Methodenartikel

Vorbereitung und Immunostaining Myelinating organotypischen zerebelläre Slice Kulturen

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DOI:

10.3791/59163

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20. März 2019

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1Sorbonne Université, Inserm, CNRS, Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, ICM-GH Pitié-Salpétrière

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir eine Methode um organotypischen Slice Kulturen aus Maus Kleinhirn und Myelinscheide Färbung von Immunohistochemistry geeignet für die Untersuchung von Mechanismen der Myelinisierung und Remyelinisierung in das zentrale Nervensystem vorzubereiten.

Zusammenfassung

Im Nervensystem ist Myelin eine komplexe Membranstruktur erzeugte Myelinating glial Zellen, welche Ensheathes Axone und erleichtert die schnelle elektrische Leitfähigkeit. Myelin Veränderung nachweislich bei verschiedenen neurologischen Erkrankungen auftreten, wo sie funktionelle Defizite zugeordnet ist. Hier bieten wir eine ausführliche Beschreibung der Ex Vivo Modell bestehend aus Maus organotypischen zerebelläre Scheiben, die in Kultur gepflegt werden können, für mehrere Wochen und weiter beschriftet werden, um Myelin zu visualisieren.

Einleitung

Neuronen sind stark polarisierten Zellen, die eine Somato-dendritische Fach umfassen, die erhält Eingänge von seiner Umgebung und ein Axon, das die Erzeugung und Ausbreitung der elektrischen Impulse an andere Zellen sicherstellt. Schnelle Ausbreitung und rechtzeitige Bereitstellung von Informationen ist entscheidend für das reibungslose Funktionieren des Nervensystems. Bei Wirbeltieren wird es durch Myelinisierung, erleichtert, ermöglicht die Erhöhung der axonalen Wärmeleitung Geschwindigkeit1. Myelin ist eine spezielle Struktur, die durch verdichtete Schichten der Plasmamembran durch die Myelinating Glia erzeugt nämlich Oligodendrozyten in das zentrale Nervensystem (ZNS) und Schwann-Zellen im peripheren Nervensystem (PNS) gebildet. Sowohl in das ZNS und PNS, Axoglial Interaktionen fahren die Bildung von spezialisierten axonalen Domänen: die Knoten von Ranvier und ihre umliegenden Domänen, Paranodes und Juxtaparanodes2. Die axonalen Segmente isoliert von Myelin oder Internodien, wechseln sich ab mit den Knoten von Ranvier, die kleine unmyelinierten Domänen bereichert in Voltage-gated Natriumkanäle (NaV) entsprechen. Die hohe Konzentration und schnelle Aktivierung der NaV Kanäle auf den Knoten von Ranvier ermöglichen die Regeneration von Aktionspotentialen und zusammen mit den isolierenden Eigenschaften der Myelinscheiden, gewährleisten die effiziente und schnelle saltatory Wärmeleitung von der Nervenleitung längs des Axon-3.

Zusätzlich zu seiner Rolle bei der Beschleunigung die Leitgeschwindigkeit der Nervenleitung unterstützt Myelinating Glia metabolische das Axon, die langfristige Integrität bewahren und die Teilnahme an den überleben-4,-5. Darüber hinaus ist deutlich in den letzten Jahren geworden, dass das Myelin dynamisch lebenslang damit vermutlich die Teilnahme bei der Regulierung und Plastizität der verschiedenen Funktionen des Nervensystems moduliert wird. Anpassungen der Verteilung, Anzahl, Länge und Dicke der Myelinscheiden entlang der Axone können somit einen neuartigen Weg, um verschiedene Netze6,7,8fein tunen darstellen. Daher die evolutionäre Übernahme von Myelin ist ein Schlüsselprozess bei sensorischen, motorischen und kognitiven Funktionen und die Störung der Interaktion zwischen Axone und Gliazellen ist zunehmend als Beitrag zu den Entwicklungsstörungen oder erworbenen neurologischen Krankheiten-9.

Myelin Zusammensetzung hat geprägt, mit der Besonderheit eines hohen Anteils von Lipiden (70 %) im Vergleich zu Proteine (30 %) im Gegensatz zu anderen zellularen Membranen10. Allerdings sind die meisten der Myelin Proteine im Gegensatz zu Myelin Lipide spezifisch für Myelin, einschließlich Myelin basic Protein (MBP), Proteolipid-Protein (PLP), 2', 3'-cyclic Nucleotide 3'-Phosphodiesterase (CNP), Myelin-assoziierte Glykoprotein (MAG), Myelin-Oligodendrozyt Glykoprotein (MOG), PMP-22 und P010. Verschiedenen histologische Methoden Myelin Fleck gibt es anhand seiner Lipidzusammensetzung wie Luxol schnell blau11, Sudan schwarz B12, Bakers Säure Hematin Methode13, sowie Silber Färbung14. Dennoch lassen diese Ansätze nicht immer für einen ausreichenden Kontrast und Auflösung, Einzelfasern zu visualisieren. Ein alternativer Ansatz zur Erkennung von Myelin ist durch Immunhistochemie gegen Myelin Proteine gerichtet. Verschiedene Antikörper gezielt Myelin-spezifische Antigene mit hoher Spezifität und können routinemäßig verwendet werden, um Markhaltige Strukturen zu erkennen. Die Antikörper-Antigen-Interaktion kann weiter aufgedeckt werden, dass mit einem sekundären Antikörper gekoppelt an ein Fluorophor gegen den Primärantikörper gerichtet und mit angemessenen Fluoreszenzmikroskopie visualisiert. Hier beschreiben wir eine immunchemische Protokoll um Myelin auf ex Vivo zerebelläre Scheiben, ein Modell zu beflecken, ermöglicht eine gute Erhaltung der Architektur des Nervengewebes. Darüber hinaus die Organisation und die Größe von den Purkinje-Zellen (die einzige Markhaltige Neuronen des Kleinhirns) machen sie ein klassisches Modell für elektrophysiologische Untersuchungen und sie sind ebenso ideal, feste oder live-Imaging-Untersuchungen durchzuführen.

Die zerebelläre Scheiben entstehen von P9 P10 Mäusen, eine Zeit entspricht dem frühen Beginn der Purkinje Zelle Myelinisierung, ein Prozess, der vor allem durch eine Woche ex Vivo (ca. 6-7 Tage in-vitro-DIV)15erreicht wird. Darüber hinaus ist dieses Modell angepasst, demyelinisierende Erkrankungen wie der multiplen Sklerose (MS), zu untersuchen, wie eine umfangreiche Demyelinisierung im Kleinhirn Scheiben mit der Myelinotoxic Verbindung Lysophosphatidylcholine (oder Lysolecithin, LPC), induziert werden kann dem folgt eine spontane Remyelinisierung16,17. Endogene Remyelinisierung findet statt von zwei Tagen nach der LPC-Entfernung aus dem Kulturmedium und ist fast eine Woche nach der Behandlung vollständig.

Die Vollendung dieses Protokolls dauert ca. 3 Wochen, einschließlich einen halben Tag lang zerebelläre Slice Kulturen Vorbereitung, eine Woche völlig Markhaltige Scheiben, gefolgt von 2 Tagen auf dem Gipfel der Demyelinisierung zu erhalten und eine weitere Woche für ihre volle Remyelinisierung. Darüber hinaus kann Immunohistochemistry in 2 Tagen abgeschlossen sein. Das hier beschriebene Protokoll ist ein standard Wurf von 6 Mäusen Welpen angepasst und hinsichtlich der Anzahl der für das geplante Experiment verwendeten Tiere angepasst werden muss.

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Protokoll

Alle Arbeiten im Zusammenhang mit Tieren eingehalten werden institutionelle und die UPMC INSERM und Französisch und der Europäischen Gemeinschaftsrichtlinie 86/609/EWG festgelegten Richtlinien.

1. Vorbereitung des Kulturmediums und Kultur fügt (Hands-on-Zeit ≈ 10 – 15 min.)

Hinweis: Führen Sie diesen Schritt in einem Fluss-Kultur-Abzug unter sterilen Bedingungen

  1. Bereiten Sie 40 mL Kulturmedium, bestehend aus 50 % BME, 25 % Hank ausgewogen Salzlösung (1 X), 25 % Hitze-inaktivierten Pferd Serum, ergänzt mit 2 mM Glutamin-Derivat, 100 IU/mL Penicillin-Streptomycin und 4,5 mg/mL D-Glucose. Den pH-Wert 7,4 einstellen.
  2. Sterilisieren Sie Filter-das Medium durch einen 0,22 μm-Filter auf eine 50 mL Kunststoffspritze angepasst.
    Hinweis: Kulturmedium kann mindestens eine Woche bei 4 ° C aufbewahrt werden.
  3. Verwenden Sie für ein standard Wurf von 6 Welpen zwei sterile 6-Well-Platten. Entfernen Sie für jede Platte die Abdeckung und 1 mL Kulturmedium pro Bohrloch.
  4. Legen Sie eine Kultur-Einsatz in jedem einzelnen Brunnen halten die Kunststoffkante mit der sterilen Pinzette. Setzen Sie die Abdeckung wieder auf die Platte.
    Hinweis: Die zerebelläre Scheiben gesammelt von einem Welpen (6-8) können auf zwei Membranen (3-4 zerebelläre Scheiben pro Membran einfügen) versendet werden.

2. Vorbereitung der Dissektion Medium (Hands-on-Zeit ≈ 5 min)

Hinweis: Führen Sie diesen Schritt in einem Fluss-Kultur-Abzug unter sterilen Bedingungen

  1. Bereiten Sie 100 mL Dissektion Medium, bestehend aus Gey Balanced Salzlösung mit 4,5 mg/mL D-Glucose und 1 X Penicillin-Streptomycin (100 IE/mL) ergänzt.
  2. Sterilisieren Sie Filter-das Medium durch einen 0,22-μm-Filter-Einheit.
    Hinweis: Die Dissektion Medium kann bei 4 ° C für mindestens einen Monat gespeichert.
  3. Fügen Sie 5 mL kalte Dissektion Medium in 60 mm Zelle Kultur Gerichte. Bereiten Sie ein 60 mm Zelle Kulturschale für jeden Welpen sich seziert werden.
  4. Halten Sie die Dissektion Gerichte auf dem Eis bis zur Verwendung.

3. Vorbereitung der Dissektion Material (Hands-on-Zeit ≈ 15 min)

  1. Reinigen Sie die Bank mit 100 % Ethanol.
  2. Sterilisieren Sie alle Dissektion Werkzeuge, eine Rasierklinge und der Gewebe Chopper Kunststoff Plattform mit 100 % Ethanol.
  3. Beheben Sie die Rasierklinge und die Kunststoff-Plattform auf der Gewebe-Chopper zu, und passen Sie die Schnittstärke bis 300 µm.
  4. Stellen Sie sicher, dass das Ethanol verdampft ist, vor Beginn der Dissektion.

4. CerebellumDissection und Abschnitte Vorbereitung (Hands-on-Zeit ≈ 15 – 20 min pro Tier)

  1. Platzieren Sie eines der 60 mm Zelle Kultur Gerichte mit dem eiskalten Dissektion Medium unter dem Binokular und entfernen Sie die obere Platte.
  2. Tupfer Kopf Fell mit 70 % Ethanol (sorgfältig vermeiden, berühren Sie die Augen des Tieres) und das Tier mit großen scharfen Schere, entsprechend dem genehmigten Verfahren zu enthaupten.
    Hinweis: Die zerebelläre Scheiben werden aus P9 P10 Mäuse ohne spezifische Sex oder Belastung Vorspannung erzeugt.
  3. Verwenden Sie kleine Schere, schneiden Sie die Haut entlang der Mittellinie des Kopfes vom Hals ab und hinauf zu den Maus-Schnauze.
  4. Um den Kopf halten und setzen den Schädel, Klappen Sie die Haut ventral unter dem Kopf, und drücken Sie die zwei Falten der Haut zwischen den Fingern.
  5. Legen Sie die kleine Schere sanft in das Foramen Magnum und schneiden Sie den Schädel mit einer seitlichen Schnitt in Richtung der Seite und schneiden Sie dann rund um den Kopf Schädel. Halten Sie die Spitze der Schere als Parallel und in der Nähe der Schädel wie möglich beim Schneiden, um eine Beschädigung des Gehirngewebes.
  6. Abrufen des dorsalen Teiles des Schädels mit Fine-gerade Pinzette. Beim vorsichtig anheben des dorsalen Teiles des Schädels, schneiden die anhaftenden Hirnhaut (transluzente bewässerten Membran umgibt das Hirngewebe) ggf. mit einer kleinen Schere zu beschädigen das Hirngewebe.
  7. Bildenden Geraden Zange vorsichtig einführen (oder alternativ mit einem Spatel) zwischen den ventralen Schädel und das Gehirn, sanft das Gehirn ausflippen und Optik und Trigeminal Nerven mit einer kleinen Schere schneiden.
  8. Helfen Sie dem Gehirn, fallen durch die Schwerkraft in der 60 mm Zelle Kulturschale mit eiskalten Dissektion Medium durch den Kopf direkt über die Schüssel auf den Kopf drehen und lassen Sie die letzten Verwachsungen mit einer kleinen Schere, wenn erforderlich.
  9. Mit feinen Pinzette, orientieren sich das Gehirn mit der dorsalen Seite gegenüber des Forschers und der Bauchseite liegen auf dem Boden der Schale.
  10. Unter dem Binokular verwenden der bildenden Geraden Zange zu immobilisieren das Gehirn auf der Seite des Vorderhirns und berühren das Hinterhirn, da es beschädigt werden könnte. Trennen Sie das Hinterhirn vom Rest des Gehirns (Vorder- und Mittelhirn, schematische Abbildung 1Aasehen), mit schönen geraden Pinzette. Um das Kleinhirn vom Rest der Hinterhirn zu trennen, verwenden die feine Pinzette, um zerebelläre fruchtbaren unter dem Kleinhirn zu schneiden (siehe Schaltplan auf Abbildung 1Aa').
  11. Sobald das Kleinhirn isoliert ist, sorgfältig reißen Sie die Hirnhaut mit Fine-gerade Pinzette (siehe Schaltplan auf Abbildung 1Aa').
  12. Das Kleinhirn sanft mit der feinen gebogenen Zange halten und legen es mit der dorsalen Seite nach oben auf die Kunststoff-Plattform senkrecht zur Rasierklinge Chopper (siehe schematische Abbildung 1Bb).
  13. Überschüssiges Öl abzusaugen Dissektion Medium rund um das Kleinhirn mit einer sterilen dünn-End Pipettenspitze angepasst auf 1 mL pipette (siehe schematische Abbildung 1Bb).
  14. Sicherstellen Sie, dass das Kleinhirn flach liegt, aber ist nicht gedehnt wird, einmal auf die Plattform zu optimalen sagittale Scheiben während Stationspunkte (siehe schematische auf Abbildung 1Bb) gelegt.
  15. Scheibe 300 μm dicken sagittale Abschnitte des Kleinhirns mit Gewebe-Chopper (siehe Schaltplan auf Abbildung 1Bb'). Die Kraft und die Geschwindigkeit des Messers müssen vor Ort optimiert werden.
  16. Vorsichtig einen Tropfen der Dissektion Medium auf die in Scheiben geschnittenen Kleinhirn. Verwenden eine weite Bohrung Pipettenspitze platziert auf einer 1-mL-Pipette, langsam aspirieren Sie die in Scheiben geschnittenen Kleinhirn und zurück in die 60 mm Zelle Kulturschale mit eiskalten Dissektion Medium zu übertragen (siehe Schaltplan auf Abbildung 1Bb'').
  17. Reinigen Sie die Gewebe Chopper Kunststoff Plattform mit 100 % Ethanol zwischen jedes Kleinhirn schneiden. Lassen Sie das Ethanol verdunsten kann, bevor das nächste Kleinhirn auf der Plattform platzieren.
  18. Verwenden Sie zwei bildenden Geraden Zange (oder alternativ Titan-Nadeln) um einzelne Segmente zu trennen und die Vermis 6-8 Scheiben auswählen (siehe schematische Abbildung 1Cc und 1Cc').
  19. Nehmen Sie eine 6-Well-Platte mit Kultur-Einsätze und bis zu 4 ausgewählten Scheiben auf einer Kultur einfügen zusammen mit einigen Dissektion Medium, mit einer weiten Bohrung Pipettenspitze angepasst auf einer 1-mL-Pipette (siehe Schaltplan auf Abbildung 1Cc').
  20. Legen Sie die Scheiben in der Mitte der Kultur einfügen mit Hilfe der Dissektion Medium oder Zangen drücken und ziehen sie sanft in die richtige Position, sie miteinander in Kontakt sein zu vermeiden (siehe Schaltplan auf Abbildung 1Cc').
  21. Entfernen Sie überschüssiges Dissektion Medium um die Scheiben mit einem dünnen Ende Pipettenspitze. Stellen Sie sicher, dass die Scheiben flach auf der Membran liegen (siehe Schaltplan auf Abbildung 1Cc').
  22. Platz 6-Well-Platte in den Brutkasten sofort nach dem Hinzufügen der Scheiben auf der Membran.

5. Scheiben Kultur und Demyelinisierung (Hands-on-Zeit ≈ 15 – 20 min.)

Hinweis: Führen Sie diesen Schritt in einem Fluss-Kultur-Abzug unter sterilen Bedingungen

  1. Ersetzen Sie das Kulturmedium mit 1 mL pro Bohrloch vorgewärmt und gepufferten frisches Kulturmedium alle 3 Tage nach der Herstellung der Scheibe.
  2. Entfernen Sie für Demyelinisierung alle Kulturmedium unten die Kultur nach 6 Tagen in vitro (DIV) fügt zu und ersetzen Sie es mit 1 mL pro Bohrloch vorgewärmte frische Kulturmedium enthaltend 0,5 mg/mL LPC. 15-17 h bei 37 ° C, 5 % CO2inkubieren.
  3. Waschen Sie nach der Inkubation die Einsätze indem man sie in einer 25 mm Petrischale mit 1 mL vorgewärmten Kulturmedium.
    Hinweis: Die Einsätze sollte mit dem Medium in Kontakt, aber nicht von ihr abgedeckt werden.
  4. Sofortüberweisung die Kultur-Einsätze in eine neue 6-Well-Platte mit frischen vorgewärmten Kulturmedium.
  5. Ersetzen Sie das Kulturmedium mit 1 mL vorgewärmten frisches Kulturmedium alle 2-3 Tage bis Scheiben Fixierung.

6. Immunohistochemistry (Hands-on-Zeit ≈ 01:30 – 2 h)

Hinweis: Führen Sie die Schritte 6.1. 6.3. unter einem Abzug. Vermeiden Sie Exposition gegenüber Paraformaldehyd (PFA) und beziehen sich auf die Produkt-Sicherheitsdatenblatt für angemessene Manipulation und Schutz.

  1. Verwendung Zangen, jede Kultur heben fügt halten die Kunststoffkante und entfernen Sie das Kulturmedium unter der Membran-Einsätze aus jedem Brunnen.
  2. Fix die zerebelläre Scheiben für 30 min durch Zugabe von 2 mL 4 % PFA in 1 x PBS pH-Wert 7,4 auf die Membran-Einsätze.
    Hinweis: Der Zeitpunkt der Fixierung richtet sich nach der Stufe der Myelinisierung studierte: 4 DIV entspricht dem Beginn der Myelinisierung, 7 DIV, um völlig Markhaltige Scheiben. Im Falle von LPC Behandlung entspricht 9 DIV auf den Gipfel der Demyelinisierung, 11 DIV zu Beginn der Remyelinisierung und 14 DIV, um voll Remyelinated Scheiben.
  3. Waschen Sie die Einsätze mit den Scheiben dreimal mit 2 mL 1 X PBS 10 min. lang.
  4. Trennen Sie die Scheiben von der Membran-Einsätze unter dem Binokular mit einer 25 X 30 X Vergrößerung, durch leichten Druck mit einem Skalpell oder einer Bürste. Alternativ um das Risiko einer Beschädigung der Scheiben beim trennen sie von der Membrane zu vermeiden, können Sie ein Skalpell schneiden Sie die Membran mit den Scheiben noch befestigt.
  5. Übertragen Sie die schwimmenden Scheiben in die Vertiefungen einer 4-Well-Platte mit 1 X PBS, mit einem Pinsel.
  6. Aspirieren der PBS aus jedem Brunnen und die Scheiben in vorgekühlte 100 % Ethanol bei-20 ° C für 15 bis 20 min inkubieren. Dieser Schritt erleichtert das Eindringen der Antikörper in Markhaltige Fasern.
  7. Aspirieren Sie die 100 % Ethanol und waschen Sie einmal kurz mit 1 x PBS, dann zweimal mit 1 X PBS-Puffer für 10 min bei Raumtemperatur.
  8. Aspirieren der PBS und inkubieren Sie die Scheiben für 30 bis 45 Minuten mit einer Lösung mit 1 x PBS, 5 % NGS, 0,3 % nicht-ionische Waschmittel bei Raumtemperatur, unspezifische Antikörper Fixierung Seiten zu sperren.
  9. Aspirieren Sie die blockierende Lösung. Keine Waschmaschine ist notwendig.
  10. Inkubieren Sie die Scheiben über Nacht mit dem primären Antikörper verdünnt in blocking-Lösung bei 4 ° c Um das Myelin auf zerebelläre organotypischen Scheiben zu visualisieren, zu verwenden, MBP (Huhn, 1/150 oder Maus IGg2b, Smi99, 1/200) oder PLP (Ratte, Hybridom, 1/5 bis 1/10) Antikörper.
    Hinweis: Um den Ausdruck von mehr als einem Antigen in der gleichen Scheibe sichtbar zu machen, führen Sie ein Doppel- oder dreifach Färbeverfahren (siehe Abbildung 1 als Beispiel). Um die Inkubation gleichzeitig ausführen, sicherstellen Sie, dass primäre Antikörper in verschiedenen Arten hergestellt werden. Verwenden Sie dann ihre entsprechende sekundäre Antikörper gekoppelt an verschiedenen Fluorophore (siehe Tabelle der Materialien für Knoten- und Paranodal Marker18 Antikörper).
  11. Am zweiten Tag waschen Sie die Scheiben dreimal mit 1 X PBS-Puffer für 10 min.
  12. 3h mit der Sekundärantikörper verdünnt in blocking-Lösung (Verdünnung 1: 500) im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren.
    Hinweis: Optimierung der Antikörper Verdünnung und Inkubation Zeit kann erforderlich sein, wenn andere Antikörper als beschrieben hier verwenden.
  13. Waschen Sie die Scheiben dreimal mit 1 X PBS-Puffer für 10 min in der Dunkelheit.
  14. Montieren Sie unter einem Binokular die Scheiben auf einen Objektträger. 100 µL 1 X PBS auf der Folie platzieren und die Scheiben in die PBS mit einem Pinsel übertragen. Entfalten Sie die Scheiben zu, wenn nötig und glätten sie auf der Folie. Entfernen Sie überschüssiges Öl von PBS. Für den Fall, dass die Immunolabeling mit den Scheiben noch angebracht Membranen durchgeführt wird, mit der Scheiben mit Blick auf das Deckglas mit der Membran auf den Objektträger zu montieren.
  15. Geben Sie einen Tropfen Eindeckmedium direkt auf das Glas Deckglas und decken Sie sanft die Scheiben zu. Gerahmte Dias können mehrere Monate bei 4 ° C im Dunkeln aufbewahrt werden.

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Ergebnisse

Beispiele für repräsentative Myelin Immunostainings in organotypischen zerebelläre Scheiben von P9 P10 C57black6 Wildtyp (WT) (Abbildung 2A), sowie PLP-GFP transgene Mäuse (Abb. 2 b), zusammen mit Purkinje-Zellen, die Färbung erhalten. Zerebelläre Scheiben von der weißen Substanz myelinisieren verfolgt Region der Scheiben in Richtung der Peripherie der Folia und Myelinisierung der Purkinje-Zellen erfolgt meist nach 6 bis 7 DIV. B...

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Diskussion

Hier wir ausführlich ein Protokoll zum Generieren einer Ex Vivo Modell entspricht der Maus zerebelläre organotypischen Slice Kulturen adaptiert von zuvor veröffentlichten Methoden15,16,19 und das anschließende Myelin Immunostaining dieser Präparate. Diese Strategie bietet die Möglichkeit, Myelin-Komponenten mit einem hochauflösenden in gesunden und pathologischen Zuständen zu visualisieren.

Zerebellär...

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Offenlegungen

Die Autoren keine konkurrierenden Interessen oder widersprüchliche Interessen.

Danksagungen

Wir danken Dr. Sean Freeman, Dr. Nathalie Sol-Foulon und Dr. Thomas Roux für wertvolle Hinweise auf das Manuskript. Diese Arbeit wurde finanziert durch INSERM, ICM, ARSEP Zuschüsse R13123DD, ANR R17127DD (bis n. Chr.) und FRM Fellowship, SPF20110421435 (zu n. Chr.), FDT20170437332 (zu M.T.). Wir danken die CELIS-Zelle-Kultur-Anlage und das Icm. Quant Bildgebungsplattform.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BME mediumThermoFisher Scientific41010026
Hank' s Balanced Salt Solution (10x HBSS)ThermoFisher Scientific14180046
GlutaMAX (100x)ThermoFisher Scientific35050038
Hitzeinaktiviertes PferdeserumThermoFisher Scientific26050088
Penicillin– Streptomycin (10.000 I.E./ml)ThermoFisher Scientific15140122
Gey' s Balanced Salt SolutionSigma AldrichG9779-500ML
D-Glucose Lösung (45%)Sigma AldrichG8769-100ML
Lysophosphatidylcholin (LPC)Sigma AldrichL4129-100MG
Paraformaldehyd (PFA)Elektronenmikroskopie Sciences15714
Absolutes Ethanol (100% Ethanol)VWR Chemicals20821.330Gekühlt bei -20°; C
Triton® X-100Sigma AldrichX100-500ML
10% normales Ziegenserum (NGS)ThermoFisher Scientific500622
Phosphat-PufferlösungEuroMEDEXET330-ApH 7,4
Anti-GFP Antikörper (polyklonal, Huhn)Merck Millipore06-896Verdünnung 1/300
Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antikörper (polyklonal, Huhn)Merck MilliporeAB9348Verdünnung 1/150
Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antikörper (monoklonal, Maus IgG2b)Merck MilliporeNE1019Verdünnung 1/200
Anti-PLP Antikörper (Ratte, Hybridom)Geschenk von Dr. K. Ikenaka; Okasaki, JapanVerdünnung 1/5 bis 1/10
Anti-Natriumkanal, Pan Antikörper (monoklonal, Maus IgG1, Klon K58/35)Sigma AldrichS8809Verdünnung 1/150
Anti-Caspr Antikörper (polyklonal, Kaninchen)Abcamab34151Verdünnung 1/500
Ziege Sekundärantikörper konjugiert mit Alexa Fluor 488, 594, 647 oder 405ThermoFisher ScientificVerdünnung 1/500
FluoromountSouthernBiotech0100-20
GewebehackerMcIlwain
Rasierklingen
Große SchereF.S.T14101-14
Kleine SchereF.S.T91500-09
Fein-gerade PinzetteF.S.T91150-20
Gebogen-feine PinzetteF.S.T11297-00
Zellkulturschalen (60 mm und 100 mm)TPP
4-, 6-Well-KulturplattenTPP
Millicell-Kultureinsätze (0,4 & Mikro; m, 30 mm Durchmesser)Merck MilliporePICM0RG50
Zellkultur-Inkubator37° C, 5 % CO2
Feinend-PipettenspitzenDutscher134000CL
Pipettenspitzen mit breitem DurchgangThermoFisher Scientific2079G
Sterile SpritzeTerumo Europe20 oder 50 mL
Sterile SpritzenvorsatzfilterTerumo Europe0,22 µ m
SkalpellSwann-Morton0510
Pinsel
ObjektträgerRS Frankreich76 mm x 26 mm x 1,1 mm
GlasdeckgläserRS Frankreich22 mm x 22 mm
Kimtech Sciences GewebewischerKimberly-Clark Professional5511
Binokulares Mikroskop

Referenzen

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Myelin Immunf rbungGewebedissectionIsolation des CerebellumsVorbereitung von SchnittkulturenLPC DemyelinisierungImmunhistochemisches VerfahrenMyelin RemyelinisierungRanvier Schn rringPLP GFP transgen

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