Methodenartikel

Montage von molekularen Shuttles Powered by reversibel befestigt Kinesine

DOI:

10.3791/59068

⸱

26. Januar 2019

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir präsentieren ein Protokoll zur molekularen Shuttles zu bauen wo treiben Motorproteine Kinesin Oberfläche eingehalten Farbstoff-markierten Mikrotubuli. Schwachen Wechselwirkungen die Kinesine mit der Oberfläche ermöglicht ihre reversible Bindung. Dadurch entsteht ein Nano-System das dynamische Montage und Demontage der Komponenten unter Beibehaltung seiner Funktionalität aufweist.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt das Kinesin angetrieben molekulare Shuttles mit einer schwach und reversible Bindung die Kinesine an der Oberfläche zu erstellen. Im Gegensatz zu früheren Protokolle in diesem System Mikrotubuli Motorproteine Kinesin aus Lösung zu rekrutieren und auf eine Unterlage legen. Die Kinesine erleichtert wiederum das Gleiten von den Mikrotubuli entlang der Oberfläche vor plötzliches wieder in die Bulk-Lösung, so dass wieder eingestellt werden. Dieses ständige auf- und Abbau führt zu auffallend dynamisches Verhalten im System, z.B. die Bildung von temporären Kinesin Wanderwege von Mikrotubuli gleiten.

Verschiedene experimentelle Methoden werden in diesem Experiment beschrieben: UV-Vis-Spektrophotometrie wird zur Bestimmung der Konzentration von Stammlösungen der Reagenzien, Deckgläsern, werden Ozon und Ultraviolett (UV) behandelt und silanisiert vor in Durchflusszellen und Totalreflexion Fluoreszenz montiert werden (TIRF) Mikroskopie gleichzeitig Kinesin Motoren und Mikrotubuli-Filamenten Image verwendet werden.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Interaktionen über das Verhalten der aktiven Nanosysteme wurden immer langlebig, nahezu irreversibel Anleihen1,2,3,4,5,6 charakterisiert ,7,8. Eine gut untersuchte Beispiel dafür ist die Mikrotubuli-Kinesin-System, wo gleiten Mikrotubuli von irreversibel Oberfläche gebundene Kinesin Motoren1,2,3,4angetrieben, 5. Systeme, in denen die Komponenten sind reversibel miteinander verbunden, wurden studierte theoretisch9,10 und erreicht auf der makroskopischen11,12, aber Skalierung dieser Systeme auf die nanoskalige wurde schwierig. Einer der Hauptgründe dafür ist, dass brechen und Verbindungen zwischen den Komponenten oft die Reform erfordert eine große Veränderung der Umweltbedingungen. Obwohl solche Änderungen in den letzten13,14,15umgesetzt wurden, würde sie verlassen sich auf das System selbst ändern, anstatt ihn an seine Umgebung anzupassen. Molekularer Ebene Systeme, in denen Komponenten immer wieder montieren und in Strukturen zu reorganisieren, ohne zu stören die gesamte Umgebung, in der die Experimente stattfinden, Gestaltung öffnet die Tür für die Erforschung einer Vielzahl von dynamischen Verhalten 16 , 17.

Hier, wir beschreiben und zeigen das ausführliche Protokoll für die Erstellung einer dynamisch Montage und Demontage System funktioniert im Nanobereich. Das System und das allgemeine Verhalten wurde eingeführten früheren18: Mikrotubuli Filamente werden durch Spuren von reversibel Oberfläche gebundene Kinesin-1-Motoren angetrieben. Diese Motorproteine Kinesin rekrutieren sich aus der Lösung zu helfen, Mikrotubuli nach vorne treiben vor plötzliches wieder kurz danach. Sobald wieder in Lösung, sie wieder eingestellt werden können um eine neue Mikrotubuli zu treiben. In den letzten13,14,benötigt15brechen und die Reform der Anleihen ökologischen Änderungen; im Gegensatz dazu bleibt die Umwelt unsere Messzelle unverändert, während die Kinesin-Motoren mit der Oberfläche interagieren.

Dieses Protokoll wird interessierten Forschern helfen, (1) alle Schritte des Protokolls zu visualisieren, und (2) Unterstützung bei der Problembehandlung dieser Art von Test. Es wurde von Howard Et Al. 199319beschriebenen Verfahren abgeleitet.

Protokoll

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1. Vorbereitung der Lösung

Achtung: Drei der in diesem Protokoll (Toluol, siliciumhaltigen und Dithiothreitol) verwendeten Reagenzien sind hochgiftig. Konsultieren Sie bitte die entsprechenden Sicherheitsdatenblätter (SDB) vor dem Gebrauch. Darüber hinaus Teile dieses Protokolls unter ein höheres Maß an Schutz, Schutzbrille und zwei Sätze von Schutzhandschuhe tragen, wie angegeben durchgeführt werden müssen. Sofern nichts anderes empfohlen, können die Experimente auf Laborbänke durchgeführt werden, wobei alle die geeignete persönliche Schutzausrüstung (Schutzbrille, Handschuhe, Kittel, voller Länge Hosen und geschlossene Schuhe).

Hinweis: Die Konzentrationen von ATP, Kinesin und Mikrotubuli, die in diesem Protokoll verwendet werden können angesichts der Bedürfnisse jedes Experiment geändert werden. Jedoch wenn geändert, Bitte stellen Sie sicher, dass die Endkonzentrationen der anderen Reagenzien die gleichen wie bleiben unten. Alle Versuche wurden bei Raumtemperatur (~ 25 ° C) durchgeführt.

  1. Vorbereitung der Stammlösungen
    Hinweis: Vorbereiten und aliquoten folgenden Lösungen im Voraus. Alle Aliquote können bei Raumtemperatur (~ 25 ° C) zubereitet werden.
    1. BRB80 Puffer
      Hinweis: Der Puffer für die meisten der in diesem Protokoll verwendeten Lösungen ist BRB80. BRB80 werden in großen Mengen zubereitet und in einer Tiefkühltruhe-20 ° C gelagert.
      1. Lösen Sie 24,2 g Piperazin-N, N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (Rohre) und 3,1 g Kaliumhydroxid (KOH) in 800 mL entionisiertem Wasser, 800 mL 100-mM-Rohre zu machen. Fügen Sie 100 mL 10 mM Magnesiumchlorid (MgCl2) und 100 mL 10 mM Ethylenglykol-Tetraacetic Säure (EGTA) zu einem Endvolumen von 1 L. Raising der pH-Wert auf 8 mit Kalilauge (KOH) in der Auflösung von Rohren und EGTA helfen kann.
        Hinweis: Die Endkonzentrationen von Chemikalien in der BRB80-Puffer sind 80-mM-Rohre, 1 mM MgCl2und 1 mM EGTA.
      2. Stellen Sie den pH-Wert des Puffers zu 6,9 mit KOH und Salzsäure (HCl).
    2. ATP
      1. Bereiten Sie eine 1 mL Lösung von 100 mM ATP Reinstwasser. Die Lösung in 10 μl-Aliquots pipettieren. Die Aliquote in einem-80 ° C Gefrierschrank aufbewahren.
    3. GTP
      1. Bereiten Sie eine 500 μl Lösung von 25 mM GTP Reinstwasser. Die Lösung in 5 μL Aliquote pipettieren. Die Aliquote in einem-80 ° C Gefrierschrank aufbewahren.
    4. MgCl2
      1. Bereiten Sie eine 1 mL Lösung von 100 mM MgCl2 Reinstwasser. Die Lösung in 10 μl-Aliquots pipettieren. Speichern Sie die Aliquote in einem Gefrierschrank-20 ° C.
    5. Kasein
      1. Wiegen 1 g der trockenen Kasein und überträgt es auf einem konischen Zentrifugenröhrchen 50 mL. Fügen Sie 35 mL BRB80-Puffer mit dem Rohr, das Casein Pulver aufzulösen.
      2. Legen Sie die Lösung in einem Tumbler in einem kalten Raum über Nacht auflösen. An diesem Punkt sieht die Lösung dick und zähflüssig.
      3. Lassen Sie das Rohr aufrecht in einem Kühlschrank 4 ° C erlauben großen ungelösten Klumpen zu begleichen. Übertragen Sie den Überstand auf einen neuen Schlauch.
      4. Drehen Sie das Rohr in einer Zentrifuge bei 1.000 X g zu Pellets, mehr Ausscheidungen. Übertragen Sie den Überstand noch einmal zu einem neuen Schlauch
      5. Immer wieder filtern Sie die Lösung mit Hilfe von 0,2 μm (7 bar Maximaldruck) filtern. Die Lösung zu dick, viele Filter verstopft werden, so wiederholen Sie diesen Schritt, bis der Filter klar ist und unclogged.
      6. Bestimmen Sie die Kasein-Konzentration in der resultierenden Lösung mit UV/Vis-Spektrophotometrie, mit Kasein Aussterben Koeffizient von 19 mM-1∙cm-1 bei 280 nm20. Angenommen, ein Molekulargewicht von 23 kDa für Kasein, verdünnen Sie die Lösung zu einer Konzentration von 20 Mg∙mL-1 in BRB80.
      7. Die Lösung in 20 μl-Aliquots pipettieren und speichern die Aliquote in einem Gefrierschrank-20 ° C.
    6. D-Glucose
      1. Bereiten Sie eine 1 mL Lösung 2 M D-Glucose in Reinstwasser. Die Lösung in 10 μl-Aliquots pipettieren. Speichern Sie die Aliquote in einem Gefrierschrank-20 ° C.
    7. Glukose-oxidase
      1. Bereiten Sie eine 1 mL Lösung von 20 Mg∙mL-1 Glukose-Oxidase in BRB80. Die Lösung in 10 μl-Aliquots pipettieren. Speichern Sie die Aliquote in einem Gefrierschrank-20 ° C.
    8. Katalase
      1. Bereiten Sie eine 1 mL Lösung von 0,8 Mg∙mL-1 Katalase in BRB80. Die Lösung in 10 μl-Aliquots pipettieren. Speichern Sie die Aliquote in einem Gefrierschrank-20 ° C.
    9. Dithiothreitol (DTT)
      Hinweis: Da DTT leicht flüchtig und giftig ist, bitte führen Sie folgende Schritte unter einem Abzug.
      1. Bereiten Sie eine 1 mL Lösung von 1 M DTT in ultrareinem Wasser verdünnt. Die Lösung in 10 μl-Aliquots pipettieren. Speichern Sie die Aliquote in einem Gefrierschrank-20 ° C.
    10. Paclitaxel
      1. Bereiten Sie eine 1 mL Lösung von 1 mM Paclitaxel in DMSO verdünnt. Die Lösung in 10 μl-Aliquots pipettieren. Speichern Sie die Aliquote in einem Gefrierschrank-20 ° C.
    11. Dimethyl Sulfoxid (DMSO)
      Hinweis: Die DMSO verwendet in diesen Experimenten ist rein.
      1. 1 mL reines DMSO in 10 μl-Aliquots pipettieren. Speichern Sie die Aliquote in einem Gefrierschrank-20 ° C.
    12. Kreatin-Phosphat
      1. Bereiten Sie eine 1 mL Lösung von 0,2 M Kreatinphosphat in Reinstwasser. Die Lösung in 10 μl-Aliquots pipettieren. Speichern Sie die Aliquote in einem Gefrierschrank-20 ° C.
    13. Kreatin-Creatinphosphokinase
      1. Bereiten Sie eine 1 mL Lösung von 200 units· L-1 Kreatin Creatinphosphokinase Reinstwasser. Die Lösung in 10 μl-Aliquots pipettieren. Speichern Sie die Aliquote in einem Gefrierschrank-20 ° C.
    14. Nickel (II) Sulfat
      1. 500 mL einer Lösung von 50 mM Nickel (II) Sulfat Reinstwasser vorzubereiten. Speichern Sie die Lösung bei Raumtemperatur (~ 25 ° C).
    15. Poly(Ethylene Glycol)-Block-Poly(propylene glycol)-Block-Poly(ethylene glycol) (PEG-PPG-PEG) Lösung
      1. 2 mg von PEG-PPG-PEG Abwiegen (Nummer mittleres Molekulargewicht: 14.600 G∙mol-1)-NTA Puder mit einem Gewicht von Papier. PEG, PPG, PEG-NTA ist die Tribloc-Copolymer funktionalisiert mit einem Nitrilotriacetic Säuregruppe (NTA). Beziehen sich auf die Tabelle der Materialien für mehr Details über die PEG-PPG-PEG-NTA.
      2. Übertragen Sie das Pulver in einen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Fügen Sie 1 mL der Stammlösung Nickel (II) Sulfat mit dem Rohr. Vortex bis Pulver aufgelöst ist und keine sichtbaren Klumpen bleiben.
      3. Speicher für bis zu einem Monat bei Raumtemperatur.
  2. Vor dem Start eines Experiments
    1. Füllen Sie einen Eimer mit Eis.
    2. Nehmen Sie eine Aliquote aus jedem der 13 Reagenzien in Abschnitten 1.1.1 zu 1.1.13 oben beschrieben und fügen Sie sie in den Eimer, so halten sie auf dem Eis. Jeder der Reagenzien vor dem Gebrauch auftauen.
  3. Mikrotubuli-Vorbereitung
    Hinweis: Mikrotubuli wurden von einer 20 μg aliquoten von Farbstoff-markierten lyophilisierter Tubulin polymerisiert. Die Erregung Wellenlänge des Farbstoffs ist von 647 nm.
    1. Vorbereitung des Puffers Mikrotubuli Wachstum
      1. Pipettieren 21,8 μl BRB80-Puffer in einem kleinen (0,6 mL) Microcentrifuge Schlauch. 1 μl der Vorratslösung MgCl2 , 1 μL der Vorratslösung GTP und 1,2 μL der Vorratslösung DMSO hinzufügen.
        Hinweis: Damit sind die Endkonzentrationen der Reagenzien im BRB80 Puffer 4 mM MgCl2, 1 mM GTP und 5 % (V/V) Dimethyl Sulfoxid.
    2. Mikrotubuli-Polymerisation
      1. Fügen Sie 6,25 μL der Mikrotubuli Wachstum Puffer direkt in eine 20 μg aliquoten von beschrifteten lyophilisierter Tubulin. Wirbel der aliquoten für 5 s bei 30 rps.
      2. Kühlen Sie die aliquoten für 5 min auf Eis ab, bevor Sie bei 37 ° C für 45 min Inkubation und fahren Sie mit Abschnitt 1.3.3.
    3. Stabilisierung der Mikrotubuli
      1. 490 μl BRB80-Puffer 5 μL der regelmÄÑig Paclitaxel-Lösung hinzufügen. Wirbel die Lösung für 10 s bei 30 rps.
      2. Sobald die 45 min Inkubation für die Mikrotubuli sind oben, fügen Sie 5 μL der polymerisierten Mikrotubuli-Lösung der BRB80/Paclitaxel-Projektmappe hinzu.
        Hinweis: Diese 100-fold verdünnt, stabilisiert, Mikrotubuli-Lösung wird im folgenden als MT100 bezeichnet werden. Es eignet sich für bis zu 5 Tage, und es kann verdünnt werden, um die gewünschte Mikrotubuli-Dichte für jedes Experiment zu erhalten.
  4. Motilität Lösung
    1. Enzymatische Antifade, regenerierende System ATP und ATP
      1. 291 μl BRB80-Puffer 9.0 μL der regelmÄÑig Kasein-Lösung hinzufügen.
      2. Wenn die gewünschte ATP-Konzentration für das Experiment kleiner als 1 mM, Pipettieren 83 μL der BRB80/Kasein-Lösung zu einem neuen 0,6 mL Microcentrifuge Schlauch ist. Ansonsten, Pipettieren 85 μl der Lösung zu einem neuen 0,6 mL Microcentrifuge Schlauch.
      3. Diese Röhre 1 μL der D-Glucose, 1 μL von Glukose-Oxidase, 1 μL der Katalase und 1 μL von DVB-t hinzufügen.
        Hinweis: Diese Chemikalien bilden eine enzymatische antifade cocktail21 , die die Immunofluoreszenz durch Entfernen reduzieren gelösten Sauerstoff und abschrecken reaktive Radikale. Dies reduziert Immunofluoreszenz und Mikrotubuli Zerfall verursacht durch die Erregung Beleuchtung während der Fluoreszenz imaging22,23.
      4. Für Experimente, in denen die ATP-Konzentration gewählt wird, um deutlich unter 1 mM, fügen die folgenden Reagenzien zur Lösung eines ATP-Regeneration-Systems: 1 μL regelmÄÑig Kreatin-Phosphat-Lösung und 1 μL regelmÄÑig Kreatin Creatinphosphokinase Lösung.
      5. Die Motilität-Lösung 1 μl der Stammlösung ATP hinzufügen. Flick oder Wirbel aliquoten Chemikalien homogen verteilen.
        Hinweis: Damit die Endkonzentration von Chemikalien in der Lösung sind 10 μM Paclitaxel, 0,5 Mg·mL−1 Kasein, 20 mM D-Glucose, 200 μg·mL−1 Glukose-Oxidase, 8 μg·mL−1 Katalase, 10 mM Dithiothreitol, 2 mM-Kreatin-Phosphat (sofern hinzugefügt), 2 Units· L−1 Kreatin Creatinphosphokinase (sofern hinzugefügt) und 1 mM ATP. Diese Lösung wird im folgenden die Motilität-Lösung genannt werden.
    2. Kinesin
      Hinweis: In diesen Experimenten verwendeten Lager Kinesin-Lösung von G. Crying im Zentrum für integrierte Nanotechnologien an den Sandia National Laboratories vorbereitet und unter einer Nutzungsvereinbarung (https://cint.lanl.gov/becoming-user/call-for-proposals.php) zur Verfügung gestellt. der Puffer verwendet, hier besteht aus 40 mM Imidazol, 300 mM NaCl, 0,76 G· L-1 EGTA, 37,2 mg· L-1 EDTA, 50 g· L-1 Saccharose, 0,2 mM DÄMMUND und 50 μM Mg-ATP. Für diese Serie von Experimenten wurde das rkin430eGFP Kinesin Konstrukt verwendet. Dies ist ein Kinesin bestehend aus die ersten 430 Aminosäuren der Ratte Kinesin schwere Kette mit eGFP und eine C-terminale His-Tag an der Rute Domäne24verschmolzen. Es drückte sich in Escherichia coli und gereinigt, mit einer Ni−NTA-Spalte. Die Konzentration der GFP-Kinesin Vorratslösung war 1,8 ± 0,3 μM gemäß UV/Vis-Spektrophotometrie, mit einem Aussterben Koeffizienten für GFP von 55 mM-1·cm-1 bei 489 nm25, und unter Berücksichtigung, dass Kinesin ist ein Dimer.
      1. Bestimmen Sie die gewünschte Kinesin Konzentration oder Oberfläche Dichte für das Experiment. Diese Konzentration ist für typische Assays, 20 nM. Wenn die Kinesin-Konzentration muss verdünnt werden mehr als hundertfach, verdünnen Sie es in einer Lösung von BRB80, die 0,5 Mg·mL-1 Casein enthält.
      2. Die Motilität-Lösung 1 µL Kinesin-Lösung hinzufügen, um eine Endkonzentration von etwa 20 bekommen nM.
    3. Mikrotubuli
      1. Fügen Sie 10 μL der MT100 Lösung in Abschnitt 1.3 der Motilität Lösung vorbereitet.
        Hinweis: Diese Motilität-Lösung kann bis zu 3 Stunden verwendet werden. Nach dieser Zeit verliert das antifade System seine Wirksamkeit, weil die Glucose in der Lösung durch die enzymatische Reaktion aufgebraucht ist.

2. Montage der Durchflusszellen

  1. Waschen der Deckgläsern
    1. Für Durchflusszellen, verwenden eine große Deckglas (Dimension: 60 x 25 mm) und einer kleinen (Abmessungen: 22 x 22 mm)19.
    2. Spülen Sie alle Deckgläsern zweimal mit Ethanol und zweimal mit Reinstwasser. Beschallen Sie die Deckgläsern Reinstwasser für 5 min. Trocknen im Ofen bei einer Temperatur von 50 – 75 ° C.
    3. Mit einem UV/Ozon cleaner (siehe Tabelle der Werkstoffe und Anweisungen des Herstellers), einseitig jedes Deckglas für 15 min. führen diesen Schritt kann zu behandeln, bei Raumtemperatur (~ 25 ° C) und in normalen atmosphärischen Bedingungen (Druck von 1 atm).
    4. Drehen Sie vorsichtig jede Deckglas auf die andere Seite (mit einer Pinzette) und dieser Seite sowie UV/Ozon behandeln.
    5. Beschallen Sie die Deckgläsern Reinstwasser wieder für 5 min vor dem Trocknen sie wieder in den Ofen bei einer Temperatur von 50 – 75 ° C.
  2. Behandlung von Deckgläsern PEG-PPG-PEG Beschichtung ermöglichen
    Hinweis: Die siliciumhaltigen und das Toluol verwendet in diesem Teil des Protokolls wird hochgiftig, führen Sie folgende Schritte unter einem Abzug während der Einnahme der folgenden Vorsichtsmaßnahmen: tragen Sie zwei Sätze von Schutzhandschuhen und ein Langarm-Shirt unter ihrem Labor Mantel. Stecken Sie die Kanten von Handschuhen in die Ärmel des Hemdes, damit keine Haut aus den Unterarmen die Chemikalien im Falle einer Verschüttung direkt ausgesetzt ist. Tragen Sie Schutzbrille.
    1. Verdünnen Sie 25 mL des reinen siliciumhaltigen in 475 mL Toluol. Tauchen Sie jedes Deckglas in die siliciumhaltigen und Toluol Lösung für 15 Sekunden.
    2. Waschen Sie die Deckgläsern, zweimal in Toluol und dreimal in Methanol. Trocknen Sie die Deckgläsern mit unter Druck stehenden Stickstoff.
  3. Montage von Deckgläsern in Durchflusszellen
    1. Sobald die Deckgläsern trocken sind, schneiden Sie ein 2 x 2,5 cm Stück doppelseitigem Klebeband vertikal in zwei 1 x 2,5 cm Streifen.
    2. Eine heikle Aufgabe Wischer setzen Sie die große Deckglas auf und kleben Sie die Klebeband-Streifen längs entlang der Kanten des Deckglases zur Schaffung eines 1 x 2,5 cm zwischen den Stücken der Band.
    3. Halten Sie den kleinen Deckglas auf die Klebeband-Streifen, Zelle Fließmontage zu beenden.

3. fließen die Lösungen in einer Durchflusszelle

  1. Die montierten Durchflusszelle fließen Sie ca. 20 μL der PEG-PPG-PEG-Lösung. Das Volumen, das in der Zelle geflogen wird muss groß genug sein, den Saal zu füllen. Verwenden Sie in den nächsten Schritten das gleiche Volumen beim Austausch von Lösungen.
  2. Die PEG-PPG-PEG-Lösung für 5 Minuten an der Oberfläche aufnehmen lassen. Tauschen Sie die PEG-PPG-PEG-Lösung mit BRB80 Puffer durch fließt des Puffers in 3 Mal aus. Fließen Sie die Motilität-Lösung in der Messzelle.
  3. Versiegeln Sie die Kanten der Messzelle mit Fett um Verdunstung zu verhindern, wenn das geplante Experiment mehr als eine Stunde.
    Hinweis: Die Durchflusszelle ist jetzt bereit, abgebildet werden.

4. imaging eine Durchflusszelle

  1. Führen Sie die Bildgebung mit einem Ziel-Typ Totalreflexion Fluoreszenz (TIRF) Setup für die Mikrotubuli und die Kinesin-Motoren (siehe Tabelle der Materialien).
    Hinweis: Hier, verwendeten wir ein Mikroskop mit einem 100 X / 1,49 numerische Apertur Objektiv, mit zwei Lasern, eins mit einer Wellenlänge von 642 nm und eine maximale Leistung von 140 mW, und zum anderen mit der Wellenlänge von 488 nm und eine maximale Leistung von 150 mW.
  2. Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl, auf das Ziel.
  3. Die Mikroskop-Plattform setzen Sie die Durchflusszelle auf und bringen Sie das Ziel, bis zum Kontakt zwischen das Öl auf das Ziel und der Messzelle.
  4. Mithilfe des Mikroskops Verriegelungssystem Abdeckung um alle Laser-Licht an der Flucht zu blockieren.
  5. Schalten Sie den Laser und konzentrieren Sie sich auf der unteren Fläche der Messzelle. Die Mikrotubuli sind Eindringmittel gekennzeichnet und begeistert bei einer Wellenlänge von 647 nm. Sie werden mit einem 642 nm Laser, während eine 488 nm-Laser für die GLP-Kinesin-Motoren verwendet wird abgebildet werden.
  6. Notieren Sie die Bilder oder Videos von Interesse. In der Regel ist die Laserleistung von ca. 30 mW und einer Belichtungszeit von 50 ms für beide laser-Kanäle. Bilder können für aufgezeichnet werden, solange es Motilität in der Messzelle gibt.
    Hinweis: Das Laser-Licht ist schädlich für das Auge und kann irreparable Schäden verursachen. Bitte stellen Sie sicher, dass das Leuchtfeld komplett mit einem undurchsichtigen Deckel bedeckt ist.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In diesen Experimenten verwendeten wir eine 1.000 Mal Verdünnung der Mikrotubuli in Abschnitt 1.3.2 vorbereitet. Die Kinesin-Konzentration war 20 nM und die ATP-Konzentration betrug 1 mM. Bildgebung erfolgte mittels TIRF-Mikroskopie. Segelfliegen Mikrotubuli wurden separat von den Kinesin-Motors abgebildet: Mikrotubuli waren sichtbar nach Anregung mit einem 647 nm Laser (Abbildung 1, rot), und die GFP-Kinesin war sichtbar, wenn Sie mit einem 488 nm Laser (Abbildung 1, grün) angeregt. Die Zeit zwischen Anregung mit dem roten und grünen Licht war weniger als 1 s. Die Zeit zwischen den Bildern war 10 S. Mikrotubuli stabile gleiten angezeigt. Die durchschnittliche Mikrotubuli gleiten Geschwindigkeit war ca. 800 nm/s. Die Mikrotubuli Oberflächendichte war 400 mm-2. Spuren von Kinesin (grün) erschien, hinter dem hinteren Ende der Mikrotubuli (rot) für einige Mikrometer zu verlängern.

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Abbildung 1: Mikrotubuli von schwach Oberfläche gebundene Kinesin Motoren angetrieben gleiten. Wie Mikrotubuli vorankommen, sammeln sie Kinesin Motoren von Lösung. Diese Motoren wechseln zwischen zwei Staaten: Single-gebunden an die Mikrotubuli und Doppel-gebunden an die Mikrotubuli und der Oberfläche. Gebundenen Doppelmotor erreicht das Ende von den Mikrotubuli, der Motor ist hinter sich gelassen und langsam von der Oberfläche mit einer Weg von etwa 0,1 s-1desorbs. Infolgedessen bleiben Spuren von Kinesin Motoren hinter der Mikrotubuli. Obere Reihe: rot (Mikrotubuli) Kanal. Mittlere Reihe: grün (Kinesin) Kanal. Untere Reihe: rot (Mikrotubuli) und grüne (GFP-Kinesin) Kanal kombiniert. Maßstabsleiste: 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dieser Arbeit präsentieren wir eine aktive nanoskaligen System welche selbst schwach bindenden Bausteine um eine eigene Spur zu konstruieren montiert. Wie in Abbildung 1dargestellt, Segelfliegen Mikrotubuli sammeln Kinesin Motoren aus Lösung und auf der Oberfläche zu hinterlegen. Die Kinesin-Motoren bleiben im Zuge der Mikrotubuli für einen kurzen Zeitraum vor der Rückkehr in Lösung. So Motoren in diesem Experiment Kinesin Alternative zwischen 3 Zustände:

(1) ein Mikrotubuli Single-gebundenen Zustand: Dies ist, wenn ein Kinesin zuerst an ein Mikrotubuli bindet. Es existiert im Gleichgewicht mit Zustand (2).

(2) eine Doppel-gebundenen Zustand: in diesem Fall ein Mikrotubuli Single-gebundenen Kinesin auch bindet an die Oberfläche über die His-Tag. Diese Doppel-gebundenen Zustand ermöglicht Mikrotubuli Antrieb.

(3) eine einzelne Oberfläche gebunden Zustand: ein Doppel-gebundenen Kinesin, der hat am Ende die Mikrotubuli ging und hat noch nicht von der Oberfläche desorbiert ist in diesem Zustand. Diese Motoren können in Abbildung 1 (kombinierte und grünen Kanäle) beobachtet werden: sie hinter das Ende der Mikrotubuli für einige Mikrometer zu erweitern und bilden seine abnehmende Trail.

Der wichtigste Schritt dieses Protokolls ist die Bildung der hydrophoben Oberfläche auf der Folie. Nicht nur ist es gefährliche Chemikalien verwenden, sondern es ermöglicht auch die PEG PPG PEG funktionalisiert mit der NTA-Gruppe zu beschichten die Oberfläche, wodurch dann das Kinesin reversibel binden an die Oberfläche. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Messzelle mit Fett versiegeln. Dies ermöglicht längere Bildgebung ohne Flüssigkeit in den Fluss Zelle verdampfen.

Die primären Änderungen an dieser Technik bestehen aus Mikrotubuli Konzentration, Kinesin Konzentration und ATP-Konzentration ändern. Ändern Mikrotubuli Konzentration ändert die Anzahl der Mikrotubuli, die auf die Oberfläche gleiten. Kinesin Konzentration wird die Anzahl der Kinesin-Moleküle ändern, die an die Mikrotubuli binden kann. Allerdings könnte die Kinesin-Konzentration über die Beträge, die bereits in diesem Experiment definiert Hintergrundfluoreszenz, so dass es schwieriger zu sehen, die Kinesin Loipen gleiten Mikrotubuli zurückgelassen erhöhen. Unterdessen wird ATP Konzentrationen unter 10 µM senken Mikrotubuli gleiten Geschwindigkeit erheblich verringern. Wenn dieser Effekt gewünscht wird, ist es notwendig, eine regenerierende System bestehend aus Kreatin Phosphatase und häufigsten ATP zu nutzen.

Eine mögliche Einschränkung dieser Technik ist, dass aufgrund der großen aktiven Kinesin Inhalt des Systems, die ATP schnell verzehrt werden kann, und Experimente weniger als eine Stunde unter bestimmten Bedingungen dauern. Dies wäre beispielsweise der Fall, wenn man verwendet eine zweifach höhere Kinesin Konzentration und fünffach höhere Mikrotubuli-Konzentration als was in diesem Protokoll dargestellt wird.

In unserer bisherigen Arbeit18, wir untersucht die räumliche Verteilung der Kinesin Motoren entlang der Mikrotubuli, beweisen, dass Segelfliegen Mikrotubuli sammeln Kinesin Motoren aus Lösung, was zu einem Anstieg der Dichte von Motoren entlang der Länge des die Mikrotubuli. Wir fanden auch, dass die Mikrotubuli gleiten Stabilität eine nichtlineare Abhängigkeit der Lösung Kinesin-Konzentration und Mikrotubuli-Geschwindigkeit unter Beweis gestellt.

Die vorgestellte Protokoll ebnet den Weg für eine effizientere Nutzung der Protein-Motoren im Nanobereich entwickelt Systeme und zur weiteren Untersuchung in das Design der aktiven Nanosysteme, die im dynamischen Gleichgewicht befinden. Darüber hinaus ermöglicht die dynamische Natur dieses Systems als Modellsystem für das Studium zur Selbstheilung und dynamischen Austausch von molekularen Bestandteilen, schließen der Lücke zwischen technischen und natürlichen Strukturen dienen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erkennen dankbar gemäß NSF Grant NSF-DMR 1807514 finanziellen Unterstützung. Die Autoren danken für die Bereitstellung der GFP-Kinesin-Protein G. Crying und V. Vandelinder. Diese Arbeit durchgeführt wurde, teilweise am Zentrum für integrierte Nanotechnologien, ein Büro der Wissenschaft Benutzer Anlage betrieben für uns Department of Energy (DOE) Office of Science vom Los Alamos National Laboratory (Vertrags-Nr. DE-AC52-06NA25396) und Sandia National Laboratories (Con-Tract Nr. 97 DE-AC04-94AL85000). Die Autoren danken Dr. Jennifer Neff und AllVivo Vascular für das Geschenk des PEG-PPG-PEG mit NTA funktionalisiert.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
488 nm LaserOmicron LaserageLuxX 488-150
642 nm LaserOmicron LaserageLuxX   642
CaseinSigmaC7078-500G
Katalase aus RinderleberSigmaC40-500MG
KreatinphosphatSigmaP-7936
Kreatin PhosphokinaseSigmaC3755-500UN
D-GlucoseSigmaG2133-50KU
Dichlordimethylsilan LösungSigma40140-25MLToxisches
DimethylsulfoxidSigma34869-100ML
DithiothreitolSigmaD0632-5GToxisches
Eclipse TINikon Instruments
eGFP rkin430Zur Verfügung gestellt von George Bachand
EGTASigmaE4378-25G
Falcon 50 mL Konische ZentrifugenröhrchenFisher Scientific14-959-49A
GlukoseoxidaseSigmaG0543-10KU
GuanosintriphosphatSigmaG8877-10MG
Kimwipes Delicate Task WischerSigma Pharmaceuticals8089
MagnesiumchloridSigmaM1028-100ML
MethanolFisher ChemicalA412giftig
Milli-Q WasseraufbereitungssystemMillipore Corporation
NickelsulfatSigma656895-50G
PaclitaxelSigmaT1912-5MG
PIPESSigmaP-6757
Pluronic F108-NTAzur Verfügung gestellt von Jennifer Neff und AllVivo VascularPEG-PPG-PEG-NTA
Pluronic  F-108Sigma542342-250GPEG-PPG-PEG
Thermo Scientific Schnappkappe Mikrozentrifugenröhrchen mit niedriger RetentionFisher Scientific21-403-190
ToluolFisher ChemicalT324Toxisches
Tubulin, HiLyte647-markiertesZytoskelett, Inc.TL670M
UV Ozon ProcleanerBioForce NanosciencesPC440
Whatman  Puradisc SpritzenvorsatzfilterSigmaWHA67840402
Zyla 4.2 sCMOS KameraAndor TechnologysCMOS 4.2

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vale, R. D., Reese, T. S., Sheetz, M. P. Identification of a Novel Force-Generating Protein, Kinesin, Involved in Microtubule-Based Motility. Cell. 42, 39-50 (1985).
  2. Ray, S., Meyhofer, E., Milligan, R. A., Howard, J. Kinesin Follows the Microtubule's Protofilament Axis. Journal of Cell Biology. 121, 1083-1093 (1993).
  3. Dennis, J. R., Howard, J., Vogel, V. Molecular shuttles: directed motion of microtubules along nanoscale kinesin tracks. Nanotechnology. 10, 232-236 (1999).
  4. Kawamura, R., Kakugo, A., Osada, Y., Gong, J. P. Microtubule bundle formation driven by ATP: the effect of concentrations of kinesin, streptavidin and microtubules. Nanotechnology. 21, 145603(2010).
  5. Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. Kinesin-1 Expressed in Insect Cells Improves Microtubule in Vitro Gliding Performance, Long-Term Stability and Guiding Efficiency in Nanostructures. IEEE Transactions on Nanobioscience. 15, 62-69 (2016).
  6. Whitesides, G. M., Grzybowski, B. Self-assembly at all scales. Science. 295, 2418-2421 (2002).
  7. Ringler, P., Schulz, G. E. Self-assembly of proteins into designed networks. Science. 302, 106-109 (2003).
  8. Boncheva, M., et al. Magnetic self-assembly of three-dimensional surfaces from planar sheets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 3924-3929 (2005).
  9. England, J. L. Dissipative adaptation in driven self-assembly. Nature Nanotechnology. 10, 919(2015).
  10. Fialkowski, M., et al. Principles and Implementations of Dissipative (Dynamic) Self-Assembly. The Journal of Physical Chemistry B. 110, 2482-2496 (2006).
  11. Boncheva, M., Whitesides, G. M. Self-healing systems having a design stimulated by the vertebrate spine. Angewandte Chemie-International Edition. 42, 2644-2647 (2003).
  12. Rubenstein, M., Cornejo, A., Nagpal, R. Programmable self-assembly in a thousand-robot swarm. Science. 345, 795-799 (2014).
  13. Plaisted, T. A., Vakil Amirkhizi, A., Arbelaez, D., Nemat-Nasser, S. C., Nemat-Nasser, S. Self-healing structural composites with electromagnetic functionality. Proceedings of the Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers. 5054, 372-381 (2003).
  14. Ghosh, S. K. Self-Healing Materials. Ghosh, S. K. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Weinheim. 1-28 (2009).
  15. Burnworth, M., et al. Optically healable supramolecular polymers. Nature. 472, (2011).
  16. Bachand, G. D., Spoerke, E. D., Stevens, M. J. Microtubule-Based Nanomaterials: Exploiting Nature's Dynamic Biopolymers. Biotechnology and Bioengineering. 112, 1065-1073 (2015).
  17. Gao, Y. W., Lei, F. M. Small scale effects on the mechanical behaviors of protein microtubules based on the nonlocal elasticity theory. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387, 467-471 (2009).
  18. Lam, A. T. -C., Tsitkov, S., Zhang, Y., Hess, H. Reversibly Bound Kinesin-1 Motor Proteins Propelling Microtubules Demonstrate Dynamic Recruitment of Active Building Blocks. Nano Letters. 18, 1530-1534 (2018).
  19. Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules. Methods in Cell Biology. 39, 137-147 (1993).
  20. Huppertz, T., Fox, P. F., Kelly, A. L. Proteins in Food Processing (Second Edition). Yada, R. Y. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 49-92 (2018).
  21. Wettermark, G., Borglund, E., Brolin, S. E. A regenerating system for studies of phosphoryl transfer from ATP. Analytical Biochemistry. 22, 211-218 (1968).
  22. Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination. Journal of Cell Biology. 107, 1011-1024 (1988).
  23. Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -H., Vogel, V. Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices. Nanotechnology. 15, S540-S548 (2004).
  24. Rogers, K. R., et al. KIF1D is a fast non-processive kinesin that demonstrates novel K-loop-dependent mechanochemistry. EMBO Journal. 20, 5101-5113 (2001).
  25. Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 73, 2782-2790 (1997).

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Kinesin betriebene molekulare Shuttlesreversible Kinesin AnheftungMikrotubuli GleitassayTotalreflexionsfluoreszenzmikroskopieUV Ozon BehandlungZusammenbau der DurchflusszelleMikrotubuli PolymerisationGFP Kinesin ImagingHerstellung der Motilit tsl sungSilanisierung von Deckgl sern

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