Methodenartikel

Manipulation der Genfunktion in mexikanischen Cavefish

DOI:

10.3791/59093

⸱

22. April 2019

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1Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University, 2Jupiter Life Science Initiative, Florida Atlantic University, 3Harriet L. Wilkes Honors College, Florida Atlantic University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir beschreiben Ansätze für die Manipulation von Genen im evolutionären Modellsystem Astyanax Mexicanus. Drei verschiedene Techniken beschrieben: Tol2-vermittelte Transgenese, gezielte Manipulation des Genoms mit CRISPR/Cas9 und Zuschlag des Ausdrucks mit Morpholinos. Diese Tools sollten die direkte Untersuchung von Genen zugrunde liegen die Unterschiede zwischen Oberfläche und höhlenbewohnenden Formen erleichtern.

Zusammenfassung

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Höhle Tiere liefern ein überzeugendes System zur Erforschung der Evolutionsmechanismen und genetischen Grundlagen zugrunde liegenden Veränderungen in zahlreichen komplexen Eigenschaften, einschließlich Auge Degeneration, Albinismus, Schlafmangel, Hyperphagie und sensorischen Verarbeitung. Arten von Cavefish aus der ganzen Welt zeigen eine konvergente Entwicklung der morphologischen und verhaltensbezogene Merkmale aufgrund gemeinsamer Umweltbelastungen zwischen verschiedenen Höhlensysteme. Diverse Höhle Arten wurden in der Laborumgebung untersucht. Die mexikanische Tetra, Astyanax Mexicanus, mit sehenden und blinden Formen, einzigartige Einblicke in biologischen und molekularen Prozesse, die die Entwicklung von komplexen Eigenschaften zugrunde liegen und wird gut balanciert, als eine aufstrebende Modellsystem. Während Kandidatengene reguliert die Entwicklung der vielfältigen biologischen Prozessen in A. Mexicanus identifiziert wurden, wurde die Möglichkeit zur Validierung für einzelne Gene einer Rolle beschränkt. Die Anwendung der Transgenese und Bearbeitung von Gen-Technologie hat das Potenzial, diese erhebliche Behinderung zu überwinden und die Mechanismen der Evolution komplexe Merkmale zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine andere Methode zur Bearbeitung von Genexpression in A. Mexicanus. Ansätze umfassen die Verwendung von Morpholinos, Tol2 Transgenese und gen-editing-Systeme, häufig verwendete im Zebrafisch und andere Fische Modelle Genfunktion in A. Mexicanuszu manipulieren. Diese Protokolle enthalten detaillierte Beschreibungen der zeitgesteuerten Zucht Verfahren, die Sammlung von befruchteten Eiern, Injektionen und die Auswahl von gentechnisch veränderten Tieren. Diese methodische Ansätze ermöglicht die Untersuchung der genetischen und neuronalen Mechanismen der Evolution der vielfältigen Eigenschaften in A. Mexicanus.

Einleitung

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Seit Darwins Origin of Species1haben Wissenschaftler gewonnen tiefe Einblicke in wie Züge als Reaktion auf definierte Umwelt- und ökologischen Druck dank Höhle Organismen2evolutionär geprägt sind. Die mexikanische Tetra, A. Mexicanus, besteht aus Augen Vorfahren "Oberfläche" Populationen, die bewohnen Flüsse in ganz Mexiko und Süd-Texas und mindestens 29 geografisch isolierten Populationen von abgeleiteten Höhle Morphs bewohnen die Sierra del Abra und andere Bereiche des nordöstlichen Mexiko3. In A. Mexicanus, einschließlich der veränderten Sauerstoffverbrauch, Depigmentierung, Verlust der Augen und veränderte Ernährung und Nahrungssuche Verhalten4,5,6wurde eine Reihe von Höhle-assoziierten Eigenschaften ermittelt, 7,8,9. A. Mexicanus präsentiert ein leistungsfähiges Modell für die Untersuchung von Mechanismen der konvergente Entwicklung durch eine klar definierte Evolutionsgeschichte, eine detaillierte Charakterisierung der ökologischen Umwelt und das Vorhandensein von unabhängig Höhle entwickelt Bevölkerung10,11. Viele der Höhle-abgeleitete Merkmale, die in Cavefish, einschließlich Auge Verlust vorliegen, schlafen Verlust, erhöht, Fütterung, Verlust des Schulens, Aggression, reduziert und verringert Stressreaktionen, entstanden mehrere Male durch unabhängige Ursprünge, oft unter Verwendung verschiedenen genetischen Wege zwischen Höhlen8,12,13,14,15. Dies wiederholt Evolution ist ein starker Aspekt des A. Mexicanus Systems und bieten Einblick in die allgemeinere Frage wie genetische Systeme gestört werden kann, um ähnliche Phänotypen zu generieren.

Während die Anwendung der Gentechnik für die mechanistische Untersuchung der Genfunktion in vielen Fischarten (einschließlich A. Mexicanus) begrenzt worden, bilden die jüngsten Fortschritte in der Zebrabärbling eine Grundlage für genetische Technologieentwicklung in Fisch 16,17,18,19,20. Zahlreiche Werkzeuge sind weit verbreitet im Zebrafisch, um Genexpression zu manipulieren, und die Durchführung dieser Verfahren lange standardisiert wurden. Z. B. die Injektion von Morpholino Oligos (MOs) im Einzel-Zell-Stadium selektiv RNA blockiert und verhindert Übersetzung für einen kurzen zeitlichen Fenster während Entwicklung21,22. Darüber hinaus bearbeiten von gen Ansätze, wie z. B. regelmäßig gruppierten dazwischen kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) / CRISPR-assoziierten Protein 9 (Cas9) und Transkription Aktivator-ähnliche Effektor Nuklease (TALEN), ermöglichen die Erzeugung von definierten Löschungen oder, in einigen Fällen Einfügungen durch Rekombination in Genome19,20,23,24. Transgenese wird verwendet, um stabile Genexpression oder Funktion in einem Zelltyp spezifische Weise zu manipulieren. Das Tol2 System wird effektiv verwendet, um transgene Tiere zu erzeugen, indem coinjecting Transposase mRNA mit einem Tol2 DNA Plasmid enthält ein Transgen25,26. Das Tol2 -System nutzt die Tol2 Transposase von Medaka, stabile Keimbahn Einfügungen von transgenen construct17 zu generieren. Generierung von Tol2 transgene beinhaltet ein Plasmid enthält ein Transgen, flankiert von Tol2 Integration Websites und mRNA für Tol2 Transposase17coinjecting. Dieses System wurde verwendet, um ein Array von transgenen Linien im Zebrafisch generieren und seine Verwendung hat vor kurzem erweitert, um zusätzliche emergent Modellsysteme, einschließlich Cichliden, Killifische, der Stichling und, in jüngerer Zeit, die mexikanische Cavefish27, 28,29,30.

Während die Cavefish eine faszinierende biologische System für erhellendes Mechanismen der Eigenschaft Evolution, hat seine volle Fähigkeit als ein evolutionäres Modell nicht voll genutzt. Dies wurde teilweise aufgrund einer Unfähigkeit, genetische Manipulation und zelluläre Funktion direkt31. Kandidaten-Gene regulieren komplexe Merkmale mit quantitative Trait Loci (QTL) Studien identifiziert worden, aber die Validierung dieser Kandidatengene wurde schwer32,33,34. Vor kurzem, transiente Zuschlag mit Morpholinos, Bearbeitung mit CRISPR und TALEN Systemen und die Verwendung von Tol2gen-vermittelten Transgenese wurden verwendet, um die genetische Basis zugrunde liegt eine Reihe von Eigenschaften35,36, 37untersuchen ,38. Die Implementierung und Standardisierung dieser Techniken erlaubt für Manipulationen, die molekularen und neuronalen Grundlagen biologischer Merkmale, einschließlich der Manipulation der Genfunktion, die Kennzeichnung der definierten Zellpopulationen zu verhören und der Ausdruck des funktionalen Reporter. Während die erfolgreiche Umsetzung dieser genetischen Werkzeuge zu manipulieren-gen oder zelluläre Funktion bei emergent Modellsysteme nachgewiesen wurde, fehlen detaillierte Protokolle noch in A. Mexicanus.

A. Mexicanus kritischen Einblick in die Mechanismen der Evolution als Reaktion auf ein verändertes Umfeld und präsentieren die Möglichkeit, neuartige Gene regulieren vielfältige Merkmale zu identifizieren. Eine Reihe von Faktoren legen nahe, dass A. Mexicanus ein äußerst gefügig Modell ist für die Anwendung von etablierten genomische derzeit verfügbaren Tools in etablierten genetischen Modellen, einschließlich der Möglichkeit, Fisch in den Labors Brut Größe einfach zu pflegen, Transparenz, eine sequenzierte Genom und definierten Verhaltensstörungen Assays39. Hier beschreiben wir eine Methodik für die Nutzung der Morpholinos, Transgenese und gen bearbeiten in Oberfläche und Höhle Populationen von A. Mexicanus. Die breitere Anwendung dieser Werkzeuge in A. Mexicanus ermöglicht eine mechanistische Untersuchung der molekularen Prozesse zugrunde liegen die Entwicklung von Entwicklungsstörungen, physiologischen und verhaltensbezogenen Unterschiede zwischen Cavefish und Oberfläche Fischen.

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Protokoll

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1. Morpholino Oligo design

Hinweis: Sequenzen für A. Mexicanus sind durch National Center of Biotechnology Information (NCBI) gen und NCBI SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov), sowie aus dem Ensembl Genome Browser (https://www.ensembl.org) erhältlich. Wenn Sie eine Morpholino für den Einsatz in beiden Oberfläche und höhlenbewohnenden Formen zu entwerfen, ist es wichtig, identifizieren genetische Abweichungen zwischen dem Morphs in diesem Stadium, so dass diese genetische Regionen als Ziele für Morpholinos vermieden werden können. Polymorphe Abweichungen innerhalb einer Zielwebsite Morpholino kann unwirksam Bindung führen. Das Design ist ähnlich wie bei anderen Fisch-Systemen, wie Zebrafisch, und hat bisher gezeigt, dass effektiv arbeiten in A. Mexicanus21,36,40.

  1. Gestaltung der Übersetzung-blocking morpholinos
    Hinweis: Übersetzung-blocking Morpholinos Übersetzung durch die Bindung an die endogenen Startsite zu blockieren und behindern translationale Maschinen aus die mRNA-Sequenz durch sterische Behinderung verbindlich.
    1. Identifizieren der kodierenden Region des Zielgens beginnend mit dem ATG-Startseite.
    2. Notieren Sie die ersten 25 Basenpaare der Zielsequenz durch Kopieren und Einfügen der Sequenzablaufs in einem Text-Editor oder Lab Notebook.
    3. Mit online-Software (z. B. http://reverse-complement.com) oder manuelle Übersetzung, erzeugen Sie die umgekehrte Ergänzung der Zielsequenz. Die daraus resultierende umgekehrte Ergänzung in einem Text-Editor oder Lab Notebook zu retten.
    4. Bestellen Sie ein Morpholino mit der umgekehrte Ergänzung Abfolge von einer Firma, die Morpholino Oligonucleotides generiert. Siehe Tabelle der Materialien für Unternehmen.
  2. Gestaltung der Spleiß-blocking morpholinos
    Hinweis: Splice-blocking Morpholinos Spleißen zu blockieren und somit verhindern die Bildung eines Reife mRNA-Moleküls. Dies bietet eine alternative Methode für Zuschlag bei die Start-Seiten nicht gut definiert sind, oder ein optimaler Ansatz bei der Validierung der Zuschlag über Polymerase-Kettenreaktion (PCR) gewünscht wird. Dieser Vorteil der Spleiß-blocking Morpholinos (über ATG-blocking MOs) ist dieser Exon-Ausschluss oder Intron-Aufnahme leicht mit Reverse Transkriptase (RT) beurteilt werden kann-PCR und Größe Unterschiede visualisiert auf einem Gel. RT-PCR und Gel-Elektrophorese festzustellen Morpholino Wirksamkeit sollte getan werden mit standard-Labor-Verfahren.
    1. Die Pre-mRNA-Sequenz des Zielgens zu identifizieren. Nutzen Sie die verfügbaren Informationen aus dem A. Mexicanus Genom über NCBI oder Ensembl Intron-Exon-Grenzen-33zu bestimmen.
    2. Exon-Intron (Spleiß Spender) oder Intron-Exon Grenze (Spleiß-Akzeptor) Websites für Intron Aufnahme oder Exon Ausgrenzung als Ziel.
      Hinweis: Die Spliceosome richtet sich normalerweise eine "GU"-Sequenz (U1 Ziel) das Intron in die 5' Splice-Site und eine " "AG "" Sequenz am 3' (U2) intronischen Spleiß Zielstandort. Unter normalen Bedingungen binden Spliceosome U1 und U2 Untereinheiten dieser Ziel-Sites auf der Pre-mRNA-Sequenz für das ordnungsgemäße Spleißen auftreten. Wenn entweder diese Zielsequenzen wird durch eine Morpholino blockiert, wird jedoch die Spliceosome zur nächsten verfügbaren U1 oder U2 Website, verursacht ein Intron Ausgrenzung oder Exon in der mRNA-Sequenz verschoben auf. Dazu gehört die Planung/Optimierung, abhängig von der Art der Ziel-gen21. In der Regel leitet blockiert eine interne U1-Site den Spleiß zum nächsten verfügbaren U1 Einsatzort, verursacht eine Exon-Exzision. Blockierung der ersten oder letzten Spleiß-Kreuzung verursacht alternativ eine Intron-Aufnahme denn es keine andere Website gibt umleiten den Spleiß zu. Verwenden Sie Sequenz Software, um die Auswirkungen der verschiedenen Ausschlüsse und Einschlüsse vorherzusagen. Vorhersagen können potentielle Frameshifts oder vorzeitige Stopp Codons, Angabe einer effektiveren Zielwebsite für mRNA Störung hinweisen.
    3. Sobald der Ziel-Site erkannt wird, zeichnen Sie seine Sequenz in einem Text-Editor oder Lab-Buch. Sicherstellen Sie, dass die Ziel-Site 25 Basenpaare (bp) lang ist.
    4. Mit online-Software (z. B. http://reverse-complement.com) oder manuelle Übersetzung, erzeugen Sie die umgekehrte Ergänzung der Zielsequenz. Notieren Sie die Sequenz in einem Text-Editor oder Lab-Buch.
    5. Bestellen Sie ein Morpholino mit der umgekehrte Ergänzung Abfolge von einer Firma, die Morpholino Oligonucleotides generiert. Probe-Unternehmen finden Sie unter Tabelle der Materialien .

2. Morpholinos Injektionslösung

Hinweis: Mehrere Konzentrationen oder Mengen von MO Injektion müssen durchgeführt werden, um die optimale Konzentration zu injizieren zu etablieren. Typische Injektionen Mengen sind 400 – 800 Pg von MO. Die Wirkung der Morpholino Knockdown kann für bis zu 6 Tage Steroidtherapie bestehen.

  1. Erhalten Sie das Lager Morpholino. Das Lager Morpholino kommt lyophilisiert. Hydrat es mit sterilen H2O vor der Verwendung bei der gewünschten Lager Konzentration (z.B. 4 mM). Bei-20 °C bis zur Verwendung aufbewahren.

(3) CRISPR gRNA Design, in-vitro-Transkription und Vorbereitung

  1. CRISPR gRNA design
    Hinweis: gRNAs wurden mit zuvor veröffentlichten Forschungsergebnisse von Varshney Et Al.40 und Wierson Et Al.41erzeugt.
    1. Mit einem Genom-Browser identifizieren der kodierenden Region des Gens von Interesse. Mit Hilfe der genomischen Sequenz erkennen gRNA Zielsequenz innerhalb einer Exon bei der Suche nach einer 20 bp Nukleotid Ziel Sequenzierung beginnend mit GG und gefolgt von einer PAM-Sequenz (NGG). Eine Region des Gens nach Beginn (ATG) betroffen sein werden.
      Hinweis: Wenn eine Zielsequenz mit GG am 5'-Ende in der gewünschten Exon des Gens, eine oder beide der G'gefunden werden kann kann s für den ersten und zweiten Nukleotiden am 5'-Ende der Sequenz ersetzt werden. Jedoch die zwei G's muss in die Oligo integriert werden, wie dies für T7 Transkription erforderlich sind.
    2. Gestalten und bestellen eine Gen-spezifischen Oligonukleotids (Oligo A: 5'-TAATACGACTCACTATAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3 "). Fügen Sie die Gen-spezifischen 20 bp gRNA Zielsequenz (Fett) ohne die PAM-Sequenz zwischen einem T7 Promotorsequenz (rot) und eine Überlappung Sequenz verwendet, um zu einem zweiten Oligonukleotid (blau) Tempern. Tempern und verstärken (siehe Punkt 3.2.1) dieser Oligo A und einem zweiten Oligo (Oligo B: 5'-GATCCGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTT-AACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3 "), die gRNA Vorlage für Transkription zu generieren.
      Hinweis: Oligo B gilt für jede Reaktion und müssen nur 1 X bestellt werden.
  2. gRNA Vorbereitung und Transkription
    1. Tempern Sie und verstärken Sie die Oligos. Umfassen die folgenden Primer um die gRNA zu verstärken, um die Ausbeute zu erhöhen: 5'-TAATACGACTCACTATA-3 "(T7 Primer) und 5'-GATCCGCACCGACTCGGTG-3" (3' gRNA Primer). Führen Sie eine PCR mit Thermococcus Kodakaraensis (KOD) Polymerase.
      Hinweis: Für beide Grundierungen in Oligo A und B Oligo empfiehlt 10 Zyklen für einen guten Ertrag. Ein detailliertes Protokoll finden Sie in Wierson Et Al.41.
    2. Die gRNA mit im Handel erhältlichen in-vitro-Transkription-Kits (siehe Tabelle der Materialien) zu transkribieren. Dies geschieht durch Modifikationen an den Hersteller's-Protokoll von Klaassen Et Al.42veröffentlicht.
    3. Niederschlag, waschen und die gRNA aufzuwirbeln, wie von Klaassen Et Al.42beschrieben.
      Hinweis: Die gRNA muss in RNase-freies Wasser, Abbau zu verhindern Nukleinsäuretablette.
    4. Notieren Sie die Konzentration der gRNA, die mit einem Spektralphotometer ermittelt werden können. Beurteilen Sie die Qualität der RNA von 2 µL auf ein Agarosegel laufen. Aliquoten RNA zu vermeiden Frost/Tau-wechseln und bei-80 °C bis unmittelbar vor die Injektionen lagern.
  3. Cas9 Vorbereitung und Transkription
    1. Cas9 mRNA transkribiert werden kann mit handelsüblichen in vitro Transkription-Kits (siehe Tabelle der Materialien) bereits43beschrieben. Verwenden Sie die Nls-Cas9-Nls Version43.
    2. Erfassen Sie die Konzentration der gRNA und bewerten Sie die Qualität von 2 µL auf ein Agarosegel laufen. Aliquoten RNA Zersetzung zu vermeiden, die entsteht durch mehrere Gefrier-Tau-Zyklen und die Speicherung der Aliquote bei-80 °C.

4. Vorbereitung der Tol2 Konstrukte, Tol2 Transposase und Transgenese

  1. Bereiten Sie Tol2 Transgene Konstrukte für die Injektion.
    Hinweis: Wir haben erfolgreich veröffentlicht/verfügbaren Zebrafisch genutzt und Medaka Konstrukte in A. Mexicanus. Diese Konstrukte sind voll funktionsfähig in A. Mexicanus, wahrscheinlich wegen der hohen Sequenzhomologie (beziehen sich auf das AddGene-Repository und das Zebrafish Informationsnetz [ZFIN] Datenbanken für zur Verfügung Konstrukte). Der Zebrafisch-Promotorfragmente äußerten sich die transgene in den erwarteten Geweben bei Verwendung in A. Mexicanus.
    1. Tol2 Konstrukte zu erwerben oder Plasmid mit gewebespezifischen Promoter, die gewünschte Transgen und Tol2 Waffen (siehe Kwan Et Al.44) zu generieren. Nach Erhalt Sequenz das Konstrukt um das Plasmid zu überprüfen.
    2. Führen Sie eine Midiprep für Konstrukte nach Angaben des Herstellers's-Richtlinien. Eluieren das endgültige Plasmid in RNase-freie H2O, bestimmen die Konzentration mit einem Spektrophotometer, verdünnen Sie die Konzentration auf 100–300 ng /μL, und aliquoten und laden die Konstrukte bei-20 °C.
  2. Tol2 Transposase Plasmid zu verdauen, und mRNA zu synthetisieren.
    1. Bestellen Sie ein Exemplar des Tol2 Transposase Plasmids (pCS-zT2TP) als Vorlage für die Erzeugung von Tol2 mRNA45.
    2. Midiprep pCS-zT2TP konstruieren nach Angaben des Herstellers's-Richtlinien. Eluieren Sie es in einem geringen Volumen von RNase-freies Wasser oder Puffer (~ 50 μL). Speichern der Aliquote bei-20 °C.
    3. Verdauen Sie das Tol2 Plasmid mit einem Restriktionsenzym.
      1. Führen Sie eine Beschränkungsauswahl auf 10 µg kreisförmige pCS-zT2TP-Plasmids mit Tabelle 1.
      2. Die Reaktion in 2–50 μL Reaktionen aufgeteilt und inkubieren Sie die Reaktionen über Nacht bei 37 °C in einem Thermocycler.
      3. Am Folgetag inaktivieren Sie das Enzym durch Erhitzen auf 65 °C für 20 Minuten.
      4. Linearisierte Plasmid unmittelbar nach der Digest, mit handelsüblichen PCR Reinigung-Kits (siehe Tabelle der Materialien) Richtlinien der Hersteller' zu reinigen. Eluieren Sie das Plasmid in 15 μl RNase-freie H2O und bestimmen Sie die Konzentration des Produkts mit einem Spektralphotometer.
      5. Führen Sie 1 μL der verdauten Plasmid und 1 μL der ungeschnittenen Plasmid auf eine 1,5 % Agarose-gel linearisierten Plasmid zu bestätigen.
    4. Durchführen einer in-vitro-Transkription der mRNA Tol2.
      1. Nutzen Sie 1 µg Plasmid linearisierten pCS-zT2TP als Vorlage für die Transkription. Folgen Sie den Hersteller's Richtlinien für in-vitro-Transkription (siehe Tabelle der Materialien), wie in Tabelle 2beschrieben.
      2. Inkubation bei 37 °C in einem Thermocycler pro Hersteller's-Richtlinien.
      3. Fügen Sie 1 µL DNase, bei 37 °C in einem Thermocycler pro Hersteller'brüten s Richtlinien.
      4. Führen Sie Lithium-Chlorid Niederschlag pro Transcription Kit Protokoll. Aufschwemmen der RNA Pellet in ~ 20–30 μl RNase-freie H2O.
      5. Bestimmen Sie die Konzentration des Produkts mit einem Spektrophotometer und zeichnen Sie die RNA-Qualität auf.
      6. Verdünnen Sie das Produkt auf ~ 100–300 ng/µL und aliquoten es in 5–10 μL Proben, wiederholte Frost-Tau-Wechseln zu vermeiden. Bis zur Verwendung bei-80 °C lagern.
        Hinweis: Es ist möglich, 1–2 µL der gereinigten Tol2 mRNA für Abstrich/Band mit Gelelektrophorese.

5. Mikroinjektionen

  1. Vorbereitung der allgemeinen Werkzeuge für Injektionen
    Hinweis: Die Verfahren in diesem Abschnitt sind von Kowalko Et Al.46ausführlich beschrieben worden, und eine Übersicht mit geringfügigen Änderungen wird hier vorgestellt.
    1. Generieren Sie Injektion Platten durch strömenden warmen 3 % Agarose in Fischwasser System in eine 100 mL Petrischale aufgelöst. Legen Sie vorsichtig ein Ei Spritzgießwerkzeug in die frisch gezapftes Agarose, Brunnen für die Fische, Eier zu machen. Legen Sie die Seite der Form im Agar in einem Winkel von 45° und dann senken Sie langsam in die Agarose; langsam senken die Form schräg vermeidet Luft immer unterhalb der Formwerkzeugs gefangen. Entfernen Sie den Schimmel vorsichtig, sobald die Agarose verfestigt wird. Die Platten sind speicherbar, versiegelt, bei 4 °C für bis zu 1 Woche.
    2. Ziehen Sie Nadeln aus Borosilikatglas Kapillaren zur Injektion in einer Elektrode/Nadel-Puller laut Hersteller's-Richtlinien. Dieses Protokoll wird pro Pipette Puller variieren; jedoch finden Sie in Tabelle 3ein Beispielprogramm Nadel ziehen.
      Hinweis: Optimierung der Nadelöhrs ist wichtig für Injektionen, wie Nadeln, die zu lang sind beugen werden, anstatt sauber in das Ei eindringen.
    3. Machen Sie große Bohrung Glaspipetten für die Ei-Übertragung von standard Glaspipetten zu brechen, so dass die Öffnung groß genug für die Eier ist. Mit dem Bunsenbrenner, polnische gebrochene Ende des Glases durch Ende des gebrochenen Pipetten zur Flamme aussetzen, bis es glatt ist.
  2. Zucht-setup
    Hinweis: Es gibt viele verschiedene Protokolle, die für die Zucht von A. Mexicanusverwendet. Für ein detailliertes Protokoll siehe Borowsky39. Starten Sie das Setup Zucht 1 Woche vor den Injektionen.
    1. Am 1. Tag legen Sie zwei bis drei Weibchen und drei bis vier Männer in einem einzigen 10-Gallonen-Tank auf 24 ± 1 °c gehalten
    2. Am Tag 1–7, erhöhen Sie die Verfütterung an ~ 3 x täglich. Stellen Sie sicher, dass die Diät enthält Lebendfutter, wie schwarze Würmer und Artemia.
    3. Am 6. Tag fügen Sie ein einzelnes Tankheizung setzen auf 27 °C. Lab Tank Temperaturen variieren können; Daher wird dies eine Steigerung von 2–3 °C gegenüber der normalen Speichertemperatur sein.
    4. Am Abend von Tag 7, die am Abend (Zeitgeber [ZT] 9–11) Injektion Nacht ist, gründlich reinigen Sie die Tanks mit Wasser getränkten Schwamm und entfernen Sie alle überschüssige Lebensmittel oder Schmutz mit einem feinmaschigen Netz oder einen Siphon.
    5. In der Nacht vom 7. Tag beginnen Oberfläche Fischeier im ZT15 gesucht und weiter alle 15–30 min bis ZT18 zu überprüfen. Für Cavefish beginnen, Eier zu ZT17 gesucht und weiterhin alle 15–30 min bis ZT20 zu überprüfen.
      Hinweis: Die Zeiten basieren auf einem 14:10 h hell: Dunkel-Zyklus mit Zeitgeber Zeit. Zucht-Zeiten sind Schätzungen und einzelnen Labors müssen die genauen Zeiten bestimmen. Es ist wichtig, um Eier zu sammeln, kurz nachdem sie befruchtet um sie im Einzel-Zell-Stadium zu injizieren, freigegeben sind.
  3. Sammlung von Einzel-Zell-Stadium Eier
    1. Untersuchen Sie die Nacht in der Zucht erwartet wird, die Tanks alle 15–30 min und Monitor für Eier an der Unterseite des Tanks. Eier erscheinen transparent, ca. 1 mm im Durchmesser messen.
    2. Verwenden Sie ein feinmaschiges Fischnetz Eier sammeln und übertragen Sie sie auf eine Glasschüssel mit Frischfisch System Wasser gefüllt. Untersuchen Sie die Eier unter dem Mikroskop zu bestätigen, dass die Eier im 1-Zell-Stadium sind.
    3. Mit Glaspipetten, einzellige Eier auf die Injektion-Platten übertragen. Glaspipetten sind in diesem Stadium erforderlich, da die Eier zu Kunststoff bleiben werden.
    4. Mit einer Pipette, lösen Sie vorsichtig die Eier in die Vertiefungen der Agarose-Injektion-Platte von Abschnitt 5.1. Füllen Sie die Zeilen der vorgewärmte (bei Raumtemperatur) Injektion Platte mit der maximalen Anzahl von Eiern (–30 40 pro Zeile und bis zu fünf Zeilen). Ganze Zeilen helfen die Eier vor dem Verschieben während der Injektionen. Halten Sie die Eier bis zur Erfüllung der Injektionen auf der Injektion-Platte mit einer kleinen Menge Fisch System Wasser hydratisiert.
  4. Pico-Injektion Setup und allgemeine Injektion Optimierung Richtlinien
    1. Abgleich der Injektionsnadeln mit entweder Gel-laden-Pipette Tipps, passen in die Kapillare oder mit standard Mikropipette Tipps und am Ende einen 2–4 µL Bolus hinzufügen. Sobald die Nadel gefüllt ist, verwenden Sie Zange, schneiden Sie die überschüssige Länge aus der Injektionsnadel.
    2. Führen Sie durch Mikroinjektionen mit Hilfe einer Nadel in einem Mikromanipulator, verbunden mit einem Picoliter Microinjector montiert.
    3. Legen Sie die Einspritzzeit zu 0,03 s und der Druck, bei ~0.0 Psi. Der Einspritzdruck variiert entsprechend mit geringen Unterschieden zwischen den Nadeln so zu optimieren um eine ~1.0-nL-Injektion-Bolus zu erreichen.
      Hinweis: Der Einspritzdruck ist oft im Bereich von ~ 10–30 Psi.
    4. Standardisieren Sie die Injektion Bolus durch Einspritzen in Mineralöl und Messung des Bolus Größe 1,5 nL Injektionsvolumen mit einer Folie Mikrometer, ~ 1–zu erreichen. Passen Sie den Einspritzdruck (Psi) erhöhen oder verringern die Bolus-Lautstärke an.
    5. Wasser aus der ganz oben in die Eier mit einem Labor-Gewebe zu ziehen.
      Hinweis: Die Astyanax Ei Chorion ist etwas härter als Zebrafisch-Eier einzudringen. Wir finden, dass das Wasser aus der oben in die Eier hilft Nadel Eindringen in die Eizelle erleichtern. ~ 200 Eier auf einer einzigen Platte ermöglichen Platte Optimierung.
    6. Mithilfe der Mikromanipulator durchdringen jedes Ei mit der Nadel und Spritzen direkt in das Eigelb. Sobald im Eigelb positioniert, injizieren Sie das Ei durch das Spritzen Taste oder Injektion Fußpedal drücken.
      Hinweis: Ein voller Teller kann innerhalb von ca. 15 min injiziert werden. Die Einzel-Zell-Stadium dauert ~ 40 min.
  5. Injektion von morpholinos
    Hinweis: Die Höhe der Morpholino für Zuschlag ohne Toxizität pro gen Ziel optimiert werden müssen; eine Konzentration von 400 Pg ist jedoch ein guter Ort zum starten.
    1. Bereiten Sie Morpholino, so dass 400 Pg Morpholino pro Ei injiziert wird. Morpholino auf Eis auftauen. Die Injektionslösung besteht aus Morpholino (bei der gewünschten Konzentration), RNase-freie H2O oder Danieau's Lösung und Phenol Red (10 % des letzten Bandes). Ein Beispiel finden Sie in Tabelle 4.
    2. Spritzen 1 nL pro Embryo.
  6. CRISPR-Injektionen
    1. Bereiten Sie RNA, so dass 25 Pg gRNA und 300 Pg Cas9 mRNA insgesamt pro Embryo injiziert werden. Für eine Probe CRISPR/Cas9 Injektierungsgemisches siehe Tabelle 5.
    2. 2 Spritzen nL gRNA/Cas9 mRNA pro Embryo direkt in den Embryo.
  7. Injektion von Tol2 Transposase und Tol2 flankiert Plasmid für transgenesis
    1. Tauen Sie Transposase mRNA und Tol2 Plasmid auf Eis. Mähdrescher Cas9 mRNA (bei 25 ng/µL), gewünschte Tol2 Konstrukt (bei 25 ng /μL), und Phenol-rot (≤10 % der das Endvolumen) in RNase-freies Wasser. Für eine Probe Tol2 Transgenese Injektion Mischung siehe Tabelle 6.
    2. Halten Sie die Injektionslösung und Nadeln auf dem Eis, den Abbau der mRNA zu vermeiden. Spritzen 1 nL in Volumen pro Embryo.

(6) Aufzucht und screening injiziert Fisch

  1. Eingespritzte Fische Haltung
    1. Nachdem die Eizellen injiziert werden, sofort zu Glasschalen (10 x 5 cm) gefüllt mit ~ 200 mL Fischwasser System übertragen. Eier sind leicht abgespült durch Eintauchen der Injektion Platten in Schalen mit Wasser und spülen die Eier mit einer Pipette zu fischen.
    2. Legen Sie ~ 50–80 injizierte Embryonen pro Schale und hinten sie bei 22–24 °C.
    3. Reinigen Sie die Schalen mit eingespritzten Fisch 2 X pro Tag zu entfernen tote Embryonen und ~ 20 % des Wassers auf einer täglichen Basis zu ändern.
    4. Weitere Aufzucht erfolgt in Übereinstimmung mit den zuvor veröffentlichten Protokolle39.
  2. Screening von Morpholino injiziert Individuen
    1. Visualisieren Sie die Tiere unter einem Stereomikroskop zum Bildschirm für Phänotypen. Die Wirkung der Morpholinos kann bis zu ~ 5 Tage postinjection21bestehen.
    2. Verhaltens Phänotypen auf 4 Tage Kontrollbesuche zu messen.
  3. Screening für CRISPR indels
    1. Design-Primer genomischen DNA um die Ziel-Site zu verstärken. Primer zu entwerfen, sodass das Zielprodukt PCR etwa 100–ist 125 bp.
      Hinweis: zum Beispiel für oca2 Locus, die Region rund um den Zielstandort gRNA wurde verstärkt mit der forward Primer 5'-CTCCTCTGTCAGGCTGTGC-3 "und die rückwärts-Primer 5'-GAAGGGGATGTTGTCTATGAGC-3" für eine PCR-Produkt-Länge von 105 bp.
    2. Embryonen zu Opfern oder fin Clip geschlechtsreifer Fische nach dem institutionellen Tier-Protokoll.
    3. Sammeln von Embryonen oder seziert flossen in PCR Tubes und DNA extrahieren und führen PCRs. Probe-PCR Protokolle für Gen-spezifische Primer in Ma Et Al.35gefunden werden können.
    4. Beurteilung für Mutagenese, laufen 5 führt ein PCR-Produkt als unterschiedliche Band µL des PCR-Produkts auf einem 3 % Agarosegel mit 70 V für 3 h (nonmutagenized) Wildtyp DNA. Mutierte DNA führt zu einer schmierig-Band auf das Gel.
    5. Um die Reihenfolge der mutierten Allele zu ermitteln, TA Klonen das PCR-Produkt laut Hersteller's Anweisungen, wählen Sie Kolonien und Miniprep Kulturen. Die daraus resultierende DNA Sequenzierung zu senden.
    6. Aufbau und pflegen Linien von Fischen, die Übertragung von mutierter Allelen, überqueren Sie Erwachsenen injizierten Fisch zur Wildtyp Fisch und Bildschirm 5–10 Embryonen um festzustellen, ob eines der Nachkommenschaft ein mutiertes Allel des Gens nach Schritte 6.3.1-6.3.6 tragen.
      Hinweis: Verschiedene F1 Personen aus der gleichen F0 Gründer Fisch können verschiedene Mutationen durchführen. Sicherstellen Sie, dass mutierte Linien sequenziert werden, um Mutationen um Allele zu produzieren, die aus dem Rahmen sind voraussichtlich zu erhalten.
    7. Identifizieren Sie Fische tragen ein mutiertes Allel durch PCR unter Verwendung der schmierige Band-Assay (Schritte 6.3.1-6.3.6) oder durch die Gestaltung Allel-spezifische PCR Zündkapseln, die Mutanten und Wildtyp Bands (Abbildung 2) verstärken werden.
    8. Sobald eine Linie von Fischen besteht, Homozygose mutierten Allele für rezessive Phänotypen zu testen.
  4. Screening für transgene positive Individuen
    Hinweis: Mit Konstrukte, die mit einem fluoreszierenden Hersteller wird empfohlen, das Screening für transgene positive Individuen zu optimieren. Standard-PCR screening-Verfahren kann jedoch verwendet werden zum Bildschirm für die Übertragung.
    1. Visualisieren Sie gewebespezifischen fluoreszierende Proteine in F0 Fisch so früh wie 2 Tage Steroidtherapie, mit einem Epifluoreszenz sezieren Umfang.
      Hinweis: Der Ausdruck in F0 Larven ist Mosaik und positive Menschen eine Reihe von Ausdruck Phänotypen haben können.
    2. Möglichst positive Individuen F0 Gründer Fisch.
    3. Wenn F0s erreichen Reife, Rückkreuzung Gründung Fisch nontransgenic Einzelpersonen abgeleitet aus dem gleichen bestand der Bevölkerung/Lab. Sieb F1 Nachkommen dasselbe Protokoll verwenden, wie unter Punkt 6.2 beschrieben.
      Hinweis: Der Ausdruck in F1 Larven ist einheitlich und gewährleistet die Konsistenz F1 Geschwister untereinander.
    4. Da Tol2 Integration nicht Website-vermittelten ist und Integration kann variieren zwischen den Gründern, wählen Sie F1 Geschwister abgeleitet einen einzelnen F0 Gründer und kreuzen positiv auszudrücken F1 Geschwister um F2s zu generieren. Diese Nachkommen werden die Grundlage für eine stabile Linie.

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Ergebnisse

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Mehrere Populationen von höhlenbewohnenden A. Mexicanus zeigen weniger Schlaf und Wachsein/Überaktivität im Verhältnis zu ihrer Oberfläche lebende Artgenossen14. Hypocretin/Orexin (HCRT) ist eine hoch konservierte Neuropeptid, die wirkt, um Wachsamkeit zu erhöhen, und Fehlentwicklungen im HCRT Weg führen Narkolepsie bei Menschen und anderen Säugetieren47,48. Wir haben bereits bewiesen, der Höhle A. Mexicanus gestiegen Aus...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier haben wir eine Methodik für die Manipulation der Genfunktion mit Morpholinos, CRISPR/Cas9 gen bearbeiten und Transgenese Methodik. Der Reichtum der Gentechnologie und der Optimierung dieser Systeme im Zebrafisch ermöglicht es wahrscheinlich für die Übertragung dieser Werkzeuge in A. Mexicanus mit Leichtigkeit52. Neueste Erkenntnisse haben diese Ansätze in A. Mexicanusverwendet, aber sie bleiben nicht ausgelastete bei der Untersuchung der vielfältigen morphologischen, Entwick...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken für ihre Unterstützung bei der Genotypisierung und imaging der oca2 mutierte Fische in Abbildung 2dargestellten Sunishka Thakur. Diese Arbeit wurde durch die National Science Foundation (NSF) 1656574, A.C.K, NSF Award 1754321, j.k. und A.C.K, und National Institute of Health (NIH) Award R21NS105071 A.C.K und E.R.D. unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Fischzucht & Eierbedarf
Feinmaschiges FischnetzPenn PlaxBN4
AquarienheizungAqueon100106108
EierfallenSonderanfertigungNAEntwerfen und erstellen Sie einen Kunststoffrost, der am Boden des Tanks platziert wird, um Eier zu schützen
GlaspipettenFisher Scientific13-678-20C
PipettenbirnenFisher Scientific03-448-21
AgaroseFisher ScientificBP160-500
EiformenAdaptive Science ToolsTU-1
Morpholino Zubehör
Control MorpholinoGene Tools, LLCStandardkontrolle olio
Custom MorpholinoGene Tools, LLCNA
Phenol RedSigma AldrichP0290-100ML
CRISPR supplies
Cas9 PlasmidAddGene46757
GoTaq DNA-PolymerasePromegaM3001
KOD Hot Start TaqEMD Millipore71-842-3
PrimerIntegrated DNA TechnologiesCustom
T7 Megascript KitAmbion/ThermofisherAM1333
miRNeasy KitQiagen217004
mMessage mMachine T3 KitAmbion/ThermofisherAM1348
MinElute KitQiagen28204
Tol2-Transgenese liefert
pCS-zT2TP PlasmidKawakami et al., 2004Anfrage des leitenden Autors
CutSmart BufferNew England BiolabsB7204
NotI-HF RestriktionsenzymNew England BiolabsR3189
PCR-AufreinigungskitQiagen28104
SP6 mMessenger KitAmbion/ThermofisherAM1340
Mikroinjektionszubehör
Glas KapillarröhrchenSutter InstrumentsBF100-58-10
PipettenabzieherSutter InstrumentsP-97
PicoinjektorWarner InstrumentsPLI-100A
MikromanipulatorWorld Precision InstrumentsM3301R
Mikromanipulator StänderWorld Precision InstrumentsM10
Mikrofonmanipulator SockelWorld Precision InstrumentsStahlplattenfuß, 10 lbs

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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