Methodenartikel

Fluoreszierende Visualisierung von Mango-markierter RNA in Polyacrylamidgelen über eine Poststaining-Methode

DOI:

10.3791/59112

⸱

21. Juni 2019

 ,  , 
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, Simon Fraser University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier präsentieren wir eine empfindliche, schnelle und diskriminierende Post-Gel-Färbungsmethode, um RNAs mit RNA Mango Aptamern I, II, III oder IV abzubilden, wobei entweder native oder denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)-Gelverwendet werden. Nach dem Ausführen von Standard-PAGE-Gelen kann Mango-markierte RNA leicht mit TO1-Biotin gefärbt und dann mit allgemein verfügbaren Fluoreszenzlesern analysiert werden.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Native und denaturierende Polyacrylamid-Gele werden routinemäßig verwendet, um die komplexe Mobilität von Ribonukleoprotein (RNP) zu charakterisieren bzw. die RNA-Größe zu messen. Da viele Gel-Imaging-Verfahren unspezifische Flecken oder teure Fluorophorsonden verwenden, sind empfindliche, diskriminierende und wirtschaftliche Gel-Imaging-Methoden sehr wünschenswert. RNA Mango-Kernsequenzen sind kleine (19–22 nt) Sequenzmotive, die, wenn sie durch einen beliebigen RNA-Stamm geschlossen werden, einfach und kostengünstig an eine RNA von Interesse angehängt werden können. Diese Mango-Tags binden mit hoher Affinität und Spezifität an einen Thiazol-orange Fluorophor-Ligand namens TO1-Biotin, der bei Bindung tausendfach fluoreszierender wird. Hier zeigen wir, dass Mango I, II, III und IV verwendet werden können, um RNA gezielt in Gelen mit hoher Empfindlichkeit abzubilden. Nur 62,5 Fmol RNA in nativen Gelen und 125 Fmol RNA in denaturierenden Gelen können durch Einweichen von Gelen in einem bildgebenden Puffer mit Kalium und 20 nM TO1-Biotin für 30 min nachgewiesen werden. Wir demonstrieren die Spezifität des Mango-markierten Systems, indem wir eine Mit mango-markierte 6S-Bakterien-RNA im Kontext einer komplexen Mischung aus gesamtbakterieller RNA abbilden.

Einleitung

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Mango ist ein RNA-Tagging-System, bestehend aus einem Satz von vier kleinen fluoreszierenden RNA-Aptamern, die fest (Nanomolarbindung) an einfache Derivate der Thiazol-Orange (TO1-Biotin, Abbildung 1A)1,2,3 binden . Bei der Bindung wird die Fluoreszenz dieses Liganden je nach spezifischem Aptamer um das 1.000- bis 4.000-fache erhöht. Die hohe Helligkeit des Mango-Systems, das für Mango III die des verbesserten grünen Fluoreszenzproteins (eGFP) in Kombination mit der nanomolaren Bindungsaffinität der RNA Mango-Aptamer übertrifft, ermöglicht es, sowohl bei der Bildgebung als auch bei der Reinigung von RNA eingesetzt zu werden. Komplexe2,4.

Die Röntgenstrukturen von Mango I5, II6und III7 wurden zu hoher Auflösung bestimmt, und alle drei Aptamer verwenden ein RNA-Quadruplex, um TO1-Biotin zu binden (Abbildung 1B–D). Die kompakten Kerne aller drei Aptamer werden über kompakte Adaptermotive aus der externen RNA-Sequenz isoliert. Mango I und II verwenden beide einen flexiblen GNRA-ähnlichen Schleifenadapter, um ihre Mango-Kerne mit einem beliebigen RNA-Duplex zu verbinden (Abbildung 1B, C). Im Gegensatz dazu verwendet Mango III ein starres Triplex-Motiv, um seinen Kern mit einer beliebigen RNA-Helix zu verbinden (Abbildung1D,violette Rückstände), während die Struktur von Mango IV derzeit nicht bekannt ist. Da der Ligandenbindungskern jedes dieser Aptamer durch diese Spiraladapter von der externen RNA-Sequenz getrennt ist, scheint es wahrscheinlich, dass sie alle einfach in eine Vielzahl von RNAs integriert werden können. Die bakterielle 6S-konforme RNA (Mango I), Komponenten des Hefespliceooms (Mango I) und der humanen 5S-RNA, U6-RNA und einerC/D-ScaRNA (Mango II und IV) wurden alle erfolgreich auf diese Weise 2,8getaggt, was darauf hindeutet, dass viele biologische RNAs können mit dem RNA Mango Aptamer System markiert werden.

Denaturing und native Gele werden häufig verwendet, um RNAs zu studieren. Denaturing Gels werden häufig verwendet, um die RNA-Größe oder DIE RNA-Verarbeitung zu beurteilen, aber typischerweise erfordern im Falle eines nördlichen Blots beispielsweise mehrere langsame und sequenzielle Schritte, um ein Bild zu erzeugen. Während andere fluorogene RNA-Aptamer wie RNA Spinat und Brokkoli erfolgreich für die Gelbildgebung9eingesetzt wurden, besitzt bisher kein fluorogenes Aptamersystem die hohe Helligkeit und Affinität des Mango-Systems, was es von erheblichem Interesse macht. um die Gel-Imaging-Fähigkeiten von Mango zu untersuchen. In dieser Studie fragten wir uns, ob das RNA-Mango-System einfach auf die Gel-Bildgebung ausgedehnt werden könnte, da die Anregungs- und Emissionswellenlängen von TO1-Biotin (510 nm bzw. 535 nm) für die Bildgebung im eGFP-Kanal geeignet sind, der den meisten fluoreszierenden Gel-Scanning-Instrumentierung.

Das hier vorgestellte Post-Gel-Färbeprotokoll bietet eine schnelle Möglichkeit, Mango-markierte RNA-Moleküle in nativen und denaturing Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese-Gelen (PAGE) gezielt zu detektieren. Bei dieser Färbemethode werden Gele in einem Kalium- und TO1-Biotinpuffer einweichen. RNA Mango Aptamer sind G-Quadruplex-basiert und Kalium wird benötigt, um solche Strukturen zu stabilisieren. Mithilfe von RNA, die aus minimalen Mango-kodierenden DNA-Vorlagen transkribiert wurde (siehe Protokollabschnitt), können wir einfach nur 62,5 Fmol RNA in nativen Gelen und 125 Fmol RNA in denaturierenden Gelen erkennen, indem wir ein einfaches Färbeprotokoll verwenden. Im Gegensatz zu häufigen unspezifischen Nukleinsäureflecken (siehe Tabelle der Materialien, die von nun an auf SG verwiesen werden) können wir Mango-markierte RNA auch dann eindeutig identifizieren, wenn hohe Konzentrationen der gesamten nicht markierten RNA in der Probe vorhanden sind.

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Protokoll

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1. Herstellung der Reagenzien

  1. TO1-Biotin Nachflecklösung (Gelfärbelösung)
    1. 1 L 1 M Phosphatpuffer bei pH 7,2 bei 25 °C durch Zugabe von 342 ml von 1 M Na2HPO4 und 158 ml von 1 M NaH2PO4machen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2 bei 50 mM ein, indem Sie die entsprechende Phosphatlösung hinzufügen. Sterilfilter mit einem 0,2-mm-Filter und lagern Sie die Lösung in Kunststoffen bei Raumtemperatur.
    2. 5x Gelfärbelösung (ohne TO1-Biotin) wie folgt vorbereiten. Bilden Sie eine 1 L-Lösung durch Mischen von 247,5 ml ddH2O, 700 ml von 1 M KCl, 50 ml 1 M Phosphatpuffer (pH 7,2) und 2,5 ml Tween 20. Sterilfilter mit einem 0,2-mm-Filter und lagern Sie die Lösung in Kunststoff. Es kann bei Raumtemperatur gelagert werden.
      HINWEIS: MgCl2 kann bei Bedarf zu dieser Lösung hinzugefügt werden, da es POTENZIELL RNA-Komplexe stabilisieren kann. Dies wird einen bescheidenen Einfluss auf das Fluoreszenzsignal2haben.
    3. Erstellen Sie eine 1x Gel-Färbungslösung mit der 5x Gel-Färbungslösung aus Schritt 1.1.2 und ergänzen Sie sie unmittelbar vor der Anwendung mit TO1-Biotin-Fluorophor (siehe Materialtabelle)auf eine Endkonzentration von 20 nM. Zum Beispiel 20 ml 5x Gel-Färbungslösung zu 80 ml entionisiertem Wasser hinzufügen, um 100 ml 1x 1x Gel-Färbungslösung herzustellen, und fügen Sie 2 l eines 1 mM TO1-Biotin-Bestands (in Dimethylformamid zubereitet) hinzu.
      ANMERKUNG: Der Aussterbekoeffizient für den TO1-Biotinfarbstoff bei 500 nm beträgt 63.000 M-1cm-1, gemessen in Färbelösung1.
  2. Denaturing PAGE (2x Denaturierende Gelladelösung und Lösungen A, B, C, Ammoniumpersulfat und Tetramethylethylendiamin)
    1. 50 ml 2x Denaturierende Gelladelösung durch Mischen von 40 ml Formamid, 0,5 ml 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, pH 8,0) und 9,5 ml ddH2O vorbereiten. Die Lösung kann bei Raumtemperatur gelagert werden. Ladefarbstoffe werden dieser Lösung nicht hinzugefügt, da sie die fluoreszierende Bildgebung verschleiern kann.
    2. Bereiten Sie 2x denaturierende Gel-Ladefarbe wie folgt vor. Bei der Reinigung von RNA- und DNA-Oligonukleotiden 0,5 ml von 2,5% (w/v) Bromphenolblau (BB) und 0,5 ml 2,5% (w/v) Xyanol (XC) in die in Schritt 1.2.1 beschriebene Lösung geben und 8,5 ml ddH2O statt 9,5 ml hinzufügen. Die Lösung kann bei Raumtemperatur gelagert werden.
    3. 100 ml Lösung A vorbereiten, indem man 200,2 g Harnstoff (Formelgewicht: 60,06 g/mol) auswägt und zu 312,5 ml 40% 19:1 Acrylamid:N,N'-Methylenbisacrylamid hinzufügt. Rühren Sie es mit einem magnetischen Rührstab mit maximaler Geschwindigkeit, bis gelöst (ca. 3 h) und bilden Sie die Lösung auf 500 ml mit ddH2O. Beachten Sie, dass die Endkonzentrationen 6.667 M Harnstoff und 25% 19:1 Acrylamid:N,N'-Methylenbisacrylamid sind. Bei 4 °C in sauberer Kunststoffaufbewahrung aufbewahren.
    4. 1 L Lösung B vorbereiten, indem Sie 400,4 g Harnstoff auswiegen und die Lösung auf 1 L mit ddH2O bilden; rühren, bis sich der Harnstoff aufgelöst hat. Lösung B kann bei Raumtemperatur aufbewahrt werden.
    5. Bereiten Sie Lösung C (10x Tris-borate-EDTA [TBE]) wie folgt vor. Bereiten Sie 4 L 10x TBE vor, indem Sie 432 g Tris-Basis und 220 g Borsäure auswiegen, 160 ml 0,5 M EDTA mit einem pH-Wert von 8 (gefiltert) hinzufügen und die Lösung auf 4 L mit ddH2O aufstellen. Ein großer Vorrat dieses Puffers wird hergestellt, da er auch als Gellaufpuffer verwendet wird.
    6. 10% Ammoniumpersulfat (APS) vorbereiten, indem 1 g APS in ein Gesamtvolumen von 10 ml ddH2O. bei 4 °C auflösen.
    7. Halten Sie Tetramethylethylendiamin (TEMED) griffbereit. Lagern Sie es bei 4 °C zusammen mit der APS-Lösung.
  3. Native PAGE (2x native Gel-Ladelösung)
    1. Bereiten Sie 50 ml 2x native Gel-Ladelösung vor, indem Sie 25 ml 100% Glycerin, 10 ml 5x Gel-Färbungslösung und 15 ml ddH2O mischen, um die Lösung auf 50 ml zu bilden.
      HINWEIS: Wie im Denaturierungs-Gel-Bereich können diesem Bestand Ladefarbstoffe hinzugefügt werden, deren Zugabe jedoch potenziell das fluoreszierende Signal im Gel verdecken kann und daher vermieden werden sollte.

2. Vorbereitung und Beladung von denaturierenden Gelen

  1. Bereiten Sie ein denaturierendes Gel mit einem angemessenen Prozentsatz vor, indem Sie Tabelle 1folgen. Betrachten Sie das spezifische Gelgusssystem; 30 ml Gele werden häufig verwendet. Der entsprechende Gelprozentsatz kann mit Tabelle 2geschätzt werden: Wählen Sie den Polyacrylamid-Prozentsatz aus, in dem die BB- und XC-Farbstoffe schneller und langsamer als die RNA von Interesse sind, um eine Hochbandtrennung in der entsprechenden Größe zu gewährleisten. bandbreite.
  2. Mischen Sie die Lösungen A, B und C gemäß Tabelle 1 und fügen Sie APS und TEMED unmittelbar vor dem Gießen des Gels hinzu. Mischen Sie die Lösungen gut in sauberen Kunststoffen.
  3. Gießen Sie die Gellösung in ein geeignetes Gelgießgerät, nachdem Sie sichergestellt haben, dass alle Komponenten sorgfältig sauber sind. Heben Sie eine Seite des Geräts so an, dass das Gel beim Gießen leicht geneigt ist, um zu vermeiden, dass Luftblasen im Gel selbst gefangen werden.
  4. Legen Sie den gewünschten Kamm ein und lassen Sie ihn polymerisieren (ca. 30 min). Beobachten Sie die Polymerisation, indem Sie genau nach einer Änderung des Brechungsindexes um die Gelbrunnen suchen. Den Geltank mit 1x Lösung C (1x TBE) aufstellen und den Kamm vorsichtig entfernen. Mit einer Spritze die Brunnen unmittelbar vor der Probenbelastung aussaugen.
  5. Bereiten Sie denaturierende Proben wie folgt vor. Fügen Sie den RNA-Proben, die von Interesse sind, 2x Denaturierungs-Gel-Ladelösung hinzu, um die denaturierende Gel-Ladelösung 1x zu machen, und wärmedenaturieren Sie bei 95 °C für 5 min mit einem Thermocycler oder Wasserbad.
  6. Vor dem Beladen der Proben, kühlen Sie sie einige Minuten, bis sie kühl zum Anfassen sind. Laden Sie die Proben, indem Sie sie auf den Boden jedes Brunnens schichten, indem Sie Gel-Ladespitzen verwenden.
    HINWEIS: Rundspitzen können für Gele mit einer Dicke von 1 mm oder mehr verwendet werden; flache Spitzen für dünnere Gele verwenden.
  7. Führen Sie die denaturierenden Gele bei Raumtemperatur aus. Stellen Sie sicher, dass die Wattleistung ausreichend niedrig ist, damit die Glasplatten des Gelsystems nicht reißen.
    HINWEIS: In unserem Labor reichten dafür 28 W für 20 cm x 16 cm Platten aus.

3. Vorbereitung und Beladung von nativen Gelen

  1. Bereiten Sie ein natives Gel mit einem entsprechenden Prozentsatz vor, indem Sie auf Tabelle 3verweisen. Betrachten Sie das spezifische Gelgusssystem, aber denken Sie daran, dass 30 ml Gele häufig verwendet werden. Mischen Sie die Lösungen von 1x TBE, 40% 29:1 Acrylamid:N,N'-methylenbisacrylamid und Glycerin nach Tabelle 3, und fügen Sie APS und TEMED unmittelbar vor dem Gießen des Gels hinzu. Fahren Sie wie in den Schritten 2.3 und 2.4 beschrieben vor.
  2. Bereiten Sie native Proben vor, indem Sie den VON Interesse interessierten RNA-Proben eine 2x native Gel-Ladelösung hinzufügen, um die Lösung 1x herzustellen und sie 100 min lang bei Raumtemperatur inkubieren zu lassen, bevor sie das Gel ausführt, um eine vollständige RNA-Faltung zu gewährleisten.
  3. Führen Sie das native Gel in einem 4 °C-Kühlraum aus, um sicherzustellen, dass die Wattleistung ausreichend niedrig ist, um das Gel nicht zu erhitzen.
    HINWEIS: In unserem Labor reichten dafür 14 W für 20 cm x 16 cm Platten aus.

4. RNA-Vorbereitung durch Abfluss-T7-Transkription

HINWEIS: DNA-Sequenzen, die für die Abflusstranskription10 von RNA Mango-Konstrukten verwendet wurden, wurden kommerziell bestellt. Bei dieser Methode werden DNA-Oligonukleotide, die das umgekehrte Komplement (RC) sowohl der zu transkribierenden Sequenz als auch des T7-Promotors enthalten, zu einer T7-Promotor-Oberstrangsequenz hybridisiert und dann in vitro transkribiert. Unten wird für jedes Oligonukleotid der RC der Mango-Kernsequenz fett und der RC der T7-Promoterregion kursiv dargestellt. Rückstände in regulärer Schrift entsprechen ansonsten willkürlichen komplementären Spiralbereichen, die erforderlich sind, damit der Mangokern richtig gefaltet werden kann.

Mango I: GCA CGT ACT CTC CTC TCC GCA CCG TCC CTT CGT ACG TGC CTA TAG TGA GTC GTA TTA AAG
Mango II: GCA CGT ACT CTC CTC TTC CTC TCC TCT CCT CGT ACG TGC CTA TAG TGA GTC GTA TTA AAG
Mango III: GGC ACG TAC GAA TAT ACC ACA TAC CAA TCC TTC CTT CGT ACG TGC CTA TAG TGA GTC GTA TTA AAG
Mango IV: GCA CGT ACT CGC CTC ATC CTC ACC ACT CCC TCG GTA CGT GCC TAT AGT GAG TCG TAT TAA AG
T7 Top Strang: CTT TAA TAC GAC TCA CTA TAG G

  1. Präparative Gelreinigung von DNA-Oligonukleotiden
    1. Für eine DNA-Synthese im Maßstab 0,2 im Mol-Maßstab das degeschützte DNA-Oligonukleotid in 100 l ddH2O und 100 l 2x denaturing loading dye (ab Schritt 1.2.2) wieder aufsetzen. In diesem Fall wird die Einbeziehung von Gelladefarbstoffen in die Ladelösung bei der gleichen Konzentration wie in Schritt 1.2.2 bevorzugt.
    2. Reinigen Sie das DNA-Oligonukleotid mit einem 50 ml präparativen Schuppen-Denaturierungsgel des entsprechenden Polyacrylamid-Prozentsatzes; Verwenden Sie Tabelle 2, um den Gelprozentsatz auszuwählen. Verwenden Sie beispielsweise ein 8%-Gel für eine 50-nt-Sequenz. Idealerweise sollte Bromphenolblau schneller als das Oligonukleotid laufen, und Xylolcyanol sollte langsamer laufen.
      HINWEIS: In unserem Labor wurden solche Gele mit Guss-Spacern gegossen, die 1,5 mm dick waren, und einem Gel-Ladekamm mit Bohrungen, die 2–2,5 cm breit waren.
    3. Laden Sie 100 l der DNA-Oligonukleotid-Lösungen, die in Schritt 4.1.2 pro präparativem Gel hergestellt wurden, wie in den Schritten 2.4–2.7 beschrieben.
    4. Trocknen Sie die Außenseite des Gels vorsichtig, entfernen Sie die Glasplatten und bedecken Sie beide Seiten des Gels in Plastikfolie. Legen Sie es auf einen fluoreszierenden Bildschirm (Aluminium-gestützte Dünnschicht-Chromatographieplatten, die mit Fluorophor imprägniert sind, sind eine wirtschaftliche Lösung) und verwenden Sie eine kurzwellige UV-Handlampe, um die DNA-Bänder durch UV-Schatten zu visualisieren.
    5. Ein gestochen scharf definierter Schatten sollte beobachtet werden, wenn die DNA-Synthese von hoher Qualität ist. Markieren Sie die Bänder auf der Plastikfolie mit einem permanenten Marker.
      HINWEIS: Schützen Sie Haut und Augen vor UV-Licht und halten Sie die Exposition enden kurz, um eine Beschädigung der Nukleinsäureprobe zu vermeiden.
    6. Legen Sie das Gel auf eine saubere Glasplatte, schneiden Sie die markierten Bänder sorgfältig aus und legen Sie jedes Gelfragment in 400 l von 300 mM NaCl. Elute die DNA über Nacht, mit einem Rotator bei Raumtemperatur.
    7. Erholen Sie das Eluent in einem sauberen Zentrifugenrohr und fügen Sie 2,5 Äquivalente Ethanol hinzu, um die DNA auszufällen. Vortex gut und legen Sie das Rohr auf -20 °C für 30 min.
    8. Pellet die Probe in einer Tischzentrifuge bei 156.000 x g für 30 min bei 4 °C. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und setzen Sie das Pellet in ddH2O wieder auf. Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die DNA-Oligonukleotidkonzentration genau zu bestimmen. Bewahren Sie die Probe als 10-M-Lager für komfortschonend bei -20 °C auf.
  2. Ablaufzeittranskription und Gelreinigung von RNA-Proben
    1. 5x Nukleosidtriphosphat (NTP) Vorrat vorbereiten, indem sie flüssige NTP-Bestände aus einer Endkonzentration von 40 mM Guanosintriphosphat (GTP, 11.400 M-1cm-1), 25 mM Cytidintriphosphat (CTP, 7.600 M-1cm-1), 25 mM , mischen Adenosintriphosphat (ATP, 5.000 M-1cm-1) und 10 mM Uridintriphosphat (UTP, 10.000 M-1xcm -1); alle Aussterbekoeffizienten bei 260 nm.
      HINWEIS: Flüssige oder pulverförmige Vorräte können kommerziell bezogen werden. Wenn Sie Primärbestände aus Pulver zubereiten, stellen Sie den pH-Wert vorsichtig auf einen endgültigen pH-Wert von 7,9 an, indem Sie 1 M NaOH verwenden. Aliquot den Bestand in 1,5 ml Mikrozentrifugenrohren und lagern Sie ihn bei -20 °C.
    2. Bereiten Sie 100 ml 10x T7 Transkriptionspuffer vor, indem Sie 25,6 ml 1 M Tris-HCl, 14,4 ml 1 M Tris-Basis, 26 ml von 1 M MgCl2, 10 ml 10% Triton X-100 und 0,637 g Spermidin mischen. Machen Sie den Bestand auf ein Endvolumen von 100 ml, indem Sie ddH2O hinzufügen.
      HINWEIS: Ein letzter pH-Wert von 7,9 der 1x-Lösung sollte mit einem kalibrierten pH-Messgerät bestätigt werden. Der 10x sollte steril gefiltert und bei -20 °C in entsprechend großen Aliquots gelagert werden.
    3. Führen Sie die Transkription wie folgt durch.
      1. Fügen Sie die folgenden Reagenzien hinzu, um eine Endkonzentration von 1x T7 Transkriptionspuffer mit dem 10x T7 Transkriptionspuffer und ddH2O (ab Schritt 4.2.2), 1x NTPs, 10 mM Dithiothreitol (DTT), 1 Sequenz), 1 -M gelgereinigte Mango-DNA-Sequenz (Schritt 2.1) und T7-RNA-Polymerase-Enzym (1 U/L).
      2. Wirbel, Spin-down, und inkubieren Sie die Lösung bei 37 °C für 2 h oder bis es trüb wird und ein weißer Niederschlag bildet sich an der Unterseite des Rohres. Eine 50-L-Transkription sollte nach der Gelreinigung zu einer 50-L-RNA von 50 m RNA führen. Fügen Sie ein gleiches Volumen von 2x Denaturierungfarbstoff hinzu und lagern Sie es bei -20 °C, bis er zur Gelreinigung bereit ist.
    4. Gel-reine die resultierende RNA, wie sie im Abschnitt zur Gelreinigung von DNA-Oligonukleotiden beschrieben wird, indem sie die Schritte 4.1.2-u20124.1.8 befolgt und die RNA-Probe durch die DNA ersetzt.
      HINWEIS: RNA ist extrem empfindlich auf RNase-Abbau, so stellen Sie sicher, dass in allen Schritten, Handschuhe und ein sauberes Labormantel zu jeder Zeit getragen werden. Stellen Sie sicher, dass alle Proben in Einweg-Kunststoffen hergestellt und gelagert werden, um sich vor RNase-Kontamination zu schützen, und waschen Sie Glasplatten vor dem Gebrauch sorgfältig mit heißer Seife und Wasser, spülen Sie sie gründlich mit ddH2O aus und trocknen Sie die Glaswaren mit dem Unterstützung von Ethanol aus einer Squeeze-Flasche aufgetragen.
    5. Verwenden Sie 1 L der endgültigen RNA-Probe und bestimmen Sie mit Hilfe eines tropfenbasierten Spektralphotometers die Absorption bei 260 nm. Berechnen Sie mit Hilfe eines Aussterbekoeffizienten, der durch die Methode des nächsten Nachbarn bestimmt wird, die RNA-Konzentration und passen Sie die Probenkonzentration auf 10 m mit ddH2O an. Bewahren Sie die RNA-Proben bei -20 °C auf.
  3. Escherichia coli gesamter Rohnukleinsäureextraktion
    HINWEIS: Das folgende Protokoll ist ein Beispiel. Dieses Protokoll verwendet endogen exprimierte Mango I-markierte 6S-RNA aus einem Plasmid in E. coli, und die Induktion von diesem Plasmid wird an anderer Stelle im Detail beschrieben4.
    1. Für die Zwecke dieser Studie bereiten Sie 500 ml induzierte Zellen sowohl für die pEcoli-RNA Mango als auch für die pEcoli-T1-Plasmide vor (die Zellen werden bei einer OD600nm von 1 induziert). Pellet die Zellen und speichern Sie sie bei -80 °C vor der Verwendung.
    2. Führen Sie die RNA-Extraktion wie folgt durch.
      1. Nehmen Sie 0,5 ml des induzierten pEcoli-Zellpellets und fügen Sie 500 l ausgleichiertem Phenol hinzu. Dann wirbeln Sie die Probe aus; die Lösung wird milchig weiß. Zentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit für 2 min, um die Schichten zu trennen.
      2. Extrahieren Sie die obere Schicht, die leicht gelb sein wird, und wiederholen Sie Schritt 4.3.2.1, indem Sie ein gleiches Volumen an Phenol, Zentrifugieren und Extrahieren für insgesamt 5x hinzufügen (oder bis die mittlere Schicht, die undurchsichtig weiß ist, verschwindet und nur noch zwei klare Schichten übrig sind).
      3. Fügen Sie das phenolextrahierte wässrige Volumen zu einem gleichen Volumen von Chloroform, Wirbel und dann Zentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit für 2 min.
      4. Extrahieren Sie die wässrige Schicht und fügen Sie NaCl zu einer Endkonzentration von 300 mM hinzu. Niederschlagen Sie die resultierende Nukleinsäure durch Zugabe von 2,5 Äquivalenten Ethanol, Wirbel, Spin-down und Ausscheide bei -20 °C für mindestens 30 min.
      5. Pellet in einer Tischzentrifuge bei 15,6 x 1.000 x g bei 4 °C für 30 min. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und setzen Sie das Pellet in 100 l ddH2O wieder auf.
      6. Fügen Sie diesem Verfahren einen DNase I-Verdauungsschritt hinzu, der dem referenzierten Protokoll11folgt, um die gesamte RNA zu erhalten.
        HINWEIS: Wirbel kräftig, bis das Pellet vollständig in ddH2O gelöst ist.

5. Post-Gel-Färbung

  1. Bereiten Sie 1x Gel Färbung Lösung nach dem Rezept in Schritt 1.1.3 und fügen Sie es zu einem sauberen Glasbehälter, der breit genug ist, um bequem das Gel passen.
    HINWEIS: Borosilikatglasbehälter mit Snap-Fit-Deckel nummieren sich gut.
  2. Fügen Sie genügend 1x Gel-Färbungslösung in den Behälter, so dass das Gel vollständig mit der Lösung bedeckt ist und die Flüssigkeit über der Oberseite des Gels sloshes, wenn es auf den Orbitalrotator gelegt wird.
    HINWEIS: Der Behälter muss groß genug sein, um das Gel zu passen, so dass es sich bewegen kann und genügend Puffer im Behälter haben kann, um das Gel vollständig zu bedecken.
  3. Sobald das native oder denaturierende Gel fertig ist (Abschnitt 2 bzw. 3), entfernen Sie das Gel aus dem Gerät und schneiden Sie seine Brunnen ab. Es kann nützlich sein, eine Ecke des Gels zur Orientierung später in der Analyse zu entfernen.
  4. Das Gel vorsichtig auf die in Schritt 5.2 zubereitete 1x Gel-Färbelösung übertragen.
    HINWEIS: Die Gele sind zerbrechlich und anfällig für Bruch, also seien Sie vorsichtig, wenn Sie das Gel übertragen. Halten Sie den Deckel auf dem Färbebehälter zu jeder Zeit, um das Gel nicht zu verunreinigen.
  5. Legen Sie das Gel 30 min bei Raumtemperatur mit einer Geschwindigkeit von 100 Umdrehungen pro Minute auf einen Orbitalrotator.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Gel nicht wieder auf sich selbst faltet; Andernfalls kann die RNA aus dem Gel diffundieren und so einen anderen Teil des Gels kennzeichnen.

6. Imaging Mango-markierte RNAs in Gel

  1. Dekantieren Sie den Bildgebungspuffer vorsichtig. Spülen Sie das Gel schnell mit Wasser, so dass genügend Flüssigkeit bleibt, um das Gel leicht mobil im Behälter zu halten.
  2. Übertragen Sie das Gel vorsichtig auf den Imager. Übertragen Sie, indem Sie die Seiten des Gels sorgfältig aufnehmen und auf das Imager-Fach legen; alternativ kann das Gel langsam auf das Tablett gegossen werden. Stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen unter dem Gel befinden und dass sich keine überschüssige Flüssigkeit unter dem Gel befindet. Eine Pipetten, die über das Gel gerollt wird, kann nützlich sein, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
    HINWEIS: Verwenden Sie ein Papiertuch, um die überschüssige Flüssigkeit aufzusaugen.
  3. Nehmen Sie ein Gelbild, beobachten Fluoreszenz zwischen Anregungswellenlänge 510 nm und Emissionswellenlänge 535 nm (z. B. grünes Licht bei 520 nm Wellenlänge Fluoreszenzeinstellungen auf dem Imager). Stellen Sie sicher, dass die Einstellungen auf dem Gerät vollständig optimiert sind, und befolgen Sie sorgfältig die Anweisungen für das verwendete Instrument.

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Ergebnisse

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Kurze Mit Mango-Tags versehene RNAs wurden wie im Protokollabschnitt beschrieben vorbereitet. Unter der Annahme, dass die Fluoreszenz bei den Denaturierungsbedingungen aufgrund des Vorhandenseins von Harnstoff in den Gelen am schwierigsten zu beobachten wäre, untersuchten wir zunächst die Resistenz der Mango-Aptamer gegen Harnstoff, der als Nukleinsäure-Denaturierungwirkt wirkt. Wir fanden heraus, dass Mango-Aptamer im Wesentlichen resistent gegen Denaturierung bis zu einer Harnstoffkonze...

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Diskussion

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Ein wesentlicher Vorteil des Mango-Fluoreszenz-Tags ist, dass ein einzelnes Tag auf verschiedene Arten verwendet werden kann. Die hohe Helligkeit und Affinität dieser Aptamer machen sie nicht nur für die Zellvisualisierung 2, sondern auch für die In-vitro-RNA- oder RNP-Reinigung4nützlich. Daher erweitert die Gel-Bildgebung die Vielseitigkeit des Mango-Tags auf einfache Weise. Die Empfindlichkeit der Mango-Gel-Bildgebung ist etwas geringer als die eines nördlichen Blots

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Offenlegungen

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Ein Patent für das Fluorogensystem Mango ist anhängig.

Danksagungen

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Die Autoren danken Razvan Cojocaru und Amir Abdolahzadeh für ihre technische Unterstützung und Lena Dolgosheina für das Korrekturlesen des Manuskripts. Die Finanzierung dieses Projekts wurde von einem Betriebskostenzuschuss des Canadian Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) an P.J.U. bereitgestellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,8 mm dicker Kamm mit 14 Vertiefungen für 30 mL PAGE-GeleLabRepCo11956042
101-1000 & micro; L  TippsFisher02-707-511
20-200 µ L geringe Retention  tipsFisher Scientific02-717-143
Acrylamid:N,N'-Methylenbisacrylamid (40% 19:1)BioreagenzienBP1406-1Akute Toxizität
Acrylamid:N,N'-Methylenbisacrylamid (40% 29:1)FisherBP1408-1Akute Toxizität
Agaranachämie02116-380
DC-Platte mit AluminiumrückenSigma-Aldrich
Amersham Imager 600GE Healthcare Lifesciences29083461
AmmoniumpersulfatBiorad161-0700Schädliche
BL21-ZellenNEBC2527H
BorsäureACPB-2940
Bromphenol BlueNatriumsalz SigmaB8026-25G
ChloloformACPC3300
DithiothreitolSigma Aldrich AlkoholeD0632-5G
DNase IThermoFisherEN0525
EDTA DinatriumsalzACPE-4320
EthanolCommerial 
Flat Gel LadespitzenCostarCS004854
Formamide 99%Alfa Aesar A11076
Gel-Geräteset mit Abstandshaltern und KämmenLabRepCo41077017
Glasschale mit KunststoffdeckelPyrex1122963Sollte groß genug sein, um Ihr Gelstück aufzunehmen
GlycerinAnachämie43567-540
HClAnachämie464140468
ImageQuanTLGE Healthcare Lifesciences29000605
IPTGInvitrogen15529-019
KClACPP-2940
MgCl2Caledron4903-01
MgSO4Sigma-AldrichM3409
NaClACPS-2830
NaOHBDHBDH9292
OrbitalrotatorLab-Line
PhenolInvitrogen15513-039
Rundes Gel LadespitzenCostarCS004853
Natriumphosphat zweibasischCaledron8120-1
Natriumphosphat monobasischCaledron8180-01
SYBRGoldThermoFisherS11494
T7 RNA-PolymeraseABME041
TEMEDSigma-AldrichT7024-50 ml
TO1-3PEG-Biotin FluorophorABMG955
Tris BaseFisherBP152-500
TryptonFisherBP1421-500
Tween-20SigmaP9496-100
HarnstoffFisherU15-3
Xylol CyanolSigmaX4126-10G
HefeextraktBioshopYEX401.500
1164840001P016EAAN

Referenzen

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