Hier stellen wir ein Protokoll zur Prüfung der glomerulären Permeabilität bei Mäusen mit einem hochempfindlichen, nicht radioaktiven Tracer vor. Diese Methode ermöglicht repetitive Urinanalysen mit kleinen Urinvolumina.
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Methodenartikel
Hochempfindliche Messung der Glomerularpermeabilität bei Mäusen mit Fluorescein-Isothiocyanat-Polysukrose 70
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der Verlust von Albumin im Urin (Albuminurie) sagt kardiovaskuläres Ergebnis voraus. Unter physiologischen Bedingungen werden kleine Mengen von Albumin durch den Glomerulus gefiltert und im Röhrensystem bis zum Erreichen der Absorptionsgrenze resorbiert. Frühe Zunahmen der pathologischen Albuminfiltration können daher durch die Analyse von Albuminurie übersehen werden. Daher erscheint die Verwendung von Tracern zur Prüfung der glomerulären Permselektivität vorteilhaft. Fluoreszierend markierte Tracer fluorescein isothiocyanat (FITC)-Polysucrose (d.h. FITC-Ficoll) kann verwendet werden, um die glomeruläre Permselektivität zu untersuchen. FITC-Polysucrose-Moleküle werden durch den Glomerulus frei gefiltert, aber nicht im Röhrensystem resorbiert. Bei Mäusen und Ratten wurde FITC-Polysucrose in Modellen der glomerulären Permeabilität mit technisch komplexen Verfahren (d. h. radioaktive Messungen, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie [HPLC], Gelfiltration) untersucht. Wir haben ein AUF FITC-Polysucrose Tracer basierendes Protokoll modifiziert und erleichtert, um frühe und geringfügige Erhöhungen der glomerulären Permeabilität zu FITC-Polysukrose 70 (Größe von Albumin) bei Mäusen zu testen. Diese Methode ermöglicht repetitive Urinanalysen mit kleinen Urinvolumina (5 l). Dieses Protokoll enthält Informationen darüber, wie der Tracer FITC-Polysukrose 70 intravenös aufgetragen und Urin über einen einfachen Harnkatheter gesammelt wird. Urin wird über einen Fluoreszenzplattenleser analysiert und zu einem Urinkonzentrationsmarker (Kreatinin) normalisiert, wodurch technisch komplexe Verfahren vermieden werden.
Einleitung
Funktionelle oder strukturelle Defekte innerhalb der glomerulären Filtrationsbarriere erhöhen die glomeruläre Durchlässigkeit gegenüber Albumin, was zur Detektion von Albumin im Urin (Albuminurie) führt. Albuminuria sagt kardiovaskuläres Ergebnis voraus und ist ein wichtiger Marker für glomeruläre Verletzungen1. Selbst niedrige Niveaus von Albuminurie, die im normalen Bereich liegen, sind mit einem erhöhten kardiovaskulären Risikoverbunden 1.
Unter physiologischen Bedingungen wird Albumin durch den Glomerulus gefiltert und fast vollständig im Röhrensystem2,
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Protokoll
Die Untersuchungen wurden gemäß den Richtlinien des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren (US National Institutes of Health Publication No. 85-23, revidiert 1996) durchgeführt. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen institutionellen Zulassungen durchgeführt (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz [LANUV] Referenznummer 84-02.04.2012.A397).
1. Vorbereitung von Instrumenten, Lösungen und Ausrüstung
- FitC-Polysucrose 70 mit 0,9% sterilem Natriumchlorid (NaCl) auf eine Endkonzentration von 10 mg/ml (d. h. 100 mg in 10 ml NaCl) rekonstituieren.
- Dialyse FITC-Polysucrose 7....
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Ergebnisse
Wie in Abbildung 2dargestellt, ist die Methode zur Prüfung der glomerulären Permeabilität bei Mäusen in drei Phasen aufgebaut. Die erste Phase wird als Vorbereitungsphase bezeichnet, in der ein Harnkatheter und ein zentraler Venenkatheter platziert werden. Die zweite Phase wird als Ausgleichsphase bezeichnet, beginnend mit einer intravenösen Bolusinjektion von FITC-Polysukrose 70 und gefolgt von der kontinuierlichen Infusion von FITC-Polysukrose 70 für 60 min.......
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Diskussion
Die vorgestellte Methode ermöglicht es dem Prüfer, die glomeruläre Permeabilität bei Mäusen auf sehr empfindliche Weise mit einem Tracer zu testen. Mit dieser Methode kann eine kurzfristige Erhöhung der glomerulären Permeabilität mit nur geringen Mengen Urin diagnostiziert werden. Die wichtigsten Schritte für die erfolgreiche Beherrschung dieser Technik sind 1) die Entwicklung manueller Expertise in der Mauschirurgie, insbesondere in der Kanulation einer zentralen Vene, 2) Platzierung des Harnkatheters ohne Beeinträchtig.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Die Autoren danken Christina Schwandt, Blanka Duvnjak und Nicola Kuhr für ihre außergewöhnliche technische Unterstützung und Dr. Dennis Sohn für seine Hilfe beim Fluoreszenzscan. Diese Forschung wurde durch ein Stipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP B18 an L.C.R. und L.S. unterstützt. Der Geldgeber hatte keine Rolle bei der Erstellung, Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | Mikroskop für die Mauschirurgie |
| KL1500LCD | Pulch- und Lorenzmikroskopie | 150500 | Licht für die Mauschirurgie |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | Feinschere |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | für Halsschnitt |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | für die Chirurgie |
| Prä parierklemme | Aesculap | BJ008R | für die Chirurgie |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | Seidenfaden |
| Ketamin 10% | Medistar | Anästhesie | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | Anästhesie | |
| Feinbore Polyethylen Schlauch ID 0,28 mm OD 0,61 mm | Portex | 800/100/100 | Katheter |
| Feine Bore Polyethylen Schlauch ID 0,58 mm OD 0,96 mm | Portex | 800/100/200 | Katheter |
| Harvard Apparat 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | Spritzenpumpe |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381823 | Harnkatheter |
| Multimode-Detektor DTX 880 | Beckman Coulter | Plattenleser | |
| 384 Well Mikrotiterplatte | Nunc | 262260 | 384 Well Platte |
| Kreatinin Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK080 | zur Messung der Kreatininkonzentration |
| 96 Well Platte | Nunc | 260836 | für Kreatinin-Assay |
| FITC-markierte Polysuccrose 70 | TBD | Consultancy FP70 | FITC-Ficoll |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | zur Prüfung der glomerulären Permeabilität |
| BP-98A | Softron | zur Blutdruckmessung | |
| OTS 40.3040 | Medite | 01-4005-00 | Heizplatte für die Mauschirurgie |
| Instillagel 6mL | Farco-Pharma GmbH | für Harnkatheter | |
| Exacta | Aesculap | GT415 | Rasierer |
Referenzen
- Chronic Kidney Disease Prognosis Consortium,, et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
- Mori, K. P., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
