life technologies	26050-088	Zur Herstellung eines Zellkulturmediums
L-Glutamin	SIGMA	G-3126	Zur Herstellung eines mitochodnialen Stresstestmediums
M-199	Cellgro	10-060-CV	Zur Herstellung von Zellkulturmedium
Moria Löffel	Fisher wissenschaftliche	NC9190356	Zum Waschen von Herzen
Oligomycin	SIGMA	75351-5MG	Hemmt die mitochondriale ATP-Synthase
RIPA-Puffer	Fisher scientific	89900	Zur Lyse der Zellen für den Proteinassay
Rotenon	SIGMA	R8875	Hemmt den Komplex I der Mitochondrien
Seepferdchen XFe96 Extrazellulärer Flux -Analysator	Agilent		Gerät zur Analyse der Sauerstoffverbrauchsrate
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	102601-100	Packung mit Flussmittelanalysator-Kulturplatten, Sensorkartuschen und Kalibrant
Natriumpyruvat	SIGMA	P2256	Zur Herstellung von mitochodnialem Stresstestmedium
Gerade Schere Fine	Sciences Tools	91401-12	Zum Sezieren von Herzen
Spritzenfilter 0,2 & mu; m Größe			Für die Sterilfiltration von Aufschlussmedium
Trypsin	USB Corporation	22715 25GM	Zur Herstellung von Lösung vor dem Aufschluss