Hefe als Chassis für die Entwicklung von funktionellen Assays zur Untersuchung von Human P53

Paola Monti; Bartolomeo Bosco; Sara Gomes; Lucilia Saraiva; Gilberto Fronza; Alberto Inga

doi:10.3791/59071

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Methodenartikel

Hefe als Chassis für die Entwicklung von funktionellen Assays zur Untersuchung von Human P53

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DOI:

10.3791/59071

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4. August 2019

Paola Monti¹ , Bartolomeo Bosco² , Sara Gomes³ , Lucilia Saraiva^*³ , Gilberto Fronza^*¹ , Alberto Inga^*²

¹Mutagenesis and Cancer Prevention Unit, Ospedale Policlinico San Martino, ²Department CIBIO, University of Trento, ³LAQV/REQUIMTE, Laboratory of Microbiology, Faculty of Pharmacy, University of Porto

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Präsentiert werden vier Protokolle zum Konstruieren und Ausnutzen von Hefe Saccharomyces cerevisiae Reporterstämmen, um menschliche P53-Transaktivierungspotenziale, Auswirkungen seiner verschiedenen krebsassoziierten Mutationen, ko-exprimierte interagierende Proteine und die Auswirkungen bestimmter kleiner Moleküle.

Zusammenfassung

Die Feststellung, dass das bekannte Säugetier-P53-Protein als Transkriptionsfaktor (TF) in der Hefe S. cerevisiae fungieren kann, hat die Entwicklung verschiedener funktioneller Assays ermöglicht, um die Auswirkungen von 1) Bindungsstellen zu untersuchen [d.h. Das Ansprechelement (RE)] Sequenzvarianten auf P53-Transaktivierungsspezifität oder 2) TP53-Mutationen, koexprimierte Kofaktoren oder kleine Moleküle bei P53-Transaktivierungsaktivität. Es wurden verschiedene Basis- und translationale Forschungsanwendungen entwickelt. Experimentell nutzen diese Ansätze zwei wesentliche Vorteile des Hefemodells aus. Einerseits ermöglicht die einfache Genombearbeitung den schnellen Aufbau qualitativer oder quantitativer Reportersysteme, indem isogene Stämme genutzt werden, die sich nur auf der Ebene eines spezifischen P53-RE unterscheiden, um die sequenzionizifizium abhängige P53-abhängige Transaktivierung. Andererseits ermöglicht die Verfügbarkeit regulierter Systeme für die ektopische P53-Expression die Auswertung der Transaktivierung in einer Vielzahl von Proteinexpressionen. Bewertet in diesem Bericht sind ausgiebig verwendete Systeme, die auf Farbreporter-Gene, Luziferase und das Wachstum von Hefe basieren, um ihre wichtigsten methodischen Schritte zu veranschaulichen und ihre Vorhersagekraft kritisch zu bewerten. Darüber hinaus kann die extreme Vielseitigkeit dieser Ansätze leicht genutzt werden, um verschiedene TFs zu untersuchen, einschließlich P63 und P73, die andere Mitglieder der TP53-Genfamilie sind.

Einleitung

Die Transkription ist ein äußerst komplexer Prozess, bei dem die dynamische, räumliche und zeitliche Organisation von Transkriptionsfaktoren (TFs) und Kofaktoren für die Rekrutierung und Modulation von RNA-Polymerasen in Chromatinregionen als Reaktion auf spezifische Reize¹. Die meisten TFs, einschließlich des menschlichen P53-Tumorsuppressors, erkennen bestimmte cis-wirkende Elemente in Form von DNA-Sequenzen, sogenannten Response-Elementen (REs), die aus einzelnen (oder mehreren) einzigartigen Motiven bestehen, die 6-10 Nukleotide lang sind. Innerhalb dieser Motive können einzelne Positionen verschiedene Variabilitätsgrade^2....