Method Article

Quantitative Analyse der zellulären Zusammensetzung in fortgeschrittene atherosklerotische Läsionen der glatten Muskulatur Zelle Abstammung-Tracing Mäuse

DOI:

10.3791/59139

⸱

February 20th, 2019

 ,  ,  , 
1Heart, Lung, Blood and Vascular Medicine Institute, University of Pittsburgh, 2Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia, 3Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia, 4Division of Cardiology, University of Pittsburgh School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir schlagen ein standardisiertes Protokoll zur Charakterisierung der zellulären Zusammensetzung der Spätphase murinen atherosklerotische Läsionen einschließlich systematische Methoden der tierischen Dissektion, Gewebe einbetten, schneiden, Färbung und Analyse der Brachiocephalic Arterien Atheroprone glatten Muskulatur Zelle Abstammung Ablaufverfolgung Mäuse.

Abstract

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Atherosklerose ist die häufigste Todesursache weltweit und, trotz unzähligen präklinischen Studien vielversprechende therapeutische Ziele beschreiben, neue Interventionen blieben schwer. Dies ist wahrscheinlich wegen, unter anderem zu einer Abhängigkeit von präklinischen Prävention Modelle untersucht die Auswirkungen der genetischen Manipulationen oder pharmakologische Behandlungen auf die Atherosklerose-Entwicklung als die etablierten Krankheit. Ergebnisse dieser Studien sind oft durch die Verwendung von oberflächlichen Läsion Analysen und mangelnder Charakterisierung der Läsion Zellpopulationen verwirrende. Um diese translationalen Hürden überwinden zu helfen, schlagen wir eine erhöhte Abhängigkeit von der Intervention-Modelle, die Untersuchung von Veränderungen in der zellulären Zusammensetzung auf eine einzelne Zellenebene von immunofluorescent Färbung und konfokalen Mikroskopie beschäftigen. Zu diesem Zweck beschreiben wir ein Protokoll in einem murinen Interventionsmodell, einschließlich eines systematischen Ansatzes für tierische Dissektion, einbetten, schneiden, färben und Quantifizierung der Brachiocephalic Arterie Läsionen zu Testzwecken eine vermeintliche Therapeutikum. Darüber hinaus aufgrund der phänotypische Vielfalt von Zellen im Spätstadium atherosklerotische Läsionen beschreiben wir die Bedeutung des Einsatzes zellspezifische, induzierbaren Abstammung Ablaufverfolgung Maus Systeme und wie dies für unvoreingenommene Charakterisierung der genutzt werden kann atherosklerotischen Läsionen Zellpopulationen. Zusammen, diese Strategien können vaskuläre Biologen genauer therapeutische Interventionen zu modellieren und analysieren von atherosklerotischen Krankheit helfen und werden hoffentlich in eine höhere Erfolgsquote in klinischen Studien zu übersetzen.

Introduction

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Atherosklerose ist die häufigste Ursache für Morbidität und Mortalität, die weltweit die Mehrheit der koronaren Herzkrankheit, periphere Arterie Erkrankungen und Schlaganfall zugrunde liegen. Spätstadium koronaren Atherosklerose führen zu schweren Komplikationen einschließlich myokardiale Verletzung Bilanzierung von fast 16 % der Welt Bevölkerung Mortalität1,2. Durch ihre verheerenden Auswirkungen auf die öffentliche Gesundheit wurden erheblicher Anstrengungen unternommen, zu entschlüsseln, die Mechanismen fahren Fortschreiten der Atherosklerose sowie neue therapeutische Strategien zu entwickeln. Allerdings ist die Wahrscheinlichkeit der Zulassung (LOA) bei klinischen Studien für Herz-Kreislauf-Krankheit zu den niedrigsten im Vergleich mit anderen klinischen Bereichen (nur 8,7 % für phase-I-)3. Dies lässt sich teilweise durch viele Hindernisse, dass Atherosklerose für effiziente Medikamentenentwicklung einschließlich fast allgegenwärtige Natur, klinisch stumm fortschreiten, und bedeutende Krankheit Heterogenität darstellt. Darüber hinaus kann die suboptimale Gestaltung der präklinischen Untersuchungen an Tieren auch für den mangelnden Erfolg in klinischen Übersetzung berücksichtigt werden. Speziell, glauben wir, dass Interventionsstudien wann immer möglich zu untersuchen, die Wirksamkeit der therapeutischen Strategien umsetzen muss. Außerdem gibt es standardisierte Verfahren für Läsion Analysen einschließlich erweiterte Charakterisierung der Spätphase atherosklerotischen Läsion zelluläre Zusammensetzung von Schicksal-Mapping und Phänotypisierung ausführen müssen.

Die überwiegende Mehrheit der Atherosklerose Studien konzentrieren sich auf Modelle der Atherosklerose Prävention bestehend aus Medikament Behandlung oder gen Manipulation (Ko oder Knock-in) bei gesunden jungen Mäusen, vor der Krankheit Initiation und Progression. Diese Studien haben eine große Anzahl von Genen und Signalmoleküle, die eine in der Entwicklung von Arteriosklerose Rolle entdeckt. Jedoch nicht die meisten dieser Ziele, um effiziente Therapien beim Menschen zu übersetzen. In der Tat ist es schwierig, den Effekt zu extrapolieren, die, den eine Therapie auf gesunde junge Mäuse an älteren Patienten mit fortgeschrittenen atherosklerotische Läsionen hat. Als solche bietet die Durchführung von Interventionsstudien in der präklinischen experimentelle Pipeline wahrscheinlich eine genauere Darstellung der Relevanz und Wirksamkeit eines neuen therapeutischen. Die Idee wird durch die auffallend unterschiedlichen Auswirkungen der Hemmung der Pro-inflammatorischen Zytokin Interleukin-1β (IL-1β) bei einer Prävention4,5,6 oder Intervention Strategie7unterstützt. Unterschiede zwischen Prävention und Interventionsstudien deuten darauf hin, dass verschiedene zelluläre Prozesse auftreten in verschiedenen Phasen der Entwicklung von Atherosklerose und betont, dass Vorbeugung Studien dürften nicht ausreicht, um die klinische Szenario modellieren angemessen.

Die American Heart Association veröffentlichte kürzlich eine wissenschaftliche Erklärung Empfehlungen für geeignete Versuchsanordnung, prozedurale Standardisierung, Analyse und Berichterstattung über tierische Atherosklerose Studien8Detaillierung. Es zeigt die vor- und Nachteile der vorherrschenden Techniken in der Praxis eingesetzt. De Gesicht Sudan IV Färbung der Aorta wird beispielsweise häufig als erste Auslesen durchgeführt. Obwohl de Gesicht Sudan IV Färbung Lipid Ablagerungsrate eine geeignete Methode zur Beurteilung der globalen Plaque Belastung ist, kann er Frühstadium fatty Streak Läsionen von fortgeschrittenen späten Läsionen zu unterscheiden. Als solche ist die Interpretation der En Gesicht Färbung oft mehrdeutig und oberflächliche9. Eine sorgfältige Analyse des Gewebes Querschnitte unter Verwendung der morphologischen Parameter Schiff, Läsion und Lumen Größe und Quantifizierung von Indizes der Läsion Stabilität ermöglicht ein genaueres Verständnis der Wirkung eines Experiments.

Schließlich haben menschliche histopathologische Studien vorgeschlagen, dass zelluläre Zusammensetzung ein besserer Prädiktor der Bruch als die Größe der Läsion, mit Läsionen Armen in glatten Muskelzellen (SMC) und reich an Makrophagen wird anfälliger ist für10Bruch, 11. Diese Beobachtungen beruhten auf Färbung für Markierungen, die klassisch für Zelle Identifikation verwendet (z.B. ACTA2 für SMC und LGALS3 oder CD68 für Makrophagen). Jedoch beschränkt sich der Ausdruck dieser Marker nicht streng auf eine einzelne Zelle in atherosklerotischen Läsionen aufgrund der Plastizität mehrere Linien wie SMC, Endothelzellen und myeloische Zellen12. Insbesondere war die eindeutige Identifizierung des SMC in atherosklerotischen Läsion praktisch unmöglich bis zu den letzten zehn Jahren aufgrund der Eigenschaft dieser Zellen zu Gewebestammzelle und zu unterdrücken ihre Abstammung-spezifische Markergene (ein Prozess bezeichnet als phänotypische Schaltung) verletzten oder erkrankten Gefäße13. Diese Einschränkung bei SMC Identifikation hat durch die Entwicklung der Linie Ablaufverfolgung7,14,15,16,17,18, umgangen worden 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. es besteht aus dauerhaft Kennzeichnung SMC und deren Nachkommen, um ihr Schicksal und phänotypische Evolution während Progression der Atherosklerose zu verfolgen, durch eine Kombination des Ausdrucks der Cre-Rekombinase angetrieben von SMC-spezifische Promotoren (d. h. Myh117,15,17,18,19,20,21,22,23 , 24, Acta225,26 und SM22α14,16) und die Aktivierung der Reporter (z. B. fluoreszierende Proteine, β-Galaktosidase) [überprüft in Bentzon und Majesky 2018-27]. In einer der ersten Studien mit SMC Abstammung Ablaufverfolgung außerhalb der Embryogenese Einstellung lieferte Speer Et Al.14 Beweis, dass SMC ihren Phänotyp und Transdifferentiate in Chondrogenic Zellen während der Gefäßverkalkung mittels modulieren kann ein SM22α Cre R26R LacZ Abstammung Ablaufverfolgung Modell. Obwohl diese Studien SMC Abstammung Ablaufverfolgung Pionierarbeit geleistet, waren sie teilweise nicht eindeutig, dass bestimmten nicht-SMC mit dem Ausdruck ihrer SM22α in der Umgebung von der Krankheit des Reporters beschriftet werden würde. Diese Einschränkung hat durch die Entwicklung und Verwendung von Tamoxifen-induzierbaren Cre ERT/LoxP ermöglicht eine zeitliche Steuerung der Zelle Kennzeichnung umgangen wurden. Zelle Kennzeichnung tritt ausschließlich während Tamoxifen Lieferung und wird auf die Zelle mit dem Ausdruck des Zelle typspezifische Projektträgers fahren Cre ERT Ausdruck zum Zeitpunkt der Tamoxifen Exposition vermeiden Verfolgung alternativer Zelltypen aktivieren Cre in begrenzt sein, die Einstellung des Fortschreitens der Krankheit. Für die Linie Ablaufverfolgung des SMC in Atherosklerose, die Tamoxifen-induzierbaren Myh11- Cre/ERT2 Transgen verbunden mit fluoreszierenden Reporter (eYFP7,15,17,18 , 21, mTmG19,25, Konfetti20,22,23 für klonale Expansion Studien) zeigte eine bemerkenswerte Effizienz und Spezifität in SMC-labeling und hat zum Schicksal Karte SMC Populationen in atherosklerotischen Läsionen in neueren Studien verwendet worden. Wichtig ist, diese Studien ergab, dass: 1) 80 % der SMC in fortgeschrittene atherosklerotische Läsionen tun nicht ausdrücklich alle herkömmlichen SMC-Marker (ACTA2, MYH11) Immunohistologische Analyse verwendet und daher haben würde ohne Abstammung Ablaufverfolgung misidentified wurden 17; (2) Teilmengen von SMC express Marker für andere Zelltypen einschließlich Makrophagen Marker oder mesenchymalen Stammzell-Marker16,17,19; und 3) SMC investieren und bevölkern die atherosklerotische Läsion durch den Oligoclonal Ausbau und SMC Klone behalten Plastizität, Übergang zum phänotypisch verschiedenen Populationen20,23. Zusammenfassend lässt sich sagen, ist es nun klar, dass die glatten Muskelzellen in atherosklerotischen Läsionen eine bemerkenswerte phänotypische Vielfalt zu präsentieren und können vorteilhafte oder nachteilige Rollen auf Läsion Pathogenese abhängig von der Art ihrer phänotypischen Übergänge. Diese Entdeckungen sind eine bemerkenswerte neue therapeutische Allee für targeting SMC Athero-Förderung phänotypische Übergängen in fortgeschrittenen Atherosklerose.

Hier schlagen wir ein standardisiertes Protokoll für die Analyse der Spätphase murinen atherosklerotischer Läsionen einschließlich systematische Methoden für tierischen Dissektion, einbetten, schneiden, färben und Quantifizierung der Brachiocephalic Arterie Läsionen. Um die Wirkung von Interleukin-1β Hemmung auf SMC Schicksal und Phänotyp bestimmen, haben wir SMC Linie nachzeichnen ApoE- / - Mäusen eine westliche Diät gefüttert, für 18 Wochen vor Erhalt wöchentliche Injektionen eines Anti-IL1β Antikörper oder angepasst Isotype IgG-Steuerelements verwendet.

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Protocol

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Tierzucht, Handling und Verfahren wurden von der University of Virginia und der University of Pittsburgh institutionelle Tierpflege und Use Committee genehmigt.

1. Generation der SMC Abstammung Ablaufverfolgung Mäuse

  1. Myh11- Cre/ERT2 Männer28 zu züchten (Jackson Laboratory; #019079) mit R26R EYFP Weibchen (Jackson Laboratory; #006148) zu Myh11- Cre/ERT2+ R26R EYFP+ / + Männchen.
  2. Züchten die Myh11- Cre/ERT2+ R26R EYFP+ / + Männchen mit ApoE- / - weiblichen Mäusen (Jackson Laboratory; #002052). Überqueren Sie die Nachkommen und wählen Sie durch Genotypisierung Myh11- Cre/ERT2+ R26R EYFP+ / + ApoE- / - männlich und R26R EYFP+ / + ApoE- / - weibliche Mäuse als letzte Züchter. Clip-Enden und Genotypisierung auf Wurfgeschwistern durchführen. Alle männliche Mäusen sollte Myh11- Cre/ERT2+ R26R EYFP+ / + ApoE- / - und kann als experimentellen Mäuse (Abb. 1A) verwendet werden.
    Hinweis: Genotypisierung Protokolle finden Sie auf der Website von Jackson Laboratory. Das Myh11 Cre/ERT2 Transgen befindet sich auf dem y-Chromosom, entgegensteht, die Verwendung von Weibchen. Andere Linie Tracing-Systeme verwendet werden, aber dieses System ist bis heute die zuverlässigste Abstammung Ablaufverfolgung Strategie Schicksal Karte SMC in Atherosklerose.

2. glatte Muskulatur Zelle Abstammung-Ablaufverfolgung Maus Diät und Behandlungen

  1. Haben männliche Myh11- Cre/ERT2+ R26R EYFP+ / + ApoE- / - Mäusen erhalten eine Reihe von 1 mg Tamoxifen Injektionen von sechs bis acht Wochen alt sein, um dauerhaft beschriften Myh11+ SMC mit YFP und ihr Schicksal (Abbildung 1 zu verfolgen ( A).
    1. Erdnuss-Öl erhitzen bei 55 ° C.
    2. Fügen Sie Tamoxifen in vorgewärmten Erdnussöl, bereiten die Lösung 10 mg/ml und bis zur vollständigen Auflösung von Tamoxifen bei 55 ° C inkubieren.
    3. Führen Sie eine intraperitoneale Injektion mit 0,1 mL 10 mg/mL Tamoxifen Lösung für eine Serie von zehn Injektionen mehr als zwei Wochen.
      Hinweis: Tamoxifen ist ein Biohazard und muss mit Vorsicht behandelt werden.
  2. Fünf bis sieben Tage nach der letzten Injektion mit Tamoxifen, ersetzen Chow Ernährung mit hohen Fett-Diät (z. B. westliche Ernährung, 42 % kcal aus Fett, 0,2 % Gesamt-Cholesterin) für eine Dauer von 18 Wochen für die Entwicklung von fortschrittlichen atherosklerotische Läsionen, die konsequent entwickelt sich in mehreren vaskulären Betten einschließlich der Aortenbogen, Aortenwurzel, Brachiocephalic Arterie und der Bauchaorta.
  3. 18 Wochen fettreiche Ernährung Fütterung beginnen Sie therapeutischen Intervention für die gewünschte Dauer (Abbildung 1B).
    Hinweis: Als Beispiel führten wir wöchentliche intraperitoneale Injektionen mit Antikörpers Anti-IL1β oder ein angepasst Isotype IgG-Steuerelement zwischen 18 und 26 Wochen der fettreichen Diät.
  4. Entfernen Sie Lebensmittel auf schnelle Mäuse für 8 bis 16 Uhr vor dem Gewebe Ernte um genaue Messwerte für Plasma-Cholesterin und Triglyceride durchzuführen.

3. die Ernte der Brachiocephalic Arterie (BCA)

  1. Tierische Euthanasie sollte Animal Care und Nutzung Ausschuss (ACUC) Anforderungen und Vorschriften folgen. Einschläfern Sie der experimentellen Mäuse CO2 Erstickungstod für ca. 5 Minuten und überprüfen Sie Tod durch Zehe Prise.
  2. Wiegen Sie die Maus und sammeln Sie Blut zu.
    1. Wiegen Sie die Maus
    2. Sprühen Sie die Unterseite der Maus mit 70 % Ethanol
    3. Führen Sie Herzpunktion durch eine 25G Nadel angeschlossen an eine 1 mL Spritze in der Herzkammer von der linken Seite der Brusthöhle. 0,1 bis 1 mL Blut kann abgeholt werden.
    4. Das Blut einer EDTA-Vakuum-Röhre durch Spülen die Spritze und das Rohr auf einer Wippe oder Rotator für 10-15 min.
    5. Übertragen von Blut eine 1,5 mL Tube und Zentrifuge für 10 Minuten 250 X g bei 4 ° C. Vorsichtig abheben der oberen Plasma-Phase mit einer Pipette und entsprechende Tipps, und übertragen auf einen neuen Schlauch. Lagerung bei-20 ° C vor der Messung von Cholesterin und Triglyceriden.
      Hinweis: Vollblut kann für zusätzliche Studien einschließlich Blutbild und übrigen Blutbestandteilen einschließlich Zytokine oder Immunzelle Profilerstellung verwendet werden.
  3. Machen Sie ein Schnitt von ca. 2 cm in der Haut in der Mitte des Bauches mit Schere und ziehen Sie die Haut um die Bauchhöhle verfügbar zu machen. Schneiden Sie das Peritoneum bis zum Brustbein ohne schädliche Gewebe. Machen Sie zwei Einschnitte in der Mitte axillaris-Linie durch den Brustkorb, wobei Sie darauf achten, nicht auf das Herz und die Lunge schädigen.
  4. Heben Sie das Brustbein mit einer Pinzette und schneiden Sie die Membran, die das Herz teilweise aussetzen. Wenn das Herz nicht leicht zugänglich ist, schneiden Sie den Brustkorb genug, den rechten Vorhof zu erreichen.
  5. Durchspülen der Maus mit einem Schwerpunkt Perfusion System (Abb. 2A). Installieren Sie die Schwerkraft Perfusion System, so dass der Druck der Flüssigkeit Perfusion der murinen mittlere Blutdruck (Abbildung 2B) entspricht. Dieses System ermöglicht die Konsistenz der Perfusion und beide unterhält das Schiff Morphologie und Flushes roten Blutkörperchen.
    Hinweis: Als Referenz, C57Bl6 Mäuse haben einen physiologischen Blutdruck zwischen 120 MmHg (mittlere systolische Blutdruck) und 70 MmHg (durchschnittliche diastolische Blutdruck)29,30. Durchschnittlichen systolischen und diastolischen Blutdruck kann mit der Maus genetischen Hintergrund variieren.
    1. Schließen Sie ein 23 oder 25G Schmetterling Nadel, um die Schwerkraft Perfusion System und führen Sie Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) durch die Nadel, die Luft aus den Rohren zu vertreiben. Stechen Sie die Nadel in die linke Herzkammer und sichern Sie die Nadel im Ort zu. Mit Iris-Schere, machen Sie einen kleinen Schnitt (< 2 mm) in den rechten Vorhof oder der Aorta ascendens.
    2. Durchspülen Sie mit 5 mL PBS, dann 10 mL 4 % Paraformaldehyd (PFA) Lösung, dann 5 mL PBS. Verwenden Sie PBS und 4 % PFA-Lösung bei Raumtemperatur.
    3. Sammeln Sie die Gewebe von Interesse (z. B. Leber, Lunge, Milz) und legen Sie sie in die 4 % PFA-Lösung.
  6. Aussetzen der BCA
    1. Reinigen Sie den Hals-Bereich durch Entfernen der Haut und Speicheldrüsen.
    2. Führen Sie eine abgespeckte der Mittellinie des Brustbeins durch das Manubrium mit einer Schere. Achten Sie darauf, dass die Schere in der Nähe von der Rückseite des Brustbeins zu beschädigen das Gefäßsystem befindet sich genau unter dem Brustbein bleiben. Ziehen Sie beide Seiten des Brustkorbs mit der Pinzette die Brusthöhle zu öffnen. Halsschlagadern ist teilweise sichtbar.
    3. Bereinigen Sie durch Ziehen von Muskeln und Bindegewebe und Fett mit einer feinen Pinzette entfernen, bis die richtige carotis, die Brachiocephalic Arterie der subclavian Bifurkation und der Aortenbogen gereinigt und der umliegenden Bindegewebe und Fett (Abbildung isoliert sind 2C).
  7. Entfernen der BCA
    1. Mit Pinzette, schnappen Sie sich die richtige carotis unterhalb der Bifurkation und machen Sie einen erste Schnitt oberhalb der Zange (Abb. 2D).
    2. Machen Sie noch in der Hand der carotis, einen zweiten Schnitt durch die subclavia. Die letzten zwei Kürzungen sind durch den Aortenbogen, auf beiden Seiten der Brachiocephalic Arterie (Abbildung 2D).
    3. Sammeln Sie andere Vascular Gewebe von Interesse (z. B. Bauchaorta, überlegenen Teil des Herzens, die die Aortenwurzel enthalten).
    4. Legen Sie die BCA und anderen Geweben in 4 % PFA Lösung über Nacht bei Raumtemperatur.
      Hinweis: Die Fixierzeit sollte während der gesamten Studie konsistent gehalten werden.

(4) Gewebe Verarbeitung und Schnitt

  1. Entfernen Sie das Gewebe aus 4 % PFA und in einer beschrifteten Gewebe Kassette(Abbildung 3). Einsatz-Schaumstoff-Pads in der Kassette um das Gewebe zu gewährleisten behalten ihre Ausrichtung und bleibt in der Kassette durch den Verarbeitungsschritt (Abbildung 3B). Schließen Sie die Kassetten und tauchen ein in 70 % igem Ethanol bis Gewebe Verarbeitung (24 bis 72 h).
    1. Prozess-BCA und anderen Geweben gesammelt für histologische und immunofluorescent Färbung wie folgt (Beispiel für Übernachtung Routineverfahren mit einem Prozessor mit Vakuum Penetration): 10 % Neutral gepufferte Formalin für 30 min bei Raumtemperatur (2 X), 75 % Ethanol für 60 min. bei 30 ° C (1 X), 90 % Ethanol für 60 min. bei 30 ° C (1 X), 95 % igem Ethanol für 60 min. bei 30 ° C (1 X), 100 % Ethanol für 60 min. bei 30 ° C (3 X), Xylol für 60 min. bei 30 ° C (3 X) und Paraffin fur 80 min auf 62 ° C (3 X).
  2. BCA vertikal, mit dem Aortenbogen am nächsten an den Block Gesicht (Abb. 3C) einbetten.
  3. Schnitt durch den Paraffinblock auf einer rotierenden Mikrotom (10 µm Dicke) bis zum Erreichen der eingebetteten Gewebe.
  4. Sobald das Gewebe sichtbar ist, untersuchen Sie einen Abschnitt unter dem Mikroskop zur Positionsbestimmung. Wenn der Aortenbogen noch sichtbar ist, entfernen Sie nacheinander, Prüfung einen Abschnitt bei jedem Intervall bis zu zehn 10 µm.
  5. Wenn der Aortenbogen durch geschnitten wurde hat und die Brachiocephalic Arterie sichtbar ist, passen Sie die Ausrichtung des Blocks, das Gewebe vollständig senkrecht auf dem Mikrotom Klinge zu positionieren.
  6. Schneiden Sie die BCA eine Dicke von 10 µm. An diesem Punkt werden alle Abschnitte seriell mit drei Abschnitte pro Folie gesammelt. Sammeln Sie bis zum Erreichen der subclavian Bifurkation (Abbildung 3D).
    Hinweis: Es ist wichtig, die BCA auf eine Dicke von 10 µm für nachfolgende Z-Stapel konfokale Bildaufnahme und einzelne Zellzählung schneiden. Diese Stärke wird die strenge und nicht cofounding Bewertung der Vereinigung zwischen einem einzelnen Kern und zytoplasmatischen oder Membran Färbung aber die Tiefe des Querschnitts ermöglichen.

5. Immunofluorescent Färbung

Hinweis: Eine vollständige Charakterisierung von atherosklerotischen Läsionen umfasst Bewertung der morphologischen Parametern und Indizes der Plaque Stabilität oder Instabilität und zelluläre Zusammensetzung, die nicht im Mittelpunkt dieses Protokolls werden. Läsion Morphologie, Kollagengehalt und Intraplaque Blutungen können durch Movat7,17, PicroSirius rot 7,31, Ter119 Färbung 7,18, analysiert werden. Hier beschreiben wir das Protokoll für die Analyse der zellulären Zusammensetzung der Läsionen.

  1. Inkubieren Sie die Folien in den folgenden Lösungen bei Raumtemperatur unter einer chemischen Haube: Xylol für 5 min (2 X), 100 % Ethanol für 5 min (2 X), 95 % igem Ethanol für 5 min (2 X), 70 % Ethanol für 5 min (2 X) und deionisiertes H2O (DiH2O) für 5 min (2 X).
  2. Inkubieren Sie Folien in Antigen Retrieval Lösung gemäß Anweisungen des Herstellers.
    1. Mit Zitronensäure-basierten Antigen Demaskierung Lösung (siehe Tabelle der Materialien), 3 mL der Lösung in 320 mL DiH2O. Ort der Folien in einer Färbung Behälter und füllen an die Spitze mit der vorbereiteten Antigen Retrieval Lösung verdünnen.
    2. Füllen Sie keine leeren Slots in der Dia-Rack mit leeren Folien zu gewährleisten gleichmäßige Erwärmung. Decken Sie den Container mit einem Deckel zum Antigen Retrieval Lösung ohne Verdampfung aufkochen lassen.
    3. Erhitzen Sie die Folien in einer Mikrowelle für 20 min bei ca. 675-700 Watt. Überprüfen Sie die Folien regelmäßig und ersetzen Sie verdunstet Flüssigkeit mit DiH2O solche, die Abschnitte bleiben in getaucht Demaskierung Lösung jederzeit.
    4. Lassen Sie Folien in Lösung für 1 h bei Raumtemperatur abkühlen.
  3. 6 g Haut Fischgelatine (FSG) in 1 L des PBS auflösen. PBS/FSG dient als Waschpuffer. Bereiten Sie eine blockierende Lösung 10 % normalen Serum in PBS/FSG.
    Hinweis: Fischgelatine Haut wird bei der Vorbereitung des Puffers blockierende verwendet. FSG enthält keine Serum-Proteine, die mit Säugetieren Antikörpern Kreuzreaktion können Hintergrundgeräusche zu minimieren. Jedoch vorzuziehen andere blocking-Option mit Biotin Nachweissysteme da FSG endogene Biotin enthält. Die Art der normalen Serum verwendet basiert auf den sekundären Antikörper verwendet. Wenn Esel Sekundärantikörper verwendet werden, sollte normales Pferd Serum für die Sperrung und Antikörper-Verdünnungen gewählt werden.
  4. Inkubieren Sie Folien mit PBS-Puffer für 5 min bei Raumtemperatur. Kreis Gewebeschnitte mit einem hydrophoben Stift. Sollte in den Kapiteln mit den blockierenden Puffer PBS/FSG/Normal Serum für 1 h bei Raumtemperatur. Bereiten Sie die Primärantikörper Lösung im PBS/FSG/Normal Serum während dieses Schrittes, während das Gewebe blockieren.
  5. Brüten Sie mit Primärantikörpern verdünnt in PBS/FSG/Normal Serum über Nacht bei 4 ° C in einer feuchten Kammer. Einen Abschnitt pro Folie sollte mit einer Mischung aus Kontrolle-IgG-Antikörper bei der gleichen Konzentration als der primäre Antikörper zu Steuerung für Primärantikörper Spezifität inkubiert werden.
  6. Waschen Sie die Folien wie folgt bei Raumtemperatur: PBS/FSG für 5 min (3 X), dann PBS für 5 min (1 X).
  7. Inkubieren Sie mit Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper (siehe Tabelle der Materialien) und Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Kern Gegenfärbung verdünnt in PBS/FSG/Normal Serum für 1 h bei Raumtemperatur. Schützen Sie Folien vor Licht.
  8. Waschen Sie Folien, wie im Schritt 5.6 beschrieben.
  9. Folien mit Einbau Medien geeignet für Fluoreszenz zu montieren (siehe Tabelle der Materialien).

6. der konfokalen Mikroskopie

Hinweis: Die Verwendung von einem confocal Mikroskop und Z-Stapel-Akquisition ist entscheidend für einzellige zählen.

  1. Erwerb Parameter während der gesamten Studie verwendet werden: Bild-Auflösung (1024 x 1024 oder 2048 x 2048 Pixel); Strahlengang und Anzahl der Kanäle, die eine Funktion aus der Kombination der Sekundärantikörper ausgewählt sind; Scan-Geschwindigkeit (empfohlen, Scan-Geschwindigkeit: 7-8); und differential Interferenz-Kontrast (DIC)-Kanal.
  2. Stellen Sie Abschnitte, befleckt mit dem primären Antikörper und IgG-Steuerelement verwenden, Detektorempfindlichkeit, Laserleistung und Offset für jeden einzelnen Kanal. Das IgG-Steuerelement wird verwendet, um das Hintergrundsignal zu minimieren.
  3. Richten Sie den oberen und unteren Positionen für Z-Stapel-Erwerb. Bestimmen Sie die Stärke und Anzahl der Stapel zu erwerben. Diese Parameter sollten während der gesamten Studie konsistent bleiben.
    Hinweis: Wir empfehlen bildgebenden 8 bis 10 Stapel von 1 µm Dicke. Bleiben Sie konsequent in die Anzahl der Stapel abgebildet während der gesamten Studie.
  4. Bild Gewebeschnitte mit primären Antikörper und IgG-Kontrolle für alle Kanäle, einschließlich DIC befleckt.
  5. Beschriften Sie mindestens ein Bild mit einen Maßstab für die Bild-Kalibrierung während der einzelnen Zelle zählen.

7. einzelne Zellzählung

  1. Installieren Sie und öffnen Sie ImageJ. Falls erforderlich, download Plugins im Abschnitt Herunterladen > Input/Output die ImageJ Website, um die Image-Datei öffnen erzeugt je nach Format der Bilder durch das konfokale Mikroskop erzeugt.
  2. Öffnen Sie die Bilddatei in ImageJ.
  3. Kalibrieren Sie das Bild mit einem Bezugsmaßstab bar mit dem Bild in 6.6erzeugt.
  4. Abzugrenzen Sie die Region von Interesse in dem einzigen Zellzählung mit durchgeführt wird des DIC-Kanals (Abbildung 4).
    Hinweis: Eine Region kann zu einem Zeitpunkt abgegrenzt werden. Abhängig von den experimentellen Fragen, einzelne Zelle zählen kann erfolgen im Bereich der gesamten Läsion (siehe 7.3.1) und/oder in eine weitere der Läsion. (Siehe 7.3.2) ist beispielsweise Untersuchung des Bereichs fibröse Kappe besonders relevant da die zelluläre Zusammensetzung ein wichtiger Index der Läsion Neigung ist zu Bruch.
    1. Abzugrenzen Sie Bereich der Läsion nach der Lumen-Grenze (Abbildung 4A; weiße Pfeile) und der internen elastischen Lamina (Abbildung 4A, gelbe Pfeile) sichtbar auf das DIC-Bild.
    2. Bestimmen Sie für die Analyse des Gebiets fibröse Kappe die Grenze von 30 µm aus dem Lumen entfernte und nachzeichnen Sie die Begrenzung ( Abbildung 4B-D).
      Hinweis: Die fibröse Kappe Bereich klassisch der Region bereichert in ACTA2 + Zellen und Kollagen unterlegen das Lumen (Abbildung 4B) bezeichnet. Die Anreicherung in ACTA2 + Zellen und Kollagen spielt eine entscheidende Rolle in der Läsion Stabilität. Frühere Studien haben festgestellt, dass die ACTA2 + Reich fibröse Kappe Zellbereich eine Dicke von 30 µm aus dem Lumen in SMC-Linie im Durchschnitt tracing ApoE- / - Mäusen gefüttert eine fettreiche Diät für 18 bis 26 Wochen (Abbildung 4C). Akribische Charakterisierung der Auswirkungen der Genmanipulation oder pharmakologische Behandlung auf die fibröse Kappe Bereich zelluläre Zusammensetzung ist so bemerkenswert relevant.
  5. Öffnen Sie die Kanäle Werkzeugbedienfeld (Bild > Farbe > Kanal Tools) und die anderen Pseudo-Farbe färben Kanäle (Abbildung 5A; Kasten 1).
  6. Verschmelzen die Farbkanäle (Bild > Farbe > Zusammenführen Farben) (Abb. 5A; Kasten 2). Alle Kanäle sollten auf dem gleichen Bild (Abb. 5B) sichtbar. Aktivieren Sie und Deaktivieren einzelner Farbkanäle im Bedienfeld Werkzeuge Kanal (Abb. 5A; Kasten 1).
  7. Richten Sie die Zählung Werkzeug.
    1. Rechtsklick auf das Counting -Symbol in der Symbolleiste (Abbildung 5C; Kasten 1) und Multi-Point-Werkzeugauswählen.
    2. Klicken Sie doppelt auf das gleiche Symbol öffnen Sie den Punkt Tool -Fenster (Abbildung 5C; Kasten 2).
    3. Wählen Sie die Art und Größe der Elemente verwendet, um Zellen zu zählen.
    4. Überprüfen Sie Alle anzeigen.
  8. DAPI-Kanal nur im Kanal Werkzeugfenster aktivieren Sie und wählen Sie den Zähler-Kanal 0 (Abbildung 5C; Kasten 3). Klicken Sie auf einzelne Kerne, die markiert werden (z. B. gelbe Punkte in Abbildung 5C-D). Blättern Sie Z-Stapel zählen alle Kerne gebeizt in der Region von Interesse. Die Anzahl der Ereignisse ist unter dem Ladentisch Kanal in Point Tool -Fenster (Abbildung 5C; Kasten 4) angegeben.
  9. Eine andere Färbung Kanal schalten (z. B. eYFP Färbung). Wählen Sie den Zähler-Kanal 1. Klicken Sie auf Zellen, in denen gibt es eine NS1 zwischen DAPI und Färbung. Für zytoplasmatischen Färbung, wählen Sie Zellen mit Färbung umgibt den Kern über die gesamte Tiefe des Kerns (überprüfen Sie mehrere Z-Stapel).
  10. Wiederholen Sie durch Änderung der Färbung Kombinationen und Auswahl neuer Zähler Kanäle, die Zell-Populationen von Interesse zu zählen. Jeder Punktfarbe repräsentiert eine andere Zellenbevölkerung (Abbildung 5D). Ergebnisse können als Anzahl der Zellen, die Gesamtzahl der DAPI oder Anzahl der Zellen zu Gebiet ausgedrückt werden.

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Results

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Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe- / - Mäuse wurden injiziert mit Tamoxifen zwischen sechs und acht Wochen alt vor, eine fettreiche Diät gefüttert. 18 Wochen fettreiche Ernährung Fütterung wurden zwei Gruppen von acht Mäuse wöchentlich mit einer Maus monoklonalen Anti-IL-1β Antikörper oder ein angepasst Isotype IgG-Kontrolle bei 10 mg/kg für 8 Wochen (Abbildung 1)7behandelt. Mäuse wurden geopfert und mit 4 % PFA-PBS-Lö...

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Discussion

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Trotz jahrzehntelanger Forschung und technische Fortschritte in der Atherosklerose zu studieren hat das Feld eine enttäuschende Geschichte der Übersetzung wissenschaftlicher Erkenntnisse auf Therapien34,35. Dieses Phänomen kann teilweise durch Diskrepanzen in Tiermodellen, experimentellen Designs und Läsion Analysen erklärt werden. Hier beschreiben wir eine experimentelle-Pipeline, die wir, die zelluläre Zusammensetzung in fortgeschrittene atherosklerotische Läsi...

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

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Wir danken die Mitte für biologische Bildgebung (unterstützt von NIH 1S10OD019973-01) an der University of Pittsburgh für ihre Unterstützung. Diese Arbeit wurde unterstützt durch stützt sich auf wissenschaftliche Development Grant 15SDG25860021 von der American Heart Association, D.G. R.A.B wurde durch NIH gewähren F30 HL136188.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
16% wässrige Paraformaldehyd-LösungElektronenmikroskopie SciencesRT 15710Gewebeperfusion und -fixierung
23G SchmetterlingsnadelFisherBD367342
25GNadel Fisher14-821-13D 
A1 Konfokales MikroskopNikonKonfokalmikroskop
ACTA2-FITC Antikörper (Maus)Sigma AldrichF3777Primärer Antikörper
Alexa-647 Anti-ZiegeInvitrogenA-21447Sekundärer Antikörper
Antigen-Demaskierungslösung, ZitronensäurebasisVector LabsH-3300Antigen-Rückgewinnungslösung
Chow DietHarlan TekladTD.7012
DeckglasFisher12-544-14Beliebiges 50 x 24 mm Deckglas
DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid)InvitrogenD1306Nucleus fluoreszierende Gegenfärbung
Esel Alexa-488 Anti-KaninchenInvitrogenA-21206Sekundärantikörper
Esel Alexa-555 Anti-RatteAbcamab150154Sekundärantikörper
DPBS 10X ohne Calcium und MagnesiumGibco14200166PBS für Lösungsverdünnungen und Waschungen. In entionisiertem Wasser auf 1x verdünnen
EinbettkassetteFisher15-182-701D
ETDA VakuumröhreFisher02-685-2B
Ethanol 200 proofDecon2701
SchaumstoffpolsterFisher22-222-012
Gelatine aus KaltwasserfischhautSigma AldrichG7765
GFP Antikörper (Ziege)abcamab6673Primärer Antikörper
Ziege IgG-KontrolleVector LabsI-5000IgG-Kontrolle
Fat DietHarlan TekladTD.88137
ImageJNIHComputerprogramm https://imagej.nih.gov/ij/ 
LGALS3 Antikörper (Ratte)CedarlaneCL8942APPrimärer Antikörper
LSM700 KonfokalmikroskopZeissKonfokalmikroskop
Objektträger, Superfrost PlusFisher12-550-15
MikrotomklingenFisher30-538-35
Maus IgG-SteuerungVector LabsI-2000IgG-Steuerung
NIS-Element-Imaging-SoftwareNikonImaging-Software für die Z-Stack-Bilderfassung
Normales PferdeserumSigma AldrichH1270
PapPen Fisher50-550-221
ErdnussölSigmaP2144
Prolong Gold Antifade-EindeckmittelInvitrogenP36930Eindeckmedium 
Kaninchen IgG KontrolleVector LabsI-1000IgG Kontrolle
Ratte IgG KontrolleVector LabsI-4000IgG Kontrolle
RUNX2 Antikörper (Kaninchen)Abcamab192256Primär Antikörper
Spritze BD3096281 ml Spritze
TamoxifenSigmaT5648
XylolFisherX55K-4
Zen-Imaging-SoftwareZeissImaging-Software für die Z-Stack-Bilderfassung
High

References

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