Fluoreszierende Visualisierung von Mango-markierter RNA in Polyacrylamidgelen über eine Poststaining-Methode

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir eine empfindliche, schnelle und diskriminierende Post-Gel-Färbungsmethode, um RNAs mit RNA Mango Aptamern I, II, III oder IV abzubilden, wobei entweder native oder denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)-Gelverwendet werden. Nach dem Ausführen von Standard-PAGE-Gelen kann Mango-markierte RNA leicht mit TO1-Biotin gefärbt und dann mit allgemein verfügbaren Fluoreszenzlesern analysiert werden.

Zusammenfassung

Native und denaturierende Polyacrylamid-Gele werden routinemäßig verwendet, um die komplexe Mobilität von Ribonukleoprotein (RNP) zu charakterisieren bzw. die RNA-Größe zu messen. Da viele Gel-Imaging-Verfahren unspezifische Flecken oder teure Fluorophorsonden verwenden, sind empfindliche, diskriminierende und wirtschaftliche Gel-Imaging-Methoden sehr wünschenswert. RNA Mango-Kernsequenzen sind kleine (19–22 nt) Sequenzmotive, die, wenn sie durch einen beliebigen RNA-Stamm geschlossen werden, einfach und kostengünstig an eine RNA von Interesse angehängt werden können. Diese Mango-Tags binden mit hoher Affinität und Spezifität an einen Thiazol-orange Fluorophor-Ligand namens TO1-Biotin, der bei Bindung tausendfach fluoreszierender wird. Hier zeigen wir, dass Mango I, II, III und IV verwendet werden können, um RNA gezielt in Gelen mit hoher Empfindlichkeit abzubilden. Nur 62,5 Fmol RNA in nativen Gelen und 125 Fmol RNA in denaturierenden Gelen können durch Einweichen von Gelen in einem bildgebenden Puffer mit Kalium und 20 nM TO1-Biotin für 30 min nachgewiesen werden. Wir demonstrieren die Spezifität des Mango-markierten Systems, indem wir eine Mit mango-markierte 6S-Bakterien-RNA im Kontext einer komplexen Mischung aus gesamtbakterieller RNA abbilden.

Einleitung

Mango ist ein RNA-Tagging-System, bestehend aus einem Satz von vier kleinen fluoreszierenden RNA-Aptamern, die fest (Nanomolarbindung) an einfache Derivate der Thiazol-Orange (TO1-Biotin, Abbildung 1A)^{1,2,3 binden} . Bei der Bindung wird die Fluoreszenz dieses Liganden je nach spezifischem Aptamer um das 1.000- bis 4.000-fache erhöht. Die hohe Helligkeit des Mango-Systems, das für Mango III die des verbesserten grünen Fluoreszenzproteins (eGFP) in Kombination mit der nanomolaren Bindungsaffinität der RNA Mango-Aptamer übertrifft, ermöglicht es, so....

Protokoll

1. Herstellung der Reagenzien

1. TO1-Biotin Nachflecklösung (Gelfärbelösung)
   1. 1 L 1 M Phosphatpuffer bei pH 7,2 bei 25 °C durch Zugabe von 342 ml von 1 M Na₂HPO₄ und 158 ml von 1 M NaH₂PO₄machen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2 bei 50 mM ein, indem Sie die entsprechende Phosphatlösung hinzufügen. Sterilfilter mit einem 0,2-mm-Filter und lagern Sie die Lösung in Kunststoffen bei Raumtemperatur.
   2. 5x Gelfärbelösung (ohne TO1-Biotin) wie folgt vorbereiten. Bilden Sie eine 1 L-Lösung durch Mischen von 247,5 ml ddH₂O, 700 ml von 1 M KCl, 50 ml 1 M Phosphatpuffer (pH 7,2) und 2....

Ergebnisse

Kurze Mit Mango-Tags versehene RNAs wurden wie im Protokollabschnitt beschrieben vorbereitet. Unter der Annahme, dass die Fluoreszenz bei den Denaturierungsbedingungen aufgrund des Vorhandenseins von Harnstoff in den Gelen am schwierigsten zu beobachten wäre, untersuchten wir zunächst die Resistenz der Mango-Aptamer gegen Harnstoff, der als Nukleinsäure-Denaturierungwirkt wirkt. Wir fanden heraus, dass Mango-Aptamer im Wesentlichen resistent gegen Denaturierung bis zu einer Harnstoffkonze.......

Diskussion

Ein wesentlicher Vorteil des Mango-Fluoreszenz-Tags ist, dass ein einzelnes Tag auf verschiedene Arten verwendet werden kann. Die hohe Helligkeit und Affinität dieser Aptamer machen sie nicht nur für die Zellvisualisierung 2, sondern auch für die In-vitro-RNA- oder RNP-Reinigung⁴nützlich. Daher erweitert die Gel-Bildgebung die Vielseitigkeit des Mango-Tags auf einfache Weise. Die Empfindlichkeit der Mango-Gel-Bildgebung ist etwas geringer als die eines nördlichen Blots

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,8 mm dicker Kamm mit 14 Vertiefungen für 30 mL PAGE-Gele	LabRepCo	11956042
101-1000 & micro; L  Tipps	Fisher	02-707-511
20-200 µ L geringe Retention  tips	Fisher Scientific	02-717-143
Acrylamid:N,N'-Methylenbisacrylamid (40% 19:1)	Bioreagenzien	BP1406-1	Akute Toxizität
Acrylamid:N,N'-Methylenbisacrylamid (40% 29:1)	Fisher	BP1408-1	Akute Toxizität
	Agaranachämie	02116-380
DC-Platte mit Aluminiumrücken	Sigma-Aldrich
Amersham Imager 600	GE Healthcare Lifesciences	29083461
Ammoniumpersulfat	Biorad	161-0700	Schädliche
BL21-Zellen	NEB	C2527H
Borsäure	ACP	B-2940
Bromphenol Blue	Natriumsalz Sigma	B8026-25G
Chloloform	ACP	C3300
Dithiothreitol	Sigma Aldrich Alkohole	D0632-5G
DNase I	ThermoFisher	EN0525
EDTA Dinatriumsalz	ACP	E-4320
Ethanol	Commerial
Flat Gel Ladespitzen	Costar	CS004854
Formamide 99%	Alfa Aesar A11076
Gel-Geräteset mit Abstandshaltern und Kämmen	LabRepCo	41077017
Glasschale mit Kunststoffdeckel	Pyrex	1122963	Sollte groß genug sein, um Ihr Gelstück aufzunehmen
Glycerin	Anachämie	43567-540
HCl	Anachämie	464140468
ImageQuanTL	GE Healthcare Lifesciences	29000605
IPTG	Invitrogen	15529-019
KCl	ACP	P-2940
MgCl2	Caledron	4903-01
MgSO4	Sigma-Aldrich	M3409
NaCl	ACP	S-2830
NaOH	BDH	BDH9292
Orbitalrotator	Lab-Line
Phenol	Invitrogen	15513-039
Rundes Gel Ladespitzen	Costar	CS004853
Natriumphosphat zweibasisch	Caledron	8120-1
Natriumphosphat monobasisch	Caledron	8180-01
SYBRGold	ThermoFisher	S11494
T7 RNA-Polymerase	ABM	E041
TEMED	Sigma-Aldrich	T7024-50 ml
TO1-3PEG-Biotin Fluorophor	ABM	G955
Tris Base	Fisher	BP152-500
Trypton	Fisher	BP1421-500
Tween-20	Sigma	P9496-100
Harnstoff	Fisher	U15-3
Xylol Cyanol	Sigma	X4126-10G
Hefeextrakt	Bioshop	YEX401.500

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