Alveolären Makrophagen Phagozytose und Bakterien-Clearance bei Mäusen

Zusammenfassung

Hier berichten wir über gemeinsame Methoden für die Analyse der phagocytic Funktion der murinen alveolären Makrophagen und bakterielle Freiraum aus der Lunge. Diese Methoden studieren in-vitro-Phagozytose von Fluorescein Herstellung Perlen und in-vivo Phagozytose von Pseudomonas Aeruginosa Green Fluorescent Protein. Wir beschreiben auch eine Methode für das clearing von p. Aeruginosa bei Mäusen.

Zusammenfassung

Alveoläre Makrophagen (AMs) bewachen den alveolären Raum der Lunge. Phagozytose durch AMs spielt eine entscheidende Rolle bei der Verteidigung gegen eindringende Krankheitserreger, die Entfernung von abgestorbenen Zellen oder Fremdkörper, und bei der Lösung von Entzündungsreaktionen und Umbau-Gewebe verarbeitet, die durch verschiedene Oberflächen-Rezeptoren vermittelt werden Das AMs. Hier berichten wir über Methoden zur Analyse der phagocytic Funktion des AMs mit in-vitro- und in-vivo-Tests und experimentelle Strategien um zu unterscheiden, die Muster-Anerkennung-Rezeptor - Komplement-Rezeptor- und Fc-Gamma-Rezeptor-vermittelten Phagozytose. Schließlich diskutieren wir eine Methode zu etablieren und zu charakterisieren ein p. Aeruginosa Lungenentzündung Modell bei Mäusen zu in-vivo bakterielle Abstand beurteilen. Diese Tests sind die am häufigsten verwendeten Methoden, AM Funktionen zu bewerten und können auch zur Funktion der Makrophagen und bakterielle Spiel in andere Organe zu studieren.

Einleitung

AMs sind die wichtigsten Residenten Fresszellen in die Alveolen in der Ruhephase und einer der Hauptakteure der angeborenen Immunantwort durch die Anerkennung und Internalisierung der eingeatmete Krankheitserreger und Fremdkörper^1,2. Es wurde berichtet, dass AMs unerlässlich für die schnelle Abfertigung von vielen pulmonale Krankheitserreger wie p. Aeruginosa und Klebsiella Pneumonie^3,4, sind also ein Mangel an AM Phagozytose oft in die Atemwege führt Infektionen, wie z. B. akute Lungenentzündung, die höhere Mortalität und Morbidität ....

Protokoll

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Eastern Virginia Medical School.

(1) fluoreszierenden Perlen Phagozytose

1. Die Maus einschläfern (C57BL/6J, 6 Wochen alt, weiblich) durch CO₂ ersticken nach IACUC Protokolle für die ethische Euthanasie von Tieren.
2. Legen Sie die Maus Belly-up auf eine Dissektion Board mit Küchenpapier bedeckt. Festzunageln Sie seine Pfoten mit seinen Gliedmaßen Spread-Eagle und Haken Sie eine Zeichenfolge unter seine Vorderzähne, seinen Kopf zurück, so dass die Luftröhre gerade ausgerichtet ist und Niveau.
3. Nass, Keh....

Ergebnisse

Zuerst führten wir das Experiment zu analysieren, Phagozytose per Mausklick primäre AMs. Während alle Analysen verglichen wir AMs von WT und TRIM72^KO Mäusen isoliert. Wie in Abbildung 1Adargestellt, offenbart Fluoreszenz-Mikroskopie die Phagozytose von FITC-Glasperlen von Maus primären AMs tritt nach 1 h Inkubation. Abbildung 1 B zeigt die Auswertung der Phagozytose durch Durchflusszyt.......

Diskussion

Während der Durchführung einer Gas-Austausch-Funktion, konfrontiert die Lunge anhaltend Fremdkörper, Krankheitserreger und Allergene. AMs bieten die erste Linie der Verteidigung aufgrund ihrer wichtigsten Funktion, nämlich Phagozytose. AMs auch mit anderen Immunzellen in der Krankheitserreger zu zerstören und die Auflösung der Entzündung zu koordinieren. Hier beschrieben wir Methoden zur Bewertung der speziell Phagozytose durch AMs isoliert von der Maus-Lunge. Das Protokoll präsentiert in diesem Manuskript erklärt, eine .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
18-G-Nadel	Nipro Medical	CI+1832-2C	Molekularbiologie Klasse
2,7-Diaminofluoren (DAF)	Sigma-Aldrich	D17106	Molekularbiologie Klasse
70% Ethanol	Decon Labs Inc.	18C27B
96-Well-Platte	Corning	3603
ACK-Lysepuffer	Life Technologies	A10492	Molekularbiologie
Alexa Fluor-488 Zymosan-A-Biopartikel	Thermofisher Scientific	Z23373	Molekularbiologie Klasse
C5 mangelhaftes Serum	Sigma-Aldrich	C1163	Biochemische Reagenzienzentrifuge
	Labnet International	C0160-R
Cytospin 4 Zytozentrifuge	Thermofisher Scientific	A78300101 Ausgabe 11
DMEM Zellkulturmedien	Gibco	11995-065	Zellbiologie
FBS	Atlanta Biologicals	S11550	Zellbiologie
Qualität Durchfluss Zytometer	BD Biosciences	FACSCalibur
Flow Jo Software	FlowJo, LLC
Pinzette	Dumont	0508-SS/45-PS-1	Geeignet für die Dissektion von Labortieren
FITC-carboxylierte Latexkügelchen	Sigma-Aldrich	L4530	Zellbiologie
Qualität GFP-P. aeruginosa	ATCC	101045GFP	Geeignet für  Assays für Zellinfektionen
Glasbodenschale	MatTek Corp.	P35G-0.170-14-C	in Zellbiologiequalität
	Penn-Century	FMJ-250	Geeignet für den Einsatz bei Labortieren
Homogenisator	Omni International	TH-01
Wasserstoffperoxid	Sigma-Aldrich	H1009
Inverses Fluoreszenzmikroskop	Olympus	IX73
Ketamin Hydrochlorid	Hospira	CA-2904
Shandon Kwik-Diff Flecken	Thermofisher Scientific	9990700	Zellbiologie Qualität
LB Agar	Fisher	Scientific BP1425	Molekularbiologie
Qualität LB Bouillon	Fisher Scientific	BP1427
Molekularbiologie Qualität MicroSprayer Aerosolizer	Penn-Century	IA-1C	Geeignet für den Einsatz bei Labortieren
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148	Reagenzqualität
PBS	Gibco	20012-027	Kaninchen in Zellbiologiequalität
Anti-SRBC-IgG	MP Biomedicals	55806	Geeignet für Immunoassays
Kaninchen Anti-SRBC-IgM	Cedarline Laboratories	CL9000-M	Geeignet für Immunoassays
Schere	Miltex	5-2	Geeignet für die Dissektion
Labortieren Laryngoskop für Kleintiere	Penn-Century	LS-2	Geeignet für den Einsatz bei Labortieren
Natriumdodecylsulfat (SDS)	BioRad	1610301	Federschere in analytischer Qualität
(Med)	Feinwissenschaftliche Werkzeuge	15012-12	Geeignet für das Sezieren
Labortieren Federschere (klein)	Fine Science Tools	91500-09	Geeignet für das Sezieren
roten Blutkörperchen (SRBCs) von Schafen im Labortier	MP Biomedicals	55876	Gewaschene, konservierte SRBCs
Harnstoff	Sigma-Aldrich	U5378	Xylazin in molekularbiologischer Qualität
	Akorn Animal Health	59399-110-20	Pharmazeutische Qualität

in analytischer Qualität in Zellbiologiequalität Hochdruckspritze in analytischer Qualität von von von