Summary
Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van een test voor transposase-toegankelijk chromatine sequencing (ATAC-seq) op de geactiveerde CD4 + menselijke lymfocyten. Het protocol is aangepast om het minimaliseren van verontreiniging van het mitochondriaal DNA leest van 50% tot 3% via de invoering van een nieuwe lysis-buffermengsel.
Abstract
ATAC-seq is uitgegroeid tot een veel gebruikte methodiek in de studie van de epigenetica vanwege zijn snelle en eenvoudige benadering van genoom-brede toegankelijk chromatine in kaart te brengen. In deze paper presenteren we een verbeterde ATAC-seq-protocol, dat vermindert de verontreiniging van het mitochondriaal DNA leest. Terwijl vorige ATAC-seq protocollen hebben geworsteld met leest een gemiddelde van 50% besmetten mitochondriaal DNA, de geoptimaliseerde lysis-buffermengsel in dit protocol opgenomen vermindert mitochondriaal DNA besmetting tot een gemiddelde van 3%. Dit verbeterde ATAC-seq-protocol voorziet in een in de omgeving van 50% vermindering van de kosten van het rangschikken. We laten zien hoe deze kwalitatief hoogwaardige ATAC-seq bibliotheken kunnen bereid worden uit geactiveerde CD4 +-lymfocyten, stapsgewijze instructies uit CD4 + lymfocyt isolement van volbloed door middel van data-analyse. Dit verbeterde ATAC-seq-protocol in een breed scala van celtypes is gevalideerd en zullen voor onmiddellijk gebruik aan onderzoekers bestuderen van chromatine toegankelijkheid.
Introduction
De assay voor transposase-toegankelijk chromatine sequencing (ATAC-seq) is snel uitgegroeid tot de toonaangevende methode voor de raadpleging van de chromatine het platform. ATAC-seq herkent regio's van de toegankelijke chromatine door het proces van tagmentation, fragmenteren en tagging van DNA door het zelfde enzym, voor de productie van bibliotheken waarmee reeksnummers chromatine toegankelijkheid over een gehele genoom kunt bepalen. Dit tagmentation proces wordt gemedieerd door de hyperactieve Tn5 transposase, die alleen open regio's van de chromatine als gevolg van nucleosomic sterische hinder snijdt. Als het snijdt, voegt de transposase van de Tn5 ook sequencing adapters waarmee voor snelle bibliotheek bouw door PCR en volgende-generatie sequentiebepaling van het genoom-brede toegankelijk chromatine1,2.
ATAC-seq is uitgegroeid tot de geprefereerde methode om te bepalen van de regio's van de chromatine toegankelijkheid als gevolg van de relatief eenvoudige en snelle protocol, de kwaliteit en de hoeveelheid informatie die kan worden bepaald uit de resultaten, en de kleine hoeveelheid grondstof nodig. Vergeleken met DNase-seq3 (die ook maatregelen genoom-brede chromatine toegankelijkheid), MNase-seq4 (die bepaalt nucleosoom posities open genoom regio), en de formaldehyde-gemedieerde FAIRE-seq5, ATAC-seq is sneller, goedkoper en meer reproduceerbare1. Het is ook meer gevoelig, werken met de grondstof voor zo weinig als 500 kernen, ten opzichte van de kernen van de 50 miljoen nodig voor DNase-seq3. ATAC-seq heeft ook de mogelijkheid om meer informatie over de architectuur van de chromatine dan andere methoden, met inbegrip van de regio's van transcriptie factor bindende, nucleosoom positionering en open chromatine regio's1. Effectieve, eencellige ATAC-seq-protocollen zijn gevalideerd, voorlichting over chromatine architectuur aan de eencellige niveau6,-7.
ATAC-seq is gebruikt voor het karakteriseren van chromatine het platform over een breed spectrum van onderzoek en cellen soorten, met inbegrip van planten8, mens9en vele andere organismen. Het is ook cruciaal voor het identificeren van Epigenetische regulatie van de ziekte staten7geweest. Het meest gebruikte ATAC-seq-protocol bevat echter het grote nadeel van besmetting sequencing leesbewerkingen van mitochondriaal DNA. In sommige datasets kunnen dit niveau van verontreiniging oplopen tot 60% van de volgorde van de resultaten1. Er is een gezamenlijke inspanning op het gebied om deze contaminerende mitochondriale leest zodat de meer efficiënte toepassing van ATAC-seq7,10,11. Hier presenteren we een verbeterde ATAC-seq-protocol dat het mitochondriaal DNA verontreiniging tarief reduceert tot slechts 3%, waardoor vermindering van ongeveer 50% in sequencing kosten10. Dit wordt mogelijk gemaakt door een gestroomlijnd proces van activering, CD4 +-lymfocyten isolatie en een verbeterde lysis-buffermengsel die van essentieel belang bij het minimaliseren van mitochondriaal DNA besmetting.
Dit protocol modifiedATAC-seq is gevalideerd met een breed scala van primaire cellen, met inbegrip van de primaire perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs)10, menselijke primaire monocyten en muis dendritische cellen (niet uitgegeven). Het is ook gebruikt met succes om te ondervragen melanoom cellijnen in een geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR) scherm met niet-coderende elementen11. Daarnaast biedt het gegevenspakket analyse in dit protocol omschreven en aangeboden op GitHub nieuwe en ervaren onderzoekers met tools om ATAC-seq gegevens te analyseren. ATAC-seq is de meest effectieve assay chromatine toegankelijkheid over een gehele genoom in kaart, en wijzigingen in het bestaande protocol die hier worden geïntroduceerd onderzoekers om kwalitatief hoogwaardige gegevens met lage mitochondriaal DNA besmetting, te produceren zal toestaan sequencing kostenverlaging en het verbeteren van ATAC-seq doorvoer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit verbeterde protocol bevat stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van ATAC-seq van CD4 +-lymfocyten, van de grondstof van volbloed door middel van data-analyse (Figuur 1).
1. isolatie van CD4 + T cellen van volbloed
Opmerking: De grondstof voor dit protocol is 15 mL vers volledig bloed verzameld met behulp van standaardprocedures, zodat de bron van de grondstoffen worden geselecteerd op basis van onderzoek vereisten. De schaal van het protocol zoals nodig. Vooraf warm fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) + 2% foetaal kalfsserum (FCS) tot kamertemperatuur (RT) en de centrifuge aan RT aanpassen voordat u de CD4 + T cel verrijking procedure begint.
- Voeg 750 µL van menselijke CD4 + T cel verrijking cocktail aan 15 mL bloed in een conische tube van 50 mL en meng zachtjes door inversie. Incubeer bij RT gedurende 20 min. Na incubatie voltooid is, voeg toe 15 mL PBS + 2% FCS aan de buis en meng zachtjes door inversie.
- Een verse 50 mL conische buis met 15 mL dichtheid voedingsbodem voor te bereiden. Zorgvuldig laag het bloedmonster van het verdunde op de bovenkant van het medium dichtheid, die zeker niet te verstoren de dichtheid medium/bloed interface die vormt. Centrifugeer gedurende 20 min op 1.200 x g en RT met versnelling ingesteld op 1 en de aflopende rem af.
Opmerking: Het is cruciaal voor de versnelling ingesteld op 1 en aflopende rem af op de centrifuge om onderbrekingen van de cellaag in het medium dichtheid te voorkomen. - De verrijkte CD4 + T-cellen van de dichtheid medium/plasma interface met behulp van een precisiepipet smalle stengel overdracht verzamelen. De verzamelde cellen overbrengen in een conische buis van verse 50 mL. Centrifugeer de verzamelde CD4 + T cellen gedurende 8 minuten op 423 x g en RT.
Opmerking: Zorg ervoor om terug te keren de centrifuge versnelling naar 9 en aflopende rem aan voor stap 1.3 en alle van de volgende stappen uit. - Verwijder het supernatant en de cel pellet tweemaal met 50 mL PBS + 2% FCS wassen, centrifugeren voor 8 min op 423 x g en RT. Discard het definitieve supernatant wassen en Suspendeer de pellet gewassen cel in 2 mL PBS + 2% FCS.
- Cellen tellen met behulp van een hemocytometer. Als u wilt doorgaan met de ATAC-seq, gaat u verder met stap 2.3. Als u wilt blokkeren van cellen voor later te worden verwerkt, ga naar stap 1.6.
- Voeg vervolgens 1 mL van verse bevriezing medium (FCS 90% + 10% dimethylsulfoxide) per 1 miljoen cellen. Aliquot 1 mL van de cellen in de bevriezing van medium in cryogene veilig buizen. Buizen aan-80 ° C's nachts in een langzaam-bevriezing container plaatsen. De volgende dag, buizen overbrengen in vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
Opmerking: 1 miljoen CD4 + T cellen worden geisoleerd per 2 mL van het oorspronkelijke volume van volbloed. Bevriezen van 500.000 cellen in 1 mL aliquots van bevriezing medium. Verse bevriezing medium op elk gebruik maken.
2. Activeer en zuiveren van CD4 + T cellen
Opmerking: Deze snelle protocol voor het activeren en het zuiveren van CD4 + T cellen alleen vereist 48u en resultaten in 95% levensvatbare, geactiveerd CD4 + T cellen. De centrifuge tot 4 ° C afkoelen voordat u begint met het protocol.
- Ontdooi 1 ampul (500.000) van CD4 + T cellen in een waterbad 37 ° C totdat het ijs is net gesmolten. Zachtjes overbrengen in cellen een conische tube van 15 mL, met 9 mL voorverwarmde Roswell Park Memorial Instituut-1640 (RPMI-1640) media aangevuld met 10% FCS, hierna te noemen de volledige RPMI.
Opmerking: Laat geen cellen ontdooien volledig Voorkom blootstelling aan DMSO. - Centrifugeer gedurende 6 min op 1500 x g - en 4 ° C. Verwijder het supernatant en zachtjes Suspendeer de pellet in 2 mL van volledige RPMI. Herhaal de spin naar beneden, verwijder het supernatant en zachtjes schorten cellen in 0,5 mL van volledige RPMI.
- Met behulp van een hemocytometer cellen tellen. Aanpassen van de dichtheid van de celsuspensie met volledige RPMI aan de plaat van 50.000 cellen in 200 µL per putje van een 96-Wells-ronde bodemplaat.
Opmerking: Uit een bevroren buis van 500K CD4 + T cellen, putjes van de plaat 10 van 50.000 CD4 + T cellen in 200 µL per putje. -
Magnetische kralen geconjugeerd met menselijke T-activator anti-CD3 en anti-CD28 antilichamen voor te bereiden.
- Aliquot 12,5 µL van menselijke T-activator CD3/CD28 kralen per ATAC-seq monster tot een 1,5 mL koker. Wassen van de kralen met 1 mL 1 x PBS en plaats de buis op een magneet voor 1 min.
- Zorgvuldig verwijderen en de duidelijke vloeistof wordt weggeworpen, verwijderen van de buis van de magneet en opschorten van de kralen in 13 µL voltooien RPMI per ATAC-seq monster.
Opmerking: Berekent het bedrag van kralen nodig op basis van het aantal monsters van de ATAC-seq wordt verwerkt. Dit protocol vereist 12,5 µL van CD3/CD28 kralen per 500.000 cellen, zijnde één ATAC-seq monster.
- De CD4 + T-cellen activeren. Verzamelen van 500.000 cellen in 2.1 mL voor volledige RPMI medium in een conische tube van 15 mL en voeg 12,5 µL van vooraf gewassen menselijke T-activator parels. Meng voorzichtig door het omkeren van de buis.
- Zachtjes de cellen met kralen naar een steriele reservoir en plaat 200 µL van cellen met kralen per putje van ronde bodemplaat 96-Wells met behulp van een precisiepipet meerkanaals overbrengen. Incubeer gedurende 48 uur in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.
- Na incubatie, centrifugeren van de 96-wells-plaat gedurende 8 minuten op 423 x g en RT. verwijderen 100 µL van medium per putje van de 96-wells-plaat, het het verzamelen in een conische buis voor teruggooi om ervoor te zorgen geen verlies van de kraal. Resuspendeer de pellet van de cel in de resterende 100 µL en verzamelen all-in-een 1,5 mL-buis.
Opmerking: 10 putjes van geactiveerde T-cellen worden verzameld in een volume van 1 mL. - Uitvoeren van CD4 + isolatie. 50 µL van vooraf gewassen CD4 geconjugeerd parels aan 500.000 cellen in 1 mL van volledige RPMI toevoegen. Kralen en cellen combineren met pipet. Incubeer gedurende 20 minuten bij 4 ° C in de koelkast. Agitate kralen en cel mengsel elke 6 min.
Opmerking: Dit protocol wordt gebruikt voor een steekproef van 500.000 cellen. Pas zo nodig voor twee of meer steekproeven van 500.000. - Wanneer de incubatie voltooid is, plaatst u de buis aan de magneet voor 2 min. verwijderen en verwijder het supernatant wanneer duidelijk. Wassen de kraal-gebonden cellen door het verwijderen van de buis van de magneet, opschorting van de cellen van de kraal-gebonden in 1 mL PBS + 2% FCS, ter vervanging van de buis aan de magneet voor 1 min en teruggooi van het supernatans dat duidelijk. Herhaal dit proces voor een totaal van 3 wasbeurten.
Opmerking: Wees voorzichtig niet te ontdoen van alle kralen tijdens wasbeurten. - Na de definitieve wash, plaats de buis aan de magneet voor 1 min. verwijderen en verwijder het supernatant en plaats de pellet op ijs. Ga verder met sectie 3 (ATAC-seq).
3. ATAC-seq
Opmerking: In deze stap zijn kernen geïsoleerd uit geactiveerde CD4 + T cellen voor ATAC-seq. De lysis-buffermengsel gebruikt in dit protocol is verbeterd om te worden zachter op de kernen, wat resulteert in een efficiëntere spijsvertering en hogere kwaliteit van de resultaten. Alle stappen van het centrifugeren in punt 3 worden uitgevoerd met een vaste hoek centrifuge onderhouden bij 4 ° C. Koel de centrifuge voordat u begint met protocol.
- Uitvoeren van kernen isolatie. Resuspendeer kralen en cellen met koude lysis-buffermengsel (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,03% Polysorbaat 20). Centrifugeer onmiddellijk bij 500 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Verwijderen en verwijder het supernatant.
- De reactie van de transposase uit te voeren. Opschorten van de geïsoleerde kernen pellet met 50 µL van Tn5 transposase mix (tabel 1). Incubeer in een thermocycler gedurende 30 minuten bij 37 ° C met een deksel van 40 ° C, bij 4 ° C na afloop houden.
- Na thermocycling, onmiddellijk uitvoeren van een snelle benchtop centrifuge spin down en plaats de buis op de magneet voor 1 min om de parels van het product.
- Overbrengen in het supernatans dat duidelijk uit de buis aan de magneet een DNA zuivering kolom. Was de kolom met 250 µL van Buffer PB en tweemaal met 750 µL van Buffer PE. Elueer het monster in 10 µL van elutie buffer. Ga direct naar stap 3.5.
Opmerking: Deze stap versterkt de DNA-fragmenten met de ligaturen adapters, aangeduid als de ATAC-seq-bibliotheek. Om verschillende ATAC-seq bibliotheken kunnen worden uitgevoerd op een NGS rijstrook multiplex, door niet-geïndexeerde Primer 1 te gebruiken voor alle monsters en een verschillende geïndexeerde Primer 2 voor afzonderlijke monsters (tabel 2). Inleidingen worden gebruikt in concentraties van 1,25 µM werken. - Instellen van de eerste PCR versterking reactie in een nuclease-vrije PCR-buis, het combineren van de componenten in de volgorde en het volume opgegeven tabel 3. Plaats van de PCR-buis in de thermocycler en de PCR versterking programma uitvoeren met fietsen voorwaarden zoals vermeld in tabel 4.
-
De reactie door qPCR volgen. Instellen van de reactie van de qPCR in een nuclease-vrije PCR-buis, het combineren van de componenten in de volgorde en het bedrag dat is opgegeven in tabel 5. Plaats in qPCR machine en cyclus als gespecificeerd in tabel 6.
- Als u bepalen dat het optimale aantal extra versterking cycli voor de resterende 45 µL reactie, maakt u een perceel met cyclus nummer op de x-as en de relatieve fluorescentie (RFU) op de y-as. Het optimale aantal extra versterking cycli is eenderde van het aantal cycli die nodig is om de reactie van de qPCR op het plateau te bereiken.
Opmerking: Controle van de reactie door qPCR maakt het mogelijk voor de bepaling van het optimale aantal cycli van PCR gewenst om optimale bibliotheek fragment amplificatie terwijl het minimaliseren van GC inhoud en grootte bias.
- Als u bepalen dat het optimale aantal extra versterking cycli voor de resterende 45 µL reactie, maakt u een perceel met cyclus nummer op de x-as en de relatieve fluorescentie (RFU) op de y-as. Het optimale aantal extra versterking cycli is eenderde van het aantal cycli die nodig is om de reactie van de qPCR op het plateau te bereiken.
- Vul de laatste PCR versterking van de resterende 45 µL van het PCR reactie. De PCR-buis met de reactie van de amplificatie van stap 3.5 plaats terug in de thermocycler en voer het programma zoals beschreven in tabel 7.
Opmerking: Voor monsters verwerkt zoals beschreven in dit protocol, werd het optimale aantal cycli van PCR versterking bepaald als 12. - Nadat de versterking voltooid is, zuiveren de bibliotheken met behulp van een PCR Schoonmaakbeurt kit volgens protocol van de fabrikant, eluerende in 25 µL van de elutie buffer.
Opmerking: Versterkte bibliotheken kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C voor maximaal 48 h of bevroren bij-20 ° C voor langdurige opslag.
4. analyse van de kwaliteit van de bibliotheek van ATAC-seq
Opmerking: Het is belangrijk voor het valideren van de kwaliteit en de kwantiteit van ATAC-seq bibliotheken voor de volgende generatie sequencing. De kwaliteit en kwantiteit van de bibliotheken moeten worden beoordeeld met behulp van commercieel beschikbare kits (Zie Tabel van materialen).
- Het beoordelen van de kwaliteit en kwantiteit van de ATAC-seq-bibliotheken met behulp van een microfluidics-gebaseerd platform voor grootte, kwantificering en kwaliteitscontrole van DNA. Zie Figuur 2 voor de resultaten van de beoordeling van de kwaliteit van de vertegenwoordiger.
Opmerking: De concentratie van de ATAC-seq bibliotheken moet > 1 ng/µL sequencing kwaliteitsresultaten te verkrijgen. Op gemiddeld 30 nM in 25 µL werd verkregen.
5. sequencing en Data-analyse
Opmerking: Deze analyse pijpleiding kan gebruikers controleren zij de kwaliteit van toewijzing van de procedure luidt, aanpassen van de coördinaten van de proefopzet en bel pieken voor downstream-analyse. Hier volgen de lijnen van de commando's en uitleg van uitvoering. De data analyse pakket is beschikbaar op (https://github.com/s18692001/bulk_ATAC_seq).
- Het volgnummer van de bereid bibliotheken op een volgende generatie sequencer tot een gemiddelde Lees diepte van 42 miljoen leest per monster.
- Een schatting van de kwaliteit van sequencing leest door het controleren van bestanden die zijn gegenereerd door FastQC12 softwarepakket met behulp van de opdracht:
fastqc -o < uitvoer_directory >< fastq_file > - Trim de basissen van leest door Trimmomatic13 software, indien nodig, zoals bepaald door de kwaliteitscontrole van de FastQC, met behulp van de opdracht (voor paar fitting):
java-jar < pad naar trimmomatic jar bestand > PE < Ingang1 >< Ingang2 >< gepaarde Uitgang1 >< ongepaarde Uitgang1 >< gepaarde output2 >< ongepaarde output2 > HEADCROP: < bijsnijden honken > - Uitlijnen Bowtie214 software leest aan menselijke referentie genoom (hg38):
bowtie2 - x < verwijst naar genoom > -1 < input paar 1 >< input paar 2 > -S < SAM uitvoerbestand >
Opmerking: Het argument - x is voor de basename van de index voor de referentie-genoom en -S is voor de uitvoer van SAM formaat. - Dekwaliteitsdoelstellingen van toegewezen luidt met behulp van Samtools15 flagstat pakket controleren
samtools flagstat < BAM bestand > - Het bestand toegewezen leest sorteren en verwijderen van duplicaten met Picard16 gereedschap:
java-jar picard.jar INPUT SortSam = < input SAM bestandsnaam > OUTPUT = < output gesorteerd op BAM bestandsnaam > SORT_ORDER coördinaat = "en" java-jar picard.jar MarkDuplicates INPUT = < gesorteerde BAM bestand > OUTPUT = < BAM uitvoerbestand zonder duplicaten > REMOVE_DUPLICATES = TRUE - Index BAM bestand, trim de ongebruikte chromosoom leest en verschuiving van de coördinaten voor de experimentele reden van ATAC-seq17:
java-jar picard.jar BuildBamIndex-INPUT = < BAM bestand >
samtools idxstats < Input BAM bestand > | Cut -f 1 | grep - v chrY | grep - v chrM | grep - v chrUn | xargs samtools bekijken -b < Input BAM bestand >>< Output getrimd BAM bestand >
bedtools bamtobed -i < Input getrimd BAM bestand >>< Output getrimd BED bestand >
awk ' beginnen {OFS = "\t"}; {Als ($6 == "+") print $1, $2 + 4, $3 + 4, $4, $5, $6; anders afdrukken van $1, $2-5, $3-5, $4, $5, $6}' < Input getrimd BED bestand >< Trimmed verschoven BED bestand > - Verwijder het luidt dat zijn verschoven naar negatieve coördinatie:
awk '{if ($2 > 0) afdrukken $1 "\t" $2 "\t" $3 "\t" $4 "\t" $5 "\t" $6}' < Input BED bestand >< uitvoerbestand niet-negatieve coördinatie BED >. - De BED-bestand converteren naar BAM bestand voor volgende DiffBind18 analyse:
bedtools bedtobam -i < Input BED bestand > -g < verwijzing genoom >< Output BAM bestand > - Piek roeping uitvoeren door DiffBind18 softwarepakket:
macs2 callpeak -t < Input BAM bestand > -f BAM -g hs - nomodel--nolambda--houden-dup alle--oproep-topontmoetingen--outdir < mappad Output > - n < Output naam > -B - q 0.01--bdg--shift-100--extsize 200
Opmerking: Na filtering, verwachten een mediaan van 37 miljoen leest per monster. Mitochondriaal DNA verontreiniging zullen variëren van 0,30 – 5.39% (1.96% gemiddeld). Zal er een laag tarief van vermenigvuldigen toegewezen luidt (6,7% – 56%, 19% gemiddeld) en een relatief hoog percentage van bruikbare nucleaire leest (60%-92%, 79% gemiddeld).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Van 15 mL vers volledig bloed genereert dit protocol een gemiddelde van 1 miljoen CD4 + T cellen. Dit kunnen worden ingevroren voor later te worden verwerkt of gebruikt onmiddellijk. Levensvatbaarheid van de CD4 + T-cellen, verse of ontdooide, was consequent > 95%. Deze methode van CD4 + T cel isolatie zorgt voor flexibiliteit in de bron-materiaal en collectie-tijd. Dit verbeterde ATAC-seq-protocol produceert een definitieve bibliotheek van meer dan 1 ng/µL voor het rangschikken. Kwaliteitscontrole uitgevoerd met behulp van commercieel beschikbare systemen moeten blijk geven van DNA-fragmenten tussen 200 en 1000 bp (Figuur 2). Sequencing moet alleen worden uitgevoerd met hoogwaardige bibliotheken.
Alle bibliotheken werden sequenced tot een gemiddelde diepte van meer dan 40 miljoen lezen per monster. Terwijl de gebruikte protocollen van de ATAC-seq zijn aangevochten door besmetting van sequencing leesbewerkingen van mitochondriaal DNA die kan variëren van 50% - 60% van de totale rangschikking leest1 elimineert dit verbeterde protocol het probleem. Bibliotheken bereid volgens dit protocol bevatten gemiddeld slechts 3% mitochondriale luidt als volgt (figuur 3A). Het hoge percentage van bruikbare luidt is voldoende constant over biologische replicatieonderzoeken (figuur 3B). Het protocol was in staat om te bieden zeer reproduceerbare resultaten via technische replicatieonderzoeken (figuur 4A, B) en biologische replicatieonderzoeken (figuur 4C, D). Bovendien is het protocol voor CD4 + T cel activatie gepresenteerd neemt 48 h in plaats van een week of meer en resulteert in een coherent en efficiënt activering, zoals blijkt uit reproduceerbare rangschikkend resultaten (figuur 4A, B). Voorspelde ATAC-seq pieken heten nauwkeurig door de analyse pijpleiding (figuur 4E). Analyse van de resultaten van de sequencing vastgesteld duidelijke veranderingen in de chromatine staat tijdens menselijke T-cel activatie. Differentieel toegankelijke regio's van de open chromatine werden geïdentificeerd tussen zes steekproeven voor en na 48 uur voor activering (Figuur 5).
Figuur 1: Experimental overzicht van het gewijzigde protocol ATAC-seq. (A) proef acquisitie en verwerking, van 15 mL patiënt volbloed door CD4 + T cel isolatie, beplating en activering van de T-cellen en kernen isolatie met de verbeterde lysis-buffermengsel. (B) de transposase reactie en PCR versterking van de sequencing-bibliotheek. (C) kwaliteit analyse, sequencing en data-analyse. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: vertegenwoordiger hoogwaardige ATAC-seq bibliotheken van een microfluidics-gebaseerd platform voor grootte, kwantificering en kwaliteitscontrole van DNA. (A) elektronische gel afbeelding van monsters B1 en D1 met een "banding" tussen 200 en 1.000 basenparen. (B en C) Electropherogram trace resultaat van monsters B1 (B) en D1 (C), met toppen tussen 200 en 1.000 basenparen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: daalde van mitochondriaal DNA besmetting met de verbeterde ATAC-seq protocol resulteert in een toename van de bruikbare DNA sequencing leest. (A) vergelijking van bruikbare leest (paars), dubbele leest (groen) en mitochondriale leesbewerkingen (rood) van CD4 + T cel ATAC-seq profilering in de literatuur. (B) vergelijking van bruikbare leest (paars), dubbele leest (groen), mitochondriale leest (rood) en ontkoppeld leest (blauw) van CD4 + T cel ATAC-seq profilering van meerdere gezonde individuen (n = 22). Dit cijfer is gewijzigd van Cheng et al.10. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: ATAC-seq protocol reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid verbeterd. Verstrooien van percelen van chromatine toegankelijkheid (ATAC-seq signaal, x en y-axes) voor twee experimenten van ongestimuleerde repliceren (A; 36,486 Th pieken) of geactiveerd (B; 52,154 Thstim pieken) T cellen toont technische reproduceerbaarheid. Chromatine toegankelijkheid voor geactiveerde T-cellen bij personen met een IGTB1191 (y-as) en IGTB1190 (x-as) (C) en histogram van correlaties tussen elke paren van personen voor de 52,154 Thstim toppen (D) demonstreert reproduceerbaarheid tussen individuen. (E) ATAC-seq pieken aangeroepen met onze verbeterde ATAC-seq-protocol op chromosoom 19 Q13.12. Dit cijfer is gewijzigd van Cheng et al.10. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: vertegenwoordiger ATAC-seq resultaten van veranderingen in de chromatine staat na CD4 + T-cel activatie. (A) experimentele overzicht (links) en nomenclatuur (rechts). (B) Differentially toegankelijke regio's van de open chromatine (kolommen) in zes monsters (rijen) vóór (boven, Th) en na (onder, Thstim) 48 h activering van primaire CD4 + T cellen. Dit cijfer is gewijzigd van Cheng et al.10. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| 2 x TD Buffer | 25 ΜL |
| TN5 enzym | 5 ΜL |
| Nuclease gratis Water | 20 ΜL |
| Totaal Volume | 50 ΜL |
Tabel 1: Stap 3.2 transposase reactie componenten.
| Ad1_noMX: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG |
| Ad2.1_TAAGGCGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.2_CGTACTAG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAGTACGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.3_AGGCAGAA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTGCCTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.4_TCCTGAGC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCAGGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.5_GGACTCCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAGTCCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.6_TAGGCATG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATGCCTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.7_CTCTCTAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGAGAGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.8_CAGAGAGG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCTCTCTGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.9_GCTACGCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCGTAGCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.10_CGAGGCTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCCTCGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.11_AAGAGGCA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGCCTCTTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.12_GTAGAGGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCCTCTACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.13_GTCGTGAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCACGACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.14_ACCACTGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACAGTGGTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.15_TGGATCTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGATCCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.16_CCGTTTGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACAAACGGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.17_TGCTGGGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACCCAGCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.18_GAGGGGTT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAACCCCTCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.19_AGGTTGGG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCCAACCTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.20_GTGTGGTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACCACACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.21_TGGGTTTC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGAAACCCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.22_TGGTCACA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTGACCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.23_TTGACCCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGGTCAAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.24_CCACTCCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAGTGGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
Tabel 2: ATAC-seq oligos ontwerpen voor PCR gebruikt.
| Nuclease gratis Water | 11.9 ΜL |
| 100 µM aangepaste volgende Primer 1 (tabel 2) | 0.6 ΜL |
| NEBNext HiFi-2 x PCR Master Mix | 25 ΜL |
| ATAC-Seq bibliotheek | 10 ΜL |
| 25 µM aangepaste volgende Primer 2 (tabel 2) | 2.5 ΜL |
| Totaal Volume | 50 ΜL |
Tabel 3: Stap 3.5 eerste PCR reactie mix.
| CYCLUS STAP | TEMPERATUUR | TIJD | CYCLI |
| Uitbreiding | 72 ° C | 5 min | 1 |
| Eerste denaturatie | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Denaturatie | 98 ° C | 10 s | 10 |
| Gloeien | 63 ° C | 30 s | |
| Uitbreiding | 72 ° C | 1 min | |
| Houd | 4 ° C | Oneindigheid | 1 |
Tabel 4: Stap 3.5 PCR versterking fietsen startprogramma.
| PCR reactie Aliquot | 5 ΜL |
| PCR Cocktail van tabel 3 met 0.6 x Syber groen | 10 ΜL |
Tabel 5: Stap 3.6 qPCR reactie mix.
| CYCLUS STAP | TEMPERATUUR | TIJD | CYCLI |
| Eerste denaturatie | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Denaturatie | 98 ° C | 10 s | 20 |
| Gloeien | 63 ° C | 30 s | |
| Uitbreiding | 72 ° C | 1 min | |
| Houd | 4 ° C | Oneindigheid | 1 |
Tabel 6: Stap 3.6 qPCR fietsen programma.
| CYCLUS STAP | TEMPERATUUR | TIJD | CYCLI |
| Eerste denaturatie | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Denaturatie | 98 ° C | 10 s | Zoals bepaald |
| Gloeien | 63 ° C | 30 s | |
| Uitbreiding | 72 ° C | 1 min | |
| Houd | 4 ° C | Oneindigheid | 1 |
Tabel 7: Stap 3.7 PCR fietsen programma voor definitieve PCR versterking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gewijzigde ATAC-seq-protocol gepresenteerd in dit artikel biedt reproduceerbare resultaten met minimale mitochondriaal DNA-besmetting. Het protocol is met succes gebruikt om zijn karakteriseren chromatine architectuur van menselijke primaire PBMCs10, menselijke monocyten, muis dendritische cellen (ongepubliceerd), en gekweekte melanoom cel lijnen11. Wij verwachten dat deze verbeterde lysis voorwaarde heeft het potentieel om te werken voor andere celtypes ook. Verwacht wordt ook dat dit protocol van de isolatie kernen verenigbaar met enkele kernen ATAC-seq protocollen zijn zal, minimaliseren van mitochondriaal DNA verontreiniging te verbeteren rangschikkend resultaten.
Een bijkomend voordeel van dit gewijzigde protocol is de mogelijkheid om te bevriezen van batches van geïsoleerde CD4 + T cellen van PBMCs op verschillende tijdstippen, afhankelijk van de beschikbaarheid van patiënt monsters. ATAC-seq kan vervolgens gelijktijdig worden uitgevoerd op alle monsters, is potentiële batch effect bias in de reactie van de transposase en de sequencing geminimaliseerd10. Het is essentieel dat bevriezing medium vers bij elk gebruik, teneinde de hoge levensvatbaarheid die is bereikt met dit bevriezen-ontdooien-protocol worden gemaakt. Levensvatbaarheid van geïsoleerde CD4 + T cellen moet boven 90% blijven om te voorkomen dat niet-specifieke spijsvertering in de transposase reactie1.
Houd er rekening mee dat verdere optimalisatie kan worden verlangd om dit protocol gebruiken met variabele celtypen en hoeveelheden. Aangezien de Tn5 transposase-naar-kernen verhouding is geoptimaliseerd voor 500.000 kernen in dit protocol als ATAC-seq met een verschillend aantal kernen wilt uitvoeren, moet de hoeveelheid Tn5 transposase dienovereenkomstig worden aangepast. Overmatige lysis van kernen als gevolg van een overmaat van Tn5 kan leiden tot hoge achtergrond gesloten chromatine en lage complexiteit van sequencing Bibliotheken, terwijl de lysis van de minderjarigen niet een volledige PCR kunnen versterkt bibliotheek1. Om deze complicaties te vermijden, is het geadviseerd uit te voeren van voorzichtig kernen tellen en optimaliseren van de verhouding van de Tn5 als dit nodig is. Om de kwaliteit van de gegevens verder te verbeteren, wordt het geadviseerd voor het optimaliseren van PCR versterking cycli door toezicht op qPCR. Als de definitieve bibliotheek teveel amplificatie cycli ondergaat, kan er vertekening geïntroduceerd in het rangschikken gegevens2. Het is raadzaam voor het uitvoeren van goede kwaliteit controle van de bibliotheken van de ATAC-seq voorafgaand aan het rangschikken van de volgende generatie om tijd en geld besparen.
Zoals we hebben aangetoond, een gemodificeerde lysis-buffermengsel is de sleutel tot de vermindering van de mitochondriale DNA besmetting en is effectief op een groot aantal celtypes. Andere protocollen hebben de kwestie van mitochondriale besmetting met alternatieve lysis buffers7,19 , of door het intensieve proces van een CRISPR-gemedieerde mitochondriaal DNA depletie20. Onze alternatieve ATAC-seq-protocol draagt bij tot de inspanning om mitochondriaal DNA besmetting van sequencing leest met een verbeterde lysis-buffermengsel en instandhouding van de eenvoud van ATAC-seq waarmee dergelijke een toegankelijke techniek te verlagen. Samen met RNA-seq en eencellige sequencing is ATAC-seq een krachtig hulpmiddel voor het verkennen van de Epigenetische regulatie. Dit verbeterd ATAC-seq protocol en data analyse pakket zal helpen verminderen sequencing kosten en hogere kwaliteit resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Atsede Siba voor technische ondersteuning. CSC wordt ondersteund door de NIH grant 1R61DA047032.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS, Sterile | Gibco | 10010023 | Can use other comparable products. |
| 5810/5810 R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets | Eppendorf | 22625501 | Can use other comparable products. |
| 96 Well Round Bottom Plate | Thermo Scientific | 163320 | Can use other comparable products. |
| Agilent 4200 Tape Station System | Agilent | G2991AA | Suggested for quality assessment. |
| Cryotubes | Thermo Scientific | 374081 | Can use other comparable products. |
| DMSO | Sigma | D8418 | Can use other comparable products. |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Invitrogen Life Technologies | 11131D | Critical Component |
| Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit | Invitrogen Life Technologies | 11346D | Critical Component |
| Dynamagnet | Invitrogen Life Technologies | 12321D | Critical Component |
| FCS | Gemini Bio Products | 100-500 | Can use other comparable products. |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 50674626 | Suggested for quality assessment. |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade | Sigma | M2393 | Can use other comparable products. |
| MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer) | Qiagen | 28004 | Critical Component |
| Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0001 | Can use other comparable products. |
| NaCl, Molecular Biology Grade | Sigma | S3014 | Can use other comparable products. |
| NEBNext High Fidelity 2x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | Critical Component |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (2x TD Buffer, Tn5 Enzyme) | Illumina | FC1211030 | Critical Component |
| Nuclease Free Sterile dH20 | Gibco | 10977015 | Can use other comparable products. |
| Polysorbate 20 (Tween20) | Sigma | P9416 | Can use other comparable products. |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25780 | Critical Component |
| Precision Water Bath | Thermo Scientific | TSGP02 | Can use other comparable products. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | Critical Component |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen Life Technologies | Q32851 | Suggested for quality assessment. |
| Qubit FlouroMeter | Invitrogen Life Technologies | Q33226 | Suggested for quality assessment. |
| Rosette Sep Human CD4+ Density Medium | Stem Cell Technologies | 15705 | Critical Component |
| Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15022 | Critical Component |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875093 | Can use other comparable products. |
| Sterile Resevoir | Thermo Scientific | 8096-11 | Can use other comparable products. |
| T100 Thermocycler with Heated Lid | BioRad | 1861096 | Can use other comparable products. |
| Tris-HCL | Sigma | T5941 | Can use other comparable products. |
References
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide. Current Protocols in Molecular Biology. 21, 1-29 (2015).
- Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2010).
- Pajoro, A., Muiño, J. M., Angenent, G. C., Kaufmann, K. Profiling Nucleosome Occupancy by MNase-seq: Experimental Protocol and Computational Analysis. Methods in Molecular Biology. 1675, 167-181 (2018).
- Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).
- Rosenberg, A. B., et al. Single-cell profiling of the developing mouse brain and spinal cord with split-pool barcoding. Science. 360 (6385), 176-182 (2018).
- Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).
- Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes. Nucleic Acids Research. 45 (6), e41 (2017).
- Lara-Astiaso, D., et al. Chromatin state dynamics during blood formation. Science. 345 (6199), 943-949 (2014).
- Gate, R. E., et al. Genetic determinants of co-accessible chromatin regions in activated T cells across humans. Nature Genetics. , (2018).
- Sanjana, N. E., et al. High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome. Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).
- Andrews, S. FastQC A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. Babraham Bioinformatics. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc (2018).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Broad Institute. Picard Tools. , Available from: http://broadinstitute.github.io/picard/ (2018).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Stark, R., Brown, G. DiffBind: Differential Binding Analysis of ChIP-Seq Peak Data. , Available from: http://bioconductor.org/packages/devel/bioc/vignettes/DiffBind/inst/doc/DiffBind.pdf (2018).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Wu, J., et al. The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos. Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).
