Eine Fluoreszenz basierende Methode, bakterielle Genregulation in infizierten Gewebe zu studieren

Zusammenfassung

Hier beschrieben ist eine Methode zur Analyse von bakteriellen Genexpression in tierischem Gewebe auf zellulärer Ebene. Diese Methode bietet eine Ressource für das Studium der phänotypische Vielfalt innerhalb einer Bakterienpopulation in Reaktion auf die Umwelt Gewebe während einer Infektion auftreten.

Zusammenfassung

Bakteriellen Virulenz Gene sind oft auf transkriptioneller Ebene durch mehrere Faktoren reguliert, die auf verschiedenen Umweltsignale reagieren. Einige Faktoren wirken direkt auf die Virulenz Gene; andere Steuern Pathogenese durch Anpassung der Ausdruck der nachgeschalteten Regulierungsbehörden oder die Ansammlung von Signalen, die Regler beeinflussen. Während Verordnung ausgiebig während des Wachstums in Vitro untersucht wurde, ist, relativ wenig bekannt über wie Genexpression während der Infektion angepasst wird. Solche Informationen sind wichtig, wenn ein bestimmtes Gen-Produkt ein Kandidat für eine therapeutische Intervention ist. Transkriptionelle Ansätze wie quantitative, Real-Time RT-PCR und RNA-Seq sind leistungsfähige Möglichkeiten zur Genexpression auf globaler Ebene zu untersuchen, aber leiden viele technische Herausforderungen einschließlich niedrige Fülle von bakteriellen RNA im Vergleich zu Host RNA und Probe Abbau durch RNases. Bewertung der Verordnung mit fluoreszierenden Reporter ist relativ einfach und kann mit fluoreszierenden Proteinen mit einzigartigen spektralen Eigenschaften gemultiplext werden. Die Methode ermöglicht für einzellige, räumlich-zeitliche Analyse der Genexpression in Geweben, die komplexe dreidimensionale Architektur und physiochemische Gradienten aufweisen, die bakterielle Regulationsnetzwerke beeinflussen. Diese Information geht verloren, wenn Daten über die Masse Bevölkerung gemittelt werden. Hier beschreiben wir eine Methode zur Quantifizierung der Genexpression in bakterielle Krankheitserreger in Situ. Die Methode basiert auf einfachen Gewebe Verarbeitung und direkte Beobachtung der Fluoreszenz von Reporter Proteine. Wir zeigen den Nutzen dieses System durch die Untersuchung des Ausdrucks von Staphylococcus Aureus Thermonuclease (Nuc), dessen Genprodukt für immun ausweichen und volle Virulenz ex-Vivo- und in-vivo benötigt wird. Wir zeigen, dass Nuc-Gfp äußert sich stark in renalen Abszessen und offenbaren heterogene Genexpression durch teilweise deutlich räumlicher Regulierung der Nuc Promotoraktivität in Abszessen engagiert mit der Immunantwort. Die Methode kann auf jedes Bakterium mit einem manipulierbar genetische System und jede Infektionsmodell, Bereitstellung von wertvollen Informationen für präklinische Studien und Entwicklung von Medikamenten angewendet werden.

Einleitung

Bakterien reagieren auf veränderte physiologische Bedingungen und Veränderungen in der Ernährungszustand ihres Umfeldes differentiell zum Ausdruck bringen, Gene, die für Anpassung und das Überleben erforderlichen. Zum Beispiel besiedeln opportunistische Krankheitserreger Körper Oberflächen bei relativ geringer Dichte und sind oft harmlos. Jedoch sobald das Bakterium physikalische und chemische Barrieren eingedrungen ist, muss es mit Host Immunzelle Counter Abwehrkräfte und eingeschränkte Nährstoffverfügbarkeit¹zu kämpfen. Als Beispiel Staphylococcus Aureus kolonisiert ungefähr ein Drittel der Bevölkerung asymptomatisch aber ist auch di....

Protokoll

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Georgetown University genehmigt.

1. Generation der fluoreszierenden Reporter Belastung

1. Den Genom integrative pRB4 Vektor sequenziell mit EcoRI und SmaI Restriktionsenzymen zu verdauen. Nach Protokoll des Herstellers, eine Übernachtung Verdauung mit SmaI mit 1 µg der pRB4 bei 25 ° C, und fahren Sie dann mit der zweiten Verdauung für 1h bei 37 ° C, indem Sie das Reaktionsgemisch EcoRI hinzufügen. Inkubation bei 65 ° C für 20 min, um die Enzyme zu inaktivieren.
2. PCR Verstärkung die regulatorischen Region von Interess....

Ergebnisse

Wir entwickelten ein Plasmid abgeleitet pMAD³² , die jeder Reporter liefern kann Fusion Konstrukt in das Chromosom durch doppelte Crossover homologe Rekombination (Abbildung 1). Diese Konstruktion ermöglicht Quantitative Analyse aller regulatorischen Regionen, die die Produktion von GFP-Protein und Fluoreszenzsignal über Hintergrund unterstützt. Das Plasmid verleiht die Ampicillin-Resistenz (Ap-^f) für die Pflege und Vermehru.......

Diskussion

Bakterielle Infektionskrankheiten sind eine wachsende Gesundheitsproblem weltweit durch den Erwerb von Antibiotikaresistenz Determinanten⁴⁶. Denn Anpassung an Hostumgebungen wichtig für Wachstum und Überleben während der Infektion, können Strategien zielen gen-Ausdruck-Programme, die Erreger Fitness steigern therapeutisch nützlich erweisen. Ein solches Programm ist der Satz von Genen von SaeR/S zwei Komponentensystem (TCS), zuvor gezeigt, dass eine wichtige Rolle im Immunsystem Steuerhinterziehung.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
5% Schafsblut	Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA)	A10
5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-Galactopyranosid (X-Gal)	ThermoScientific	R0402
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-25
C57Bl/6 Mäuse	Charles River	NA
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C-0378
konfokales Laser-Scanning-Mikroskop	Zeiss	NA
Kryostat-Mikrotom	Thermo Scientific	NA
Culture, Cap	VWR International	2005-02512
D+2:25NA Oligo	Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)	NA
DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
Erythromycin	Sigma-Aldrich	E5389
Durchflussanalysator	Becton Dickinson	NA
Glasperlen	Sigma	Z273627
Miniprep, Plasmid	Promega	A1220
orbitales Schüttelwasserbad	New Brunswick Innova	NA
PCR-Aufreinigung	QIagen	28106
Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS)	Cellgrow	46-013-CM
Plattenleser	Tecan	NA
Precellys 24 Homogenisator	Bertin Laboratories	NA
pUC57-Kan	GenScript (Piscataway, NJ)	NA
Q5 Taq DNA Polymerase	New England Biolabs (Ipswich, MA)	M0491S
Restriktionsenzyme	Neu England Biolabs (Ipswich, MA)	R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).
Reverse Transkriptase	New England BioLabs	E6300L
Sanger Sequencing	Genewiz (Germantown, MD)	NA
Sub Xero klares Gewebe Einfriermedium	Mercedes Medical	MER5000
Superfrost Plus Objektträger	Fisher Scientific	12-550-15
Superloop	GE Lifesciences	18111382
Spritze, Filter	VWR International	28145-481
Syto 40	Thermo Fisher Scientific	S11351	Membran-Permean-Nukleinsäure-Färbung
Tetracyclin	Sigma-Aldrich	T7660
Tryptische Sojabrühe	VWR	90000-376
UV-sichtbares Spektralphotometer	Beckman Coulter-DU350	NA
Vectashield Antifade Eindeckmedium mit DAPI	Vector Laboratories	H-1500