Summary
פרוטאום אפיון של מיטות microvascular עינית היא גורלית להבנה מעמיקה של פתולוגיות עינית רבים בבני אדם. מחקר זה מדגים שיטה יעילה, מהירה, חזקה עבור חילוץ חלבון, הכנת הדוגמא של כלי דם קטנים העסקת חזירי קצר האחורי ciliary העורקים ככלים מודל עבור פרוטאומיקס מסה ספקטרומטר מבוססת על ניתוח.
Abstract
השימוש מבודד כלי הדם עינית במבחנה לפענח המדינה pathophysiological של העין באמצעות גישות טכנולוגי מתקדם התרחב באופן משמעותי את ההבנה שלנו של מחלות מסוימות. ספקטרומטר מסה (MS)-מבוסס פרוטאומיקס התפתחה כלי רב עוצמה כדי לפענח שינויים המנגנונים המולקולריים וחלבון איתות המסלולים על המיטות כלי הדם על בריאות ומחלה. עם זאת, דוגמת שלבי הכנה לפני ניתוחים MS מכריעים להשיג תוצאות לשחזור הבהרה מעמיקה של פרוטאום מורכבים זה חשוב במיוחד עבור הכנת microvessels עינית, הוא מוגבל בהן לפיכך, מציב אתגר לחילוץ חלבון אופטימום כמות הדגימה זמין עבור ניתוחים. מאמר זה במאמצים לספק פרוטוקול יעיל, מהיר וחזק עבור הכנת הדוגמא של retrobulbar למופת עינית וסקולרית מיטה העסקת חזירי קצר האחורי ciliary העורקים. שיטת הנוכחי מתמקד חלבון מיצוי ההליכים, החל תגובת שיקוע והן צניפה המדגם בעקבות המגון, לטעום ניקוי עם התקנים צנטריפוגלי מסנן לפני חד-ממדי ג'ל אלקטרופורזה וטיהור פפטיד פעולות עבור כימות ללא תווית בתוך מערכת MS כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית electrospray מלכודת יונים יינון-ליניארי-Orbitrap. למרות ששיטה זו פותחה במיוחד עבור פרוטאומיקס ניתוחים של microvessels עינית, סיפקנו גם ראיות משכנעות כי זה יכול גם להיות ברצון מועסק לדוגמאות אחרות מבוססות-רקמות.
Introduction
קידום בתחום פרוטאומיקס, אילו היתרים משולב, מתחרות כוח אוסף נתונים, יש מהפכה באופן משמעותי הבנתנו המנגנונים המולקולריים שבבסיס תנאים מסוימים המחלה גם כמו המשקף מצב פיזיולוגי של תא מסוים באוכלוסייה או רקמות1,2,3,4. פרוטאומיקס הוכיח גם את פלטפורמת חשוב במחקר אופטלמולוגיות בשל רגישות וניתוח לא משוחדת של דגימות עינית שונים פוריה זיהוי של סמני המחלה פוטנציאלי בסופו של דבר האבחנה והפרוגנוזה, כמו שמעידים באלגנטיות מחקרים רבים בשנים האחרונות, ובהם כמה שלנו1,5,6,7,8,9,10. זאת, לעתים קרובות קשה להשיג דגימות אנושי עבור ניתוחים פרוטיאומיה מבנית מסיבות אתיות, במיוחד בהתחשב בצורך חומר שליטה אנשים בריאים עבור ניתוח השוואתי אמינים. מצד שני, זה גם מאתגר כדי לקבל כמות מספקת של הדוגמאות עבור ניתוחים spectrometric המוני ואמינה של האופטימלית. דבר זה חיוני במיוחד עבור מסה-מוגבלת חומרים ביולוגיים כגון מיקרו-הדם של העין. אחד כזה גדול retrobulbar כלי דם שמשחק תפקיד מרכזי בוויסות זרימת הדם עינית הוא העורק ciliary אחורי קצר (צער בעלי חיים). כל ההפרעות או חריגות במיטה כלי הדם הזה עלול לגרום השלכות קלינית חמורה, אשר יכול להוביל בפתוגנזה של כמה מחלות סכנת הראיה כגון גלאוקומה, nonarteritic anterior נוירופתיה אופטית איסכמי (NAION)11 , 12. עם זאת, יש מחסור של מחקרים שחקרתי את השינויים פרוטאום הטימב עורקי עקב החסרונות הנ ל. לכן, בשנים האחרונות חזיר הבית (Sus scrofa דומסטיקה ליניאוס, 1758) התפתחה מודל בעלי חיים במחקר אופטלמולוגיות בשל הדמיון מורפולוגיות ו פילוגנטי גבוהה בין בני אדם, חזירים13, 14,15. דוגמאות עינית חזירי זמינים בקלות והכי חשוב, הם ייצוג מדויק יותר של רקמות.
בהתחשב בתפקידו החשוב של אלו כלי דם בעיניים, כמו גם על מחסור של מתודולוגיה ששירתה עבור חילוץ יעיל חלבון וניתוחים מן microvessels הללו, אנו קודם לכן שאפיינו את פרוטאום של לאגודת צער בעלי חיים חזירי משתמש ללא צורך במיקור חוץ פרוטוקול שתוצאתם הזיהוי של מספר גבוה של חלבונים16. בהתבסס על מחקר זה, יש נוספים מיטוב ואנו תיאר מעמיק את המתודולוגיה שלנו במאמר זה, המאפשר ניתוח פרוטאום של כמויות זעירות של דגימות באמצעות לאגודת צער בעלי חיים חזירי כמו מודל רקמות. אמנם המטרה העיקרית של מחקר זה היה להקים מתודולוגיה התואמים ל- MS כלי הדם עינית מסה-מוגבלת, סיפקנו ניכר ראיות כי זרימת העבודה המתוארת ניתן גם בהרחבה להחיל על מדגמים שונים מבוססי רקמות.
זה נמצא שחזה כי זרימת עבודה זו תהיה אינסטרומנטלי הכנת איכותיים התואמים ל- MS דגימות כמויות קטנות של חומרים עבור ניתוחים פרוטאום מקיף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים ניסיוני באמצעות דגימות בעלי חיים בוצעו תוך הקפדה על האגודה לחקר חזון והצהרת רפואת עיניים (ארוו) שימוש של החיות לרפואת עיניים ומחקר חזון ועל ידי המוסדיים הנחיות. מחקר זה נערך ו אישר את מחלקת עיניים, אוניברסיטת מיינץ מרכז רפואי.
הערה: העיניים חזירי יחד עם עצב הראייה ורקמות extraocular התקבלו ומחונך לשוק המקומי מיד פוסט-מורטם. עיניים enucleated היו מועברים למעבדה בתוך תמיסת מלח קרה כקרח פוספט buffered (PBS), שימוש באופן מיידי. סקירה סכמטי של זרימת העבודה מועסק הוא כפי המתואר באיור1.
1. פתרונות
- כדי להכין קרבס-Henseleit (K-H) מאגר, שוקל את הכימיקלים הבאים (27.68 גר' NaCl, 8.4 גר' NaHCO3, g 1.4 של אשלגן כלורי, 1.18 גרם MgSO4ו 0.64 גרם2פו ח'4) לתוך שפופרת אחת של חרוט צנטריפוגה יבש ונקי 50 מל ו , 1.47 אינץ g CaCl2 ו- 8.0 גר' גלוקוז לתוך צינור אחר.
הערה: תערובת אבקות של כימיקלים אלה יש לאחסן במקום קריר ויבש. התערובת אבקת CaCl2 וגלוקוז הכי מוכן טרי כדי למנוע ספיגה של נוזלים, הצליעה. - כדי להכין 200 µL של מיצוי 2A מאגר צניפה לדגימה, לערבב 100 µL של חילוץ µL מאגר 2 ו- 100 של ריאגנט A מ החילוץ טראנסממברנלי קיט (ראה B6 טבלה של חומרים).
הערה: Aliquot המרכיבים של ערכת חילוץ טראנסממברנלי הכוללת מאגר חילוץ 2, ריאגנט של מעכבי פרוטאז קוקטייל לתוך העבודה חלקים וחנות ב-20 ° C עבור ממושכת לשימוש. הימנע חוזרות הקפאה והפשרה. להפשיר את ריאגנטים לטמפרטורת החדר (RT) לפני תחילת ההליך החילוץ גלולה. - כדי להכין פתרון אמוניום ביקרבונט (ABC, 100 מ מ), לפזר 0.39 g של ABC ב- 50 מיליליטר מים יונים.
- כדי להכין 10 מ מ 1, 4-dithiothreitol (DTT) פתרון, לפזר 30 מ"ג של DTT ב- 20 מ של 100 מ מ ABC.
- כדי להכין 55 מ"מ Iodoacetamide (רשות העתיקות) פתרון, להמיס 200 מ ג של רשות העתיקות ב- 20 מ של 100 מ מ ABC.
הערה: רשות העתיקות חייב להישמר בחושך. השתמש רדיד אלומיניום כדי לעטוף את הצינורות עם פתרונות רגישים לאור. - הכנת מאגר טריפסין המכיל 10 מ מ ABC ו- 10% (vol / כרך) acetonitrile (לחצן מצוקה). להוסיף 1.5 מ של טריפסין מאגר לתוך בקבוקון אחד של 20 µg של טריפסין כדי להמיס את התוכן שלה כדי להכין הפתרון עובד טריפסין 13 ng/µL.
הערה: קביעת רצף כיתה ששינה טריפסין מסופק lyophilized ויש לאחסן ב-20 ° C עד השימוש. - כדי להכין מאגר החילוץ פפטיד, מערבבים 1:2 (v/v) של חומצה פורמית 5% עם לחצן מצוקה.
הערה: להכין כל הפתרונות בשלבים 1.3-1.7 טריים רק לפני השימוש, למחוק את כל אמצעי אחסון שאינו בשימוש. - כדי להכין 0.1% חומצה trifluoroacetic (TFA), מערבבים µL 10 של TFA עם 10 מ"ל מים יונים.
2. בידוד עורקי קצרות Ciliary האחורי
הערה: העין חזירי מחולק בעצם הקדמי (איור 2א) וסעיפים האחורי (איור 2B).
- מקום העולם העין בחדר דיסקציה המכיל מאגר K-H קר כקרח. בזהירות לחתוך משם שמסביב שרירים ורקמות עם זוג מספריים חדות מאיו.
- בחתך עם איזמל וחותכים כדור הארץ לאורך קו המשווה עם זוג מספריים חדות מאיו, עד העין מחולק את החצאים anterior ואת אחורי. הסר כגוף בזגוגית הרבה ככל האפשר מן החצי האחורי של העין באמצעות זוג מלקחיים דפוס רגיל.
הערה: ההפרדה של גלוב העין לשני חצאים מקלה על בידודו של צער בעלי חיים בקלות מבלי בעין זז בצלחת לנתיחה. עם זאת, השלב זה אינו חובה. כלי ניתן גם מבודד מבלי לפתוח את העולם העין. - השתמש פיני לנתיחה בקפידה pin למטה החלק האחורי של העין עם הצד רשתית העין למטה, עצב הראייה פונה כלפי מעלה לכיוון הנסיין.
- חותכים בעדינות משם אל רקמות המקיפים את עצב הראייה כדי לחשוף את כבסיס להערכת retrobulbar עם זוג מספריים האביב סטודנט Vannas.
- ניתן לראות לאגודת צער בעלי חיים ענפים קצרים של כלי (בין 5-8 סניפים) circumferentially הקף ראש עצב הראייה (איור 2C) ולחבר את sclera. לבודד את paraoptic ואת דיסטלי צער בעלי חיים יחד עם רקמות מסביב עם זוג סוג 5 דיוק פינצטה ומספריים capsulotomy Vannas (איור 2D).
הערה: ודא כי המאגר K-H נשאר קר כקרח לאורך כל ההליך בידוד. מומלץ מאוד לשנות המאגר כל 20-30 דקות, בהתאם טמפרטורת הסביבה.
3. הכנת הדוגמא
- בעדינות להסיר רקמות החיבור של המקטעים העורקים באמצעות תוספת הקנס שקצהו סוג 5 דיוק פינצטה ומספריים capsulotomy Vannas תחת stereomicroscope ולשטוף את העורקים מבודדים ב- PBS קר כקרח כדי להסיר לכלוך ודם משקעים.
הערה: אם הדגימות לא נתון אל השלבים הבאים מיד, snap-להקפיא אותם חנקן נוזלי, בחנות-80 ° C עד שימוש נוסף. - בריכת העורקים של שתי עיניים כדי להשיג אחד שכפול ביולוגי, להעביר אותם לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 mL, ולשקול את הדגימות באמצעות איזון האנליטי.
- כדי כל שפופרת, להוסיף תערובת של חרוזים זירקוניה 0.5 מ מ ו- 1.0 מ מ, ואחריו רקמת החלבון החילוץ ריאגנט (T-לכל; ראה B7 טבלה של חומרים).
הערה: הנפח של T-PER הוא תלוי משקל הדגימות ב כל שפופרת, עם יחס של 1 מ"ל של ריאגנט 50 מ ג של הדגימה. כללי אצבע כדי לעקוב אחר בעת טעינת צינורות המגון הוא יחס נפח של 1:1:2 = מדגם: חרוזים: T-לכל (איור 3א). אל תשתמש גדול מדי נפח של המאגר החילוץ וכמות קטנה מדי של חרוזים כדי למנוע המגון לא יעיל. - לטעון את צינורות מדגם לתוך מהמגן בלנדר (ראה D6 טבלה של חומרים). את הטיימר לרמה 2 דקות ומהירות 6 ולהתחיל, המגון. לאחר ריצה, בדיקת הדגימות המגון מלאה, אני חוזר מחזור עד דגימות הן לחלוטין הומוגני (איור 3ב).
הערה: יכול להיות הומוגני סך של צינורות מדגם 24 בהפעלה אחת. חשוב לשמור את הדוגמאות קר במהלך ההליך המגון למזער דנטורציה של חלבונים. מהמגן בלנדר הכדור השתמשו במחקר זה כולל תכונה קירור הגלום שמחזיק את הדגימות קר. במקרים בהם אין תכונה קירור פנימיים זמין מהמגן, דוגמאות ניתן לשמור על הקרח בין כל הפעלה. - בזהירות פיפטה homogenate לתוך צינורות microcentrifuge טריים. צנטריפוגה דגימות ב 10,000 x g למשך 20 דקות ב 4 ° C כדי הצניפה חלבונים לא מסיסים ו תגובת שיקוע נפרד המכיל חלבונים מסיסים. בזהירות פיפטה החוצה תגובת שיקוע לתוך צינורות microcentrifuge טריים בלי לגעת השכבה גלולה (איור 3ג').
הערה: תגובת שיקוע וגם צניפה שניתן לאחסן ב- 80 ° C עד שימוש נוסף.
4. גלולה עיכול
- להוסיף 200 µL של מיצוי מאגר 2A ו- 5 µL של מעכב פרוטאז קוקטייל כל מדגם גלולה. להשעות בגדר מספר פעמים עם פיפטה.
הערה: מערבבים את ריאגנטים מיצוי טוב לפני הוספת בגדר. שתמשיכו החילוץ 2A מאגר על קרח, של מעכבי פרוטאז RT לאורך כל ההליך החילוץ. -
השתמש מהמגן אולטרה סאונד כדי homogenize לחלוטין בגדר.
- הגדר את משרעת 60 ו מחזור 1. השתמש בדיקה העשוי טיטניום (Ø 0.5 מ מ, 80 מ מ אורך), אשר מתאים המגון דגימות עם כמויות קטנות (10-500 µL).
- לטבול את החללית בתערובת מאגר צניפה והפקת ולחץ על לחצן start כדי לחשוף את הדגימה כדי גלי אולטראסאונד.
- Sonicate המדגם ובודקים כגיהנום צניפה הם לחלוטין. להשהות למשך כמה שניות בין כל sonication.
- בדוק אם יש להשלים המגון מבחינה ויזואלית. מערבבים את homogenate מספר פעמים עם פיפטה כדי להבטיח כי שם אין גושים.
הערה: ההליך החילוץ צניפה צריכה להתבצע על קרח כדי למנוע דנטורציה של חלבונים עקב החום שנוצר במהלך המגון (איור 4).
5. לטעום ניקוי, מאגר Exchange
- להשתמש בהתקנים צנטריפוגלי מסנן עם הקיצוץ 3 kDa (ראה D3 טבלה של חומרים) עבור הליך זה על פי הוראות היצרן עם שינויים כאשר הדבר ישים. ראשית, הכנס את יחידת מסנן לתוך צינור microcentrifuge (שסופק בערכה מסנן).
- פיפטה µL 200 של מדגם homogenate למכשיר ממסנן אחד, להוסיף µL 200 יונים מים לתוך באותו המסנן. מכסה אותה בצורה מאובטחת (איור 5א).
- למקם את יחידת מסנן לתוך צנטריפוגה ספין 14,000 x g למשך 15 דקות ב 4 º C.
- הסר את ההתקן לצנטריפוגה ולהפריד את יחידת מסנן הכולל דוגמה להתרכז מהצינור microcentrifuge המכיל את פילטרט. למחוק את פילטרט של (איור 5B).
- לשקם את התרכז על-ידי הוספת µL 400 של יונים מים לתוך יחידת מסנן. חזור על שלבים 5.3 ו- 5.4 שלוש פעמים. Pipette בקפידה את תרכיז מדגם 'נקי' לתוך microtube נקיים.
הערה: בדרך כלל, מדגם גולמי 200 µL תניב ~ 50-70 µL של תרכיז לאחר סינון. - חזור על הצעדים 5.1-5.5 homogenates הנותרים הדגימה.
6. חלבון מדידה
- השתמש bicinchoninic חומצה (BCA) חלבון וזמינותו קיט (ראה B5 טבלה של חומרים) כדי לקבוע ריכוז חלבון של שברים תגובת שיקוע, גלולה של הדגימות צער בעלי חיים על קורא צלחת.
- להכין אלבומין דילולים (BSA) סטנדרטיים (סופי BSA ריכוזים נע בין 25 עד 2,000 µg/mL) של אחד האמפולה 1 מ"ל הכוללת 2 מ"ג/מ"ל BSA, על פי הוראות היצרן.
- פיפטה 10 µL של כל דילול סטנדרטי של BSA מדגם ושכפול של (תגובת שיקוע וגם גלולה) לתוך כל טוב של microplate 96-ובכן שטוח התחתונה.
- להכין את BCA עובד מגיב על-ידי הוספת חלקים 50 של BCA ריאגנט A 1 חלק של BCA ריאגנט בי
הערה: לחשב את הנפח הכולל של הכימית העבודה הנדרשים עבור כל אחת מהמידות לפני ההכנה והכן טרי נפח מספיק מבוסס על מספר ודוגמאות דילולים סטנדרטי כדי להיות לבדיקה. - בזהירות פיפטה 200 µL של BCA עובד ריאגנט כל טוב. מכסה את microplate, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר הקירור בלוח RT, למדוד את ספיגת במלון-562 ננומטר על קורא צלחת (ראה D13 טבלה של חומרים).
- בהתבסס על העקומה סטנדרטי עבור ריכוז רגיל כל BSA (µg/mL), לקבוע ריכוז חלבון הדגימות.
7. מימדי בג'ל (1DE)
- להכין את הדגימות 1DE כפי שמוצג בטבלה 1 (עבור מדגם אחד). מערבבים את התערובת מדגם טוב עם פיפטה. מחממים את הדגימות-70 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות וקריר כדי RT.
- להכין 1 x מאגר ריצה על-ידי הוספת 50 מ של מאגר פועל למען חברה דמוקרטית MES יונים 950 מ"ל מים. מערבבים היטב.
-
להכין precast 4-12% ג'ל חלבון Bis-טריס (ראה B4 טבלה של החומרים).
- לחתוך את נרתיק פלסטיק להסיר את הקלטת ג'ל ולשטוף את הקלטת עם מים יונים.
- הסר את המסרק בקלטת ג'ל בתנועה אחת, דואגת שלא יגרמו נזק הבארות.
- יש לשטוף בעדינות הבארות העמסה 2 - 3 פעמים עם 1 x מאגר פועל באמצעות פיפטה. היפוך ומנערים בעדינות את הקלטת ג'ל כדי להסיר את המאגר, להבטיח כי שם אין בועות אוויר בתוך הבארות.
- הוצא את הקלטת לבן בתחתית של הקלטות ג'ל.
- הכנס ג'לים (מקסימום שתי מגרות) לתוך הג'ל מפעיל טנק ופעם הושלם, לנעול את התבנית המתח ג'ל.
- מילוי המאגר העליונה (קטודה) קאמרית עם 200 מ ל מאגר פועל עד הבארות מכוסים לגמרי. בדוק אם יש הדלפות.
- להוסיף 500 µL של נוגדי חמצון (ראה A14 טבלה של חומרים) למאגר פועל.
הערה: נוגד חמצון הוא ריאגנט הנימוס חייב לשמש עם דגימות מופחתת עם צמצום סוכן (עיין טבלה 1) כדי לשמור את התנאים תוך צמצום במהלך אלקטרופורזה וכדי למנוע re-חמצון חומצות אמינו רגישים כגון טריפטופן, מתיונין. - בזהירות לטעון µg 50 מדגם לכל ליין באמצעות פיפטה. לאחר מכן, טען תקן חלבון מראש מוכתם כסמן מסה מולקולרית (ראה A18 טבלה של חומרים).
- למלא תא התחתון של מאגר (אנודת) 600 מ של מנהל המאגר.
- הפעל את ג'לים ~ 60 דקות ב מתח קבוע של 175 V. בסוף המרוץ, הסר בזהירות את הג'ל מהצלחת קלטת באמצעות סכין ג'ל.
-
בזהירות להעביר את ג'ל ג'ל מכתים תיבת.
- להכין את הפתרון תיקון טרי בהתבסס על המספר הכולל של ג'לים צריך להיות צבעונית, על פי הוראות היצרן כפי שמתואר בטבלה 2.
- לנער את gel(s) בפתרון תיקון 10 דקות ב RT על פלטפורמה נדנדה.
-
לבטל את הפתרון תיקון, כתם של ג'לים עם Colloidal כחול מכתים קיט.
- להכין הטרייה פתרונות מכתימים בהתבסס על המספר הכולל של ג'לים צריך להיות צבעונית, על פי הוראות היצרן כפי שמתואר בטבלה3.
- ראשית, למדוד את עוצמת הקול המתאים ומערבבים ישירות את הרכיבים המסומנים בכוכבית (*) הג'ל מכתים תיבת. לנער את gel(s) בפתרון מכתימים ללא הוספת גוון לסמלים B 10 דקות ב RT על פלטפורמה נדנדה.
- להוסיף הוספת גוון לסמלים B ישירות לתוך תיבת מכתימים המכיל * צביעת פתרון. הקפד ללחוץ הוספת גוון לסמלים B היטב לפני השימוש.
התראה: לבצע צעדים הכנה 7.10.1 7.11.1 ברדס fume.
- לנער את gel(s) בפתרון מכתימים בן לילה לתוצאות הטובות ביותר הכוללת.
הערה: הלהקות מוכתם יהפוך גלוי בתוך 10 דקות לאחר התוספת של הוספת גוון לסמלים ב מכתים דורש מינימום של 3 שעות, עוצמת אינה משתנה אם הארכת שעות בפתרון מוכתמים. - בזהירות decant הפתרון מכתימים והחלף 200 מיליליטר מים יונים. לנער את gel(s) לפחות 7-8 שעות במים כדי לנקות את הרקע.
הערה: יש מים יונים לשנות מספר פעמים במהלך ההליך destaining כדאי להסיר את הכתם מוגזמת. Gel(s) ניתן גם להשאיר במים עד 3 ימים מבלי להתפשר על עוצמת הלהקה חלבון. אם gel(s) הוא לא נתון אל השלבים הבאים מיד, זה יכול להיות מאוחסן פתרון אמוניום סולפט 20% ב 4 ° C לאחסון לטווח ארוך.
8. בג'ל Tryptic עיכול
הערה: פרוטוקול זה לפי השיטה על ידי שבצ'נקו ואח17, עם שינויים קלים. פרוצדורה זו צריכה להתבצע בזרימה שכבתית הוד והשתמש במערך ייעודי של מדי סוכר, טיפים, צינורות זכוכית במיוחד למטרה זו. ללבוש כפפות ואביזרים המתאימים מעבדה בכל עת כדי למנוע קרטין וזיהום אחרים. להכין את כל פתרונות, ריאגנטים להשתמש בהליך זה זמן קצר לפני השימוש.
- בלו הלהקות חלבון מן הג'ל עם להבי מיקרוטום נקי, חדש. חותכים את הלהקה לחתיכות קטנות (כ 1 מ"מ x 1 מ"מ עד 2 מ מ x 2 מ"מ). להעביר בזהירות את החלקים ג'ל לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 mL.
הערה: חלקים קטנים מדי יכול לסתום טיפים פיפטה, חלקים גדולים יותר יפחית פפטיד השחזור. לנקוט זהירות בעת שימוש מיקרוטום להבי, אשר מאוד חדות. -
Destaining
- להוסיף 500 μL של פתרון destaining המכיל 100 מ מ ABC פתרון/לחצן מצוקה (1:1, וי/v), דגירה דגימות ב RT למשך 30 דקות עם טלטולים ומדי פעם או vortexing.
- פיפטה בקפידה את הפתרון destaining. בדוק חזותית בכל צינורות עם כתם שיורי. חזור על שלב 8.2.1 אם חתיכות ג'ל עדיין מוכתמים כחול.
-
הפחתת ו אלקילציה
- הוסף µL ~ 400 של פתרון DTT הטרי, דגירה ב 56 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לוודא כי הפתרון מכסה לחלוטין את החלקים ג'ל. בזהירות פיפטה את הפתרון תוך צמצום וזורקים.
- הוסף µL ~ 400 של פתרון רשות העתיקות הטרי, דגירה בחושך ב RT 30 דקות הסר מאגר עם פיפטה ולמחוק החומר.
-
עיכול
- להוסיף 500 µL של לחצן מצוקה מסודר RT למשך 10-15 דקות עד החלקים ג'ל לכווץ ולהיות אטומה. פיפטה לחצן מצוקה, מילה נהדרת חתיכות ג'ל למשך 5-10 דקות מתחת למכסה המנוע.
- פיפטה µL 50 של טריפסין פתרון לתוך כל שפופרת לכסות לגמרי את החלקים ג'ל. דגירה הצינורות ב- 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- לאחר 30 דקות, לבדוק כל שפופרת אם כל פתרון טריפסין נספג על ידי החלקים ג'ל. להוסיף נפח מספיק של מאגר טריפסין (µL 50-100, בהתאם לנפח בצינור) לכסות לגמרי את חתיכות ג'ל, במידת הצורך. דגירה הדגימות בן לילה ב 37 º C.
-
פפטיד החילוץ
- בזהירות pipette הפתרון פפטיד שחולצו מן צינורות העברה לנקות את microtubes. יבש את תגובת שיקוע ב המאייד ואקום צנטריפוגלי.
הערה: אל תמחק את החלקים הנותרים של ג'ל. - להוסיף 100 µL מאגר החילוץ (עיין שלב 1.7) לכל צינור, תקופת דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות.
- Pipette את תגובת שיקוע לתוך microtubes באותה המכיל את פפטידים שחולצו על פי הלהקות בהתאמה ויבש למטה ומפרידה ואקום.
הערה: אם לא משתמשים מיד, תמציות פפטיד יבשים ניתן לאחסן ב-20 ° C עד מספר חודשים עד שימוש נוסף.
- בזהירות pipette הפתרון פפטיד שחולצו מן צינורות העברה לנקות את microtubes. יבש את תגובת שיקוע ב המאייד ואקום צנטריפוגלי.
9. פפטיד טיהור
הערה: פפטיד מדגם desalting, טיהור פרוצדורה זו מבוצעת עם השימוש C18 פיפטה טיפים (ראה C15 טבלה של חומרים). השתמש טיפ חדש עבור כל דגימה.
- להכין הטרייה פתרונות הבאים צנטריפוגה חרוט צינורות ו aliquot לתוך צינורות microcentrifuge 2 מ"ל ההליך טיהור פפטיד, כפי שמוצג בטבלה4. סיכום של הצינורות לטיהור פפטיד הוא כדלקמן: צינור (פתרון לדוגמה), הרכבת התחתית B (פתרון הרטבה), צינור C (Equilibration פתרון), צינור D (פתרון כביסה), צינור E (פתרון • תנאי), צינור F (ריק 2 mL או 5 מ"ל microcentrifuge tube, בהתאם מספר דוגמאות כדי לנקות, לסילוק פסולת), ו- G צינור (נקי, ריק microtube, קיבולת 0.2 מ"ל).
- לשקם פפטיד מיובשים תמציות מהשלב 8.6.3 עם 10 µL של 0.1% TFA. הצינור הזה הוא מיועד לשמש צינור א
- Sonicate צינורות א באמבט אולטראסוני עם קרח למשך 5 דקות.
- ספין למטה הפתרון מדגם ומפרידה benchtop ב x 1000 g עבור 1 דקות.
- הגדר micropipette P10 עד להגדרת עוצמת קול גבוהה של 10 µL וצרף טיפ פיפטה18 C בצורה מאובטחת.
- לטבול את הטיפ פיפטה בתוך תמיסת הרטבה (הרכבת התחתית B), תשאף בזהירות לתוך חומרי האריזה. לאט לאט לוותר על הפסולת לתוך צינור פ חזור על שלב זה לפחות 7 - 8 פעמים.
הערה: נלחצים פיפטה הבוכנה עצרה לאט לשחרר או לוותר על הבוכנה לאורך כל ההליך. לנקוט אמצעי זהירות לא כדי להציג בועות אוויר לתוך הטיפים במהלך pipetting כדי להבטיח פפטיד המרבי מחייב העמודה סי18. - Equilibrate הקצה עבור איגוד פפטיד ב-10 שואבת µL פתרון equilibration בצינור ג לבטל את הפתרון, חזור על הליך זה פי 3 או 4.
- בשלב הבא, האחות, לוותר על פתרון מדגם צינור א מספר פעמים (תלוי בעובי הלהקה ג'ל המתאים) כדי לאגד את פפטידים לתת טיפ עמודה.
התראה: השאיפה והשלבים שחולק במהלך ההליך מחייב (שלב 9.8) מתבצעות בתוך צינור א לא לוותר על הפתרון מדגם לבזבז. - לשטוף את הטיפ פיפטה18 C על ידי כ רפה בעברית הפתרון כביסה ברה צינור ומחיקת זה לבזבז (צינור נ) 4 או 5 פעמים.
- בסופו של דבר, elute של פפטידים המאוגד על-ידי pipetting הפתרון • תנאי (צינור E) מחלק את eluant לתוך צינור G...
- חזור על השלבים כל 2-3 מחזורים לכל הדגימה כדי להגדיל את המדגם שחזור.
- למחוק את הטיפ לאחר טיהור דוגמא אחת ולהשתמש טיפ חדש עבור הדוגמה הבאה.
- יבש את eluates פפטיד מטוהרים ברכז ואקום.
הערה: הדגימות מטוהרים מוכנים עכשיו LC-MS/MS ניתוחים במערכת MS LC-ESI-LTQ-Orbitrap. לאחסן את הדגימות יבשים ב-20 ° C עד שימוש נוסף.
10. נוזלי כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית electrospray יינון-MS/MS ניתוחים
הערה: ניתוח כמותי ללא תווית פרוטאומיקס מתבצע על מערכת MS כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית electrospray מלכודת יונים יינון-ליניארי-Orbitrap (LC-ESI-LTQ-Orbitrap). LC מורכב של משאבת רבעוני אלגרו Rheos, בעזרתם של degasser באינטרנט (מצמידים של תעשיה HTS PAL, המערכת כוללת 30 מ"מ x 0.5 מ"מ C18 קדם עמודה מחובר עמודה18 150 מ"מ x 0.5 מ"מ ג. שימוש להפוך פאזה מימית של הממס המורכב LC-MS מים כיתה עם חומצה פורמית 0.1% (v/v) ו- B הממס האורגני המורכב LC-MS acetonitrile כיתה עם חומצה פורמית 0.1% (v/v). השתמש במעבר הצבע עם זמן הריצה של 60 דקות לכל הלהקה ג'ל, כמתואר בפירוט שלנו6,הקודם מחקרים16.
- להמיס את הדגימות פפטיד מטוהרים ב 10 µL של 0.1% TFA. Sonicate את הדוגמאות על קרח למשך 5 דקות.
- פיפטה 10 דוגמאות µL לתוך צלחת V-התחתון 96-ובכן, חותם עם סרט כיסוי ברור, הדבקה.
- להעביר את הצלחת תעשיה.
- השתמש במעבר הצבע הבאים עבור כל זמן של 60 דקות: 0-35 דקות (15-40% ממס B), 35-40 דקות (40-60% ממס B), 40-45 דקות (60-90% ממס B), 45-50 דקות (90% ממס B), 50-53 דקות (90-10% ממס B) ו- 53-60 דקות (10% ממס B).
- להשתמש בתנאי המוני spectrometric הבאות של המכשיר: מצב יינון ספקטרומטריית electrospray יון חיובי, ספריי מתח (2.15 kV), נימי טמפרטורה (220 מעלות צלזיוס), רכישת נתונים תלוית מצב, רכישה אוטומטית מעבר בין Orbitrap-MS ו- LTQ MS/MS, רזולוציה orbitrap (30,000), מ/z טווח (300 עד 1,600), יעד אוטומטי להשיג שליטה (AGC, 1.0 x 106 יונים), למשובטים פנימי (polydimethlycyclosiloxane [PCM] ב מ/z יונים 445.120025 בזמן אמת), תנעל המוני אפשרות זמינה במצב MS, טנדם נתונים שהושגו על-ידי בחירה של יונים קודמן האינטנסיבי ביותר של חמש העליון, עוד פיצול על-ידי התנגשות-induced דיסוציאציה (CID), מנורמל התנגשות אנרגיה (NCE, 35% עם זמן ההפעלה של 30 ms עם ספירה חוזרת של 3) ומשך הדרה דינמי (600 s).
הערה: היונים מפוצלים וכתוצאה מכך נרשמים את LTQ. - הפעל משכפל ביולוגית לפחות שלושה עבור כל דגימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
זמינות מוגבלת מדגם הוא אחד החסרונות העיקריים במחקר אופטלמולוגיות. בהתאמה, שיטות החילוץ חלבון אופטימום תשואה של כמויות קטנות של דוגמאות כמו עינית כלי הדם הם לעיתים קרובות שנוי במחלוקת. נכון להיום, יש במחסור של שיטות ששירתה במיוחד להפקת חלבון של כלי הדם retrobulbar. לכן, צעד ראשון בשיטת אופטימיזציה וכן הוכחה-של-עיקרון להשוות את היעילות ואת החוסן של כמה בדרך כלל המועסקים חלבון דטרגנטים החילוץ ל ריאגנט חדש יחסית, T-לכל, אנחנו ביצעו מחקר פיילוט באמצעות רקמות הלב של עכברים (עקב מדגם קל ומספיק הזמינות עבור אופטימיזציה שלבים). השווינו את התשואה חלבונים על-ידי השוואת ריכוזי החלבון הכולל וחלבונים הכולל מזוהה באמצעות של ריאגנטים הבאים: T-פר, 0.02% n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM), 1% 3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-סולפונאט פרופאן (חברים), 1% amidosulfobetaine-14 (ASB-14), תערובת של לחצן מצוקה TFA (20% לחצן מצוקה / 1% TFA). הסכום הכולל של חלבונים בדגימות חילוץ עם כל אחד דטרגנטים אלה היא כפי שהיא מתוארת באיור 6א, עם התשואה הגבוהה של רקמות חילוץ עם T-לכל (56.4 רקמות µg/mg), ואחריו DDM (רקמות µg 22.88/mg), בחורים (16.01 µg/מ ג רקמות), ASB-14 (רקמות µg 11.56/mg), את התשואה הנמוכה מלחצן מצוקה/TFA (µg 4.38/mg רקמות). באופן עקבי, החלבונים הכולל מזוהה גם היו הגבוהים ביותר במדגם T-לכל-חילוץ (1649 חלבונים) > DDM (1310 חלבונים) > בחורים (1319 חלבונים) > ASB-14 (1121 חלבונים) > לחצן מצוקה/TFA (924 חלבונים), כפי שמוצג באיור 6B. בהתבסס על תוצאות אלו, התקדמנו עם מיצוי חלבונים מדגימות צער בעלי חיים עם T-לכל.
הבא, אופטימיזציה של מדגם פרוטוקולים הכנה לפני fractionation מראש ב- 1DE היא צעד חיוני מאוד להשיג חלבון מופרדים היטב להקות ותוצאות מאוד לשחזור בין דגימות משכפל. החשיבות של השלבים הבאים לידי ביטוי, מודגש בתוצאות של 1DE. איור 7 מציג ההשוואה של חלבון 1DE פרופילים של צער בעלי חיים לפני ואחרי נתון הכנת דגימה ממוטבת וניקיון מדרגות. בסך הכל, רמה גבוהה של ההפרדה מריחת ועניים הלהקות חלבון נצפתה ב ליין 3. פרופיל זה מדגים כי הדגימות עשויים להכיל ריאגנט חילוץ וכן מזהמים כגון שומנים ופסולת הסלולר. עם זאת, הדגימות צער בעלי חיים זה נפרדו תגובת שיקוע, גלולה ונחשפו, אופטימיזציה פרוטוקול כנהגים בפרופילי 1DE למופת, מיוצגים בליין 1 ו- 2 (איור 7).
בהעיקר, בהתבסס על אלה מבטיח תוצאות, שיטת אופטימיזציה לחילוץ מהיר, חזק ויעיל חלבון מסיס מ microvessels עינית היא העסקת רקמת החלבון החילוץ ריאגנט (T-לכל) ושימוש החילוץ מאגר 2A (TM-פק) כדי לחלץ המבוסס על רפידה חלבונים נמצאו בגדר הדגימה. לאחר מכן, לטעום homogenates (ה-T-לכל סיעה) ותוחלת מאגר exchange ודגימת ניקוי עם היחידות צנטריפוגלי מסנן kDa 3 לפני 1DE. ריכוז מדגם אופטימלי הוא µg 50 לכל טוב. מצד שני, זה חייב להיות מודגשים כאן כי פרוטוקול זה אינה ישימה עבור רקמות קטנים כגון כלי דם, אך היא גם אפשרית עבור אחרים דגימות רקמות מבוסס. עדות לכך היא על ידי פרופילים 1DE של המוח מאתר ורקמות הלב, אשר הראו כי ישנם מספר רב של חלבונים אשר יכול להיות מופק תגובת שיקוע (איור 8A, B) והן צניפה שברים (איור 8C, D ).
איור 1 : סקירה כללית של זרימת עבודה. ייצוג סכמטי של הפרוטוקולים המועסקים לניתוח פרוטאום ללא תווית כמותית של לאגודת צער בעלי חיים חזירי. באופן כללי, הליך זה מחולק לשני חלקים עיקריים הכוללת צעדים הכנה מדגם microvessel וגישה מבוססת-MS פרוטאומיקס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : נציג תצלומי העיניים חזירי. (A) לרוחב להציג של מראה גלוב העין הקרנית, אשר ממוקם בחלק הקדמי של העין, בסקלרה, שמסביב שריר עצב הראייה. (B) אחוריים להציג של מראה העין עצב הראייה. (ג) ענפים של צער בעלי חיים ראה בסוף העולם העין מורכב paraoptic וסניפים דיסטלי. (ד) מבודד צער בעלי חיים עם סביב fat ורקמות החיבור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : מדגם המגון. הנציג תצלומים מציג את הדגימה (א) לפני ו- (B) לאחר המגון. (ג) הומוגני דגימות נפרדו עוד תגובת שיקוע המכילה חלבונים מסיסים, גלולה המכילה חלבונים לא מסיסים, המבוססים על transmembrane. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : גלולה חלבון מיצוי ההליך. על מנת למנוע דנטורציה של חלבונים, גלולה דגימות מופקים על קרח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : ניקוי דגימת. מאגר exchange מבוצע עם 3 kDa הקיצוץ צנטריפוגלי מסננים כדי לנקות את הדגימות לפני ניתוח MS. הנציג תצלומים מציג את homogenate (א) לפני ו- (B) לאחר סינון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 : השוואה של היעילות החילוץ חלבון ואת החוסן בין T-לכל ודטרגנטים ארבע נפוצות חלבון החילוץ. תרשימי עמודות המתאר את כמויות חלבון (A) ו- (B) המספר הכולל של חלבונים מזוהה באמצעות T-פר, 0.02% DDM, חברים 1%, 1% ASB-14 ו- 20% לחצן מצוקה / 1% TFA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7 : ג'ל 1DE נציג פרופילי חלבון חזירי צער בעלי חיים לפני ואחרי אופטימיזציה. ליין 3 מתאר את הפרופיל 1DE מדגם זה היה נתון כלשהו לפני ניקוי מדרגות. ליין 1 ו- 2 להציג את הפרופילים חלבון למופת של צער בעלי חיים supernatant, גלולה, בהתאמה, לאחר העמדת הדגימות הכנת דגימה ממוטבת וניקיון מדרגות. ג'ל היה מוכתם כחול colloidal מכתים קיט. M = סמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 8 : 1DE blue מוכתמת colloidal נציג ג'ל של דגימות רקמות מבוסס למופת. חלבון פרופילים של תגובת שיקוע (A, B), גלולה (C, D) של המוח מאתר ורקמות הלב דוגם, בהתאמה, ב- µg 50 לכל טוב. תגובת שיקוע, גלולה חלבונים חולצו העסקת ה-T-לכל, transmembrane חלבון החילוץ ערכה, בהתאמה. M = סמן. R1-R3 מייצגים שלוש משכפל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| רכיב | נפח (µL) |
| לדוגמה (תגובת שיקוע או גלולה) | x |
| לדוגמה תעודות זהות מאגר (4x) | 2.5 |
| צמצום הסוכן (10 x) | 1 |
| מים יונים | עד 6.5 (בהתאם לדוגמה נפח) |
| הנפח הכולל עבור דגימה | 10 |
| הערה: x מחושב בהתבסס על ריכוז חלבון (50 µg הכוללת חלבון לכל דגימה). | |
טבלה 1:1 ממדי בג'ל (1DE). הפרטים המרכיבים הדרושים עבור הכנת הדוגמא לבצע 1DE.
| פתרון | עבור 1-ג'ל (mL) | עבור 2 ג'לים (mL) | עבור 4 ג'לים (mL) |
| מים יונים | 40 | 80 | 160 |
| מתנול | 50 | 100 | 200 |
| חומצה אצטית | 10 | 20 | 40 |
בטבלה 2: ג'ל קיבוע. הפרטים המרכיבים הדרושים כדי להכין פתרון לתקן 1DE.
| פתרון | עבור 1-ג'ל (mL) | עבור 2 ג'לים (mL) | עבור 4 ג'לים (mL) |
| * מים יונים | 55 | 110 | 220 |
| * מתנול | 20 | 40 | 80 |
| * הוספת גוון לסמלים A | 20 | 40 | 80 |
| הוספת גוון לסמלים B | 5 | 10 | 20 |
טבלה 3: ג'ל מכתים. הפרטים של הרכיבים עבור הכנת Colloidal כחול מכתים פתרון.
| פתרון (עבור) | קומפוזיציה | לחצן מצוקה * * | H2O * * | TFA | סה כ נפח * |
| הרטבה | לחצן מצוקה 100% | 2 מ | 2 מ | ||
| #Washing, equilibration | 0.1% TFA | 10 מ | 10 ΜL | ~ 10 מ | |
| • תנאי פפטיד | 0.1% TFA ב מתקפל 60: 40 = לחצן מצוקה: H2O | 6 מ | 4 מ"ל | 10 ΜL | ~ 10 מ |
| הערה: * לנפח הכללי צריך להיות מותאם על פי המספר הכולל של דגימות יעברו Zip עצה ניקוי. | |||||
| * * להשתמש HPLC-כיתה או LC-MS-כיתה. | |||||
| # להכין שני צינורות גלאים נפרדים עבור כביסה ו- equilibration, בהתאמה. | |||||
בטבלה 4: טיהור פפטיד. הפרטים של הרכיבים ויצירות המתאימים שלהם עבור הליך טיהור פפטיד באמצעות העצות פיפטה18 C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטאום מקיף פרופיל של מגוון רחב של דוגמאות עינית היא צעד ראשון חשוב והכרחי התירי את המנגנונים המולקולריים ואת איתות המסלולים מעורבים מחלה ובריאות. על מנת לקבל נתונים באיכות גבוהה ולהבטיח את הפארמצבטית של התוצאות המתקבלות מניתוחי האלה, השלבים הקודמים של הכנת המדגם מכריעים, כפי שמודגש בסקירה על-ידי Mandal et al. לדון מעמיק ההליכים עיבוד הדגימה עבור חלקים שונים של העין העסקת מימדי ג'ל אלקטרופורזה, מסה ספקטרומטר אסטרטגיה1. בשורה של החקירות האלה, המחקר הנוכחי שלנו מספק פרוטוקול צעד אחר צעד ממוטבת להכנה מהירה, חזקה ויעילה מאוד MS תואם מדגם באמצעות לאגודת צער בעלי חיים חזירי כמו microvessels עינית דגם. החקירה הזאת היה יזם בעקבות במחסור של מתודולוגיה מסוימת כדי לחלץ כמויות מספיקות של חלבונים מדגימות עורקי כמות מוגבלת כדי להפיק נתונים MS באיכות גבוהה. השיטה שלנו היא גם העשייה לתרום לגוף הקיים של ידע על השימוש של מיקרו-מידה טכניקות המאפשרות פרוטאום מעולה מיפוי18.
ישנם מספר היבטים קריטיים ב פרוטוקול ניסיוני זה צריך להילקח בחשבון לקבלת ביצועים מיטביים עבור ניתוח פרוטאום כמותית. ראשית, חשוב כי הדגימות, בין הסכומים, ותוחלת המגון מלאה כדי להבטיח מיצוי חלבון אופטימלי. המתודולוגיה שלנו, השימוש תערובת של החרוזים בגודל שונה מהמגן בלנדר הקליע היה אינסטרומנטלי פירוק רקמת מלאה. סוג וגודל של חרוזים בשימוש תלויים דוגמה לסוג. חרוזים עם צפיפות גבוהה יותר, כגון שימוש כיום ZrO2 , פלדת אל-חלד, מתאימים בשביל לרקמות בינוני-קשה, עבד טוב במיוחד עבור כלי הדם.
שנית, זה הכרחי כדי להפריד את תגובת שיקוע צניפה, ובמידה נושא האחרון לעיכול, חילוץ באמצעות ערכת שצוין. השלב זה מכריע כדי לחלץ משקל מולקולרי גבוה חלבונים כגון חלבונים transmembrane, אשר אחרת קשה homogenize באמצעות דטרגנטים קלים19,20,21. צניפה זירז מפורקת בצורה הטובה ביותר באמצעות sonication כדי למנוע אובדן מדגם שנגרמו ספלאש-up הציג במהלך נמרצת עצבנות או טלטול שיטות.
שלישית, זה ראוי לציין כי כל ההליכים הכנה מדגם מתבצעות בטמפרטורה נמוכה (4 ° C), אלא אם צוין אחרת על המתודולוגיה. זאת על מנת להבטיח דנטורציה של חלבונים מינימלי במהלך ההליכים החילוץ. יש להימנע הרביעי, חוזרות ונשנות ההקפאה-הפשרתו של דוגמאות כדי למנוע השפלה חלבון ולירידה באיכות הדגימה.
בסופו של דבר, הסרת מזהמים ודטרגנטים הוא הצורך לאחר מיצוי חלבונים כדי למנוע הפרעה במורד הזרם במהלך בג'ל fractionation עיכול אנזימטי, MS ניתוח18,22. מזהמים אלה לעיתים קרובות להפריע הרזולוציה של ההפרדה electrophoretic, בהתאמה, להשפיע על הפריט החזותי של התוצאה, כפי שמוצג בפרופיל 1DE (איור 7). כדי לעקוף בעיה זו, השימוש של התקנים צנטריפוגלי מסנן הקיצוץ פייבוריט שלהם קלות השימוש ואת אובדן חלבון מינימאלית.
למרות ההליכים הניסיונית הנוכחית לספק בהשקפה מעמיק לתוך הצעדים הכנה לדוגמה חשוב עבור ניתוחים MS ללא תווית כמותיים אופטימלית, קיימות שתי מגבלות. ראשית, צער בעלי חיים דגימות היו איחדו מעיני חזירי שני כדי לספק כמויות מספיקות של רקמות לצורך ניתוח מאוחר יותר. כיוון העיניים המתקבל לשוק המקומי הם אקראי ולכן לא ידוע אם כלי הדם הם להיות מבודדת על העיניים של אותה חיה, דוגמת באגירת מפחית את הסיכון של לזו וההבדלים בין-5,6. אולם, ניתן גם להתאים את המתודולוגיה הנוכחי עבור הכנת הדוגמא בודדים בהתאם לכמות של דגימות זמינים. שנית, המתודולוגיה הציג פותחה במיוחד עבור 1DE מבוסס על ג'ל fractionation. למרות ההתאמה של השיטה הנוכחית עבור שילוב עם מלמעלה ושיטות אחרות fractionation צו חקירה, הסכמנו על 1DE בשל מספר גורמים החל הפארמצבטית טוב, להקל על בקרת איכות טובה יותר לעומק של ניתוחים , במיוחד עבור דוגמאות מורכבות כמו למשל, כיום כלי הדם עינית1,5,23.
לסיכום, למרות המגבלות מודגשות מעל, זרימת העבודה המתוארת מייצג גישה פשוטה אך חזקים כדי צעדים הכנה מדגם מחמירים ששירתה במיוחד עבור ניתוח של כמות קטנה של כלי הדם. חשוב גם להדגיש כאן כי ניתן לשלב בקלות בשיטה זו לניתוח פרוטיאומיה מבנית מבוססי ספקטרומטר מסה של דגימות תאים רקמות מבוססות אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
ד ר Manicam נתמך על ידי פנימי אוניברסיטת מחקר מימון (Stufe 1) מהמרכז הרפואי באוניברסיטת את יוהנס גוטנברג אוניברסיטת מיינץ (mainz), מענק של פתוח (MA 8006/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Chemicals | |||
| 1, 4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 1.11474 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth | 5239.1 | 2.5 mM |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190169 | |
| Formic acid (CH2O2) | AppliChem | A0748 | |
| HPLC-grade acetonitrile (ACN, C2H3N) | AppliChem | A1605 | |
| HPLC-grade methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | M/4056/17 | |
| HPLC-grade water | AppliChem | A1589 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth | 6781.1 | 4.7 mM |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.2 | 1.2 mM |
| LC-MS-grade acetic acid | Carl Roth | AE69.1 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth | 261.2 | 1.2 mM |
| NuPAGE Antioxidant | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0005 | |
| NuPAGE LDS Sample buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0007 | 4x |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0002 | 20x |
| NuPAGE Sample reducing agent | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0004 | 10x |
| SeeBlue Plus2 pre-stained protein standard | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC5925 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 9265.2 | 118.3 mM |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth | 965.3 | 25 mM |
| Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2) | Merck Millipore | 108178 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth | 6780.1 | 11 mM |
| B. Reagents and Kits | |||
| 0.5 mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | |
| 1.0 mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB10 | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC6025 | To stain 25 mini gels per kit |
| NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gels | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0321BOX | 1.0 mm, 10-well |
| Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEK | Merck Millipore | 71772-3 | 20 reactions per kit |
| Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER) | Thermo Scientific | 78510 | |
| C. Tools | |||
| 96-well V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651180 | |
| Corning 96-well flat-bottom plates | Sigma-Aldrich | CLS3595-50EA | |
| Disposable microtome blades | pfm Medical | 207500014 | |
| Disposable scalpels #21 | pfm Medical | 200130021 | |
| Dissection pins | Carl Roth | PK47.1 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Falcon conical centrifuge tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Mayo scissors, Tough cut | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Precision tweezers | Fine Science Tools | 11251-10 | Type 5 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth | LH53.1 | Type 5 |
| Self-adhesive sealing films for microplates | Ratiolab (vWR) | RATI6018412 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | Straight, 77 mm |
| ZipTipC18 pipette tips | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
| D. Equipment and devices | |||
| 150 × 0.5 mm BioBasic C18 column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-150565 | |
| 30 × 0.5 mm BioBasic C18 pre-column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-030515 | |
| Amicon Ultra-0.5 3K Centrifugal Filter Devices | Merck Millipore | UFC500396 | Pack of 96. |
| Analytical balance | Sartorius | H51 | |
| Autosampler | CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland | HTS Pal | |
| BBY24M Bullet Blender Storm | Next Advance | NA-BB-25 | |
| Eppendorf concentrator, model 5301 | Sigma-Aldrich | Z368172 | |
| Eppendorf microcentrifuge, model 5424 | Fisher Scientific | 05-403-93 | Non-refrigerated |
| Heraeus Primo R Centrifuge | Thermo Scientific | 75005440 | Refrigerated |
| Labsonic M Ultrasonic homogenizer | Sartorius | BBI-8535027 | |
| LC-MS pump, model Rheos Allegro | Thermo Scientific, Rockford, USA | 22080 | |
| LTQ Orbitrap XL mass spectrometer | Thermo Scientific, Bremen, Germany | ||
| Multiskan Ascent plate reader | Thermo Labsystems | v2.6 | |
| Rotator with vortex | neoLab | 7-0045 | |
| Titanium probe (Ø 0.5 mm, 80 mm long) | Sartorius | BBI-8535612 | |
| Ultrasonic bath, type RK 31 | Bandelin | 329 | |
| Xcell Surelock Mini Cell | Life Technologies | El0001 |
References
- Mandal, N., Heegaard, S., Prause, J. U., Honoré, B., Vorum, H. Ocular proteomics with emphasis on two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Biological Procedures Online. 12, 56-88 (2010).
- Gregorich, Z. R., Ge, Y. Top-down proteomics in health and disease: Challenges and opportunities. Proteomics. 14, 1195-1210 (2014).
- Aebersold, R., Mann, M.
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537, 347-355 (2016).
- Cehofski, L. J., Mandal, N., Honoré, B., Vorum, H.
- Manicam, C., et al. Proteomics Unravels the Regulatory Mechanisms in Human Tears Following Acute Renouncement of Contact Lens Use: A Comparison between Hard and Soft Lenses. Scientific Reports. 8, 11526 (2018).
- Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR 4) in human tear proteome. Proteomics. 14, 1698-1709 (2014).
- Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proteomics analysis of human tears from aqueous-deficient and evaporative dry eye patients. Scientific Reports. 6, 29629 (2016).
- Perumal, N., Funke, S., Wolters, D., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of human reflex tear proteome reveals high expression of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR4). Proteomics. 15, 3370-3381 (2015).
- Perumal, N., et al. Characterization of the human aqueous humour proteome: A comparison of the genders. PloS ONE. 12, 0172481 (2017).
- Hayreh, S. S. Posterior ciliary artery circulation in health and disease the Weisenfeld lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 749-757 (2004).
- Zeitz, O., et al. Glaucoma progression is associated with decreased blood flow velocities in the short posterior ciliary artery. British Journal of Ophthalmology. 90, 1245-1248 (2006).
- Verma, N., Rettenmeier, A. W., Schmitz-Spanke, S. Recent advances in the use of Sus scrofa (pig) as a model system for proteomic studies. Proteomics. 11, 776-793 (2011).
- Foulds, W. S., Kek, W. K., Luu, C. D., Song, I. C., Kaur, C. A porcine model of selective retinal capillary closure induced by embolization with fluorescent microspheres. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6700-6709 (2010).
- Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I.
- Manicam, C., Perumal, N., Pfeiffer, N., Grus, F. H., Gericke, A. First insight into the proteome landscape of the porcine short posterior ciliary arteries: Key signalling pathways maintaining physiologic functions. Scientific Reports. 6, 38298 (2016).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havli, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1, 2856-2860 (2006).
- Feist, P., Hummon, A. B. Proteomic challenges: sample preparation techniques for microgram-quantity protein analysis from biological samples. International Journal of Molecular Sciences. 16, 3537-3563 (2015).
- Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1, 1872-1878 (2006).
- Zhang, L., et al. Proteomic analysis of mouse liver plasma membrane: use of differential extraction to enrich hydrophobic membrane proteins. Proteomics. 5, 4510-4524 (2005).
- Zhou, H., et al. Improved recovery and identification of membrane proteins from rat hepatic cells using a centrifugal proteomic reactor. Molecular & Cellular Proteomics. 10, 111 (2011).
- de la Cuesta, F., Mourino-Alvarez, L., Baldan-Martin, M., Moreno-Luna, R., Barderas, M. G. Contribution of proteomics to the management of vascular disorders. Translational Proteomics. 7, 3-14 (2015).
- Cottingham, K. 1DE proves its worth... again. Journal of Proteome Research. 9, 1636 (2010).
