Hemmung der Aspergillus Flavus Wachstum und Aflatoxin in transgenen Mais mit dem Ausdruck der α-Amylase-Inhibitor von Lablab Purpureus L.

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll um Aspergillus Flavus Wachstum und Aflatoxin in Maiskörner mit dem Ausdruck einer antimykotischen Proteins zu analysieren.  Mit GFP exprimierenden A. Flavus Belastung überwacht wir die Infektion und die Ausbreitung des Pilzes in Reife Kerne in Echtzeit. Der Test ist schnell, zuverlässig und reproduzierbar.

Abstract

Aflatoxinkontamination in Nahrungs-und Futtermitteln ist eine große Herausforderung weltweit. Aflatoxine, produziert durch den Pilz Aspergillus Flavus (A. Flavus) sind potente Karzinogene, die Ernte Wert in Mais und andere Öl reiche Ernten wie Erdnuss neben posieren ernsthafte Bedrohung für die menschliche und tierische Gesundheit erheblich reduzieren. Unterschiedliche Ansätze, einschließlich der klassischen Züchtung, transgene Ausdruck von Widerstand verbunden sind Proteine und RNA-Interferenz (RNAi)-basierten Host-induzierte Gen-silencing von kritischen A. Flavus gen Ziele werden ausgewertet, um zu erhöhen Aflatoxin Widerstand in anfälligen Pflanzen. Frühere Studien haben gezeigt, dass eine wichtige Rolle in der Pathogenese und Aflatoxin Produktion A. Flavus , schlägt dieses Gen/Enzym α-Amylase ist ein potenzielles Ziel, A. Flavus Wachstum und Aflatoxin-Produktion zu reduzieren. In diesem Zusammenhang wurde die aktuelle Studie durchgeführt, um heterologen Expression (unter Kontrolle der konstitutiven CaMV 35 s -Promoter) eines Lablab Purpureus L. α-Amylase-Inhibitor-ähnlichen Proteins (AILP) im Mais gegen A. Flavusbewerten. AILP ist ein 36-kDa-Protein, das ist ein kompetitiver Inhibitor des Enzyms A. Flavus α-Amylase und gehört zur Familie der Lektine – Arcelin – α-Amylase-Inhibitor Protein gemeinsam Bohne. In-vitro-Studien vor der aktuellen Arbeit hatte die Rolle des AILP bei der Hemmung von A. Flavus α-Amylase-Aktivität und Pilzwachstum gezeigt. Pilzwachstum und Aflatoxin-Produktion in Reife Kerne wurden mit GFP exprimierenden A. Flavus Belastung in Echtzeit überwacht. Dieser Kernel screening Assay (KSA) ist sehr einfach einzurichten und bietet zuverlässige und reproduzierbare Daten auf Infektion und das Ausmaß der Ausbreitung, die quantifiziert werden konnte zur Beurteilung von Genetik und transgenen Linien. Die Fluoreszenz von den Strapazen der GFP ist eng korreliert, pilzartige Wachstum und durch Verlängerung, es ist gut für Aflatoxin-Werte korrelierten.  Das Ziel der aktuellen Arbeit war, dieses Vorwissen in ein kommerziell wichtigen Getreide wie Mais, Aflatoxin Widerstand erhöhen zu implementieren. Unsere Ergebnisse zeigen eine Ermäßigung von 35 % – 72 % A. Flavus Anstieg AILP exprimierenden transgener Maiskörner, die wiederum in einer 62 bis 88 % Verringerung Aflatoxin übersetzt.

Introduction

Mykotoxinbelastungen durch die Pilz-Gattungen, Aspergillus, Fusarium, Penicilliumund Alternaria ist ein großes Problem der Lebensmittel und Futtermittel angebauten weltweit^1,2,3. Unter diesen phytopathogenen Pilzen hat Aspergillus die höchsten negative Auswirkungen auf die Ernte Wert und die Gesundheit von Mensch und Tier. Aspergillus flavus (A. Flavus) ist eine opportunistische Pflanze-Erreger, die infiziert Öl reichen Ernten wie Mais, Baumwollsaat und Erdnuss und produziert die potente Karzinogene, Aflatoxine, s....

Protocol

(1) Plasmid Konstrukte und Mais transformation

1. PCR verstärkt Lablab AILP mithilfe der Primer 5'-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 'und 5'-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3"einfügen. Die PCR-Bedingungen umfassen einen anfängliche Denaturierung Schritt bei 98 ° C für 30 s (Schritt 1), gefolgt von Denaturierung bei 98 ° C für 10 s (Schritt 2), Glühen bei 55 ° C für 30 s (Schritt 3), Dehnung bei 72 ° C für 20 s (Schritt 4), 31 Zyklen von Schritt 2 zu Schritt 4 , und eine endgültige Dehnung Schritt bei 72 ° C für 5 min. Klon das PCR-Produkt in einer modifizierten pCAMBIA 1.300 Vektor mit Xbaich und Pstich Restriktionsschnittstellen. Reihe....

Results

Mais-Transformation und molekulare Screening von transgenen Pflanzen

Unreife Embryonen Hi-II-Maislinien verwandelten sich mit Agrobacterium Tumefaciens EHA101 Stamm, enthält die letzte Pflanze Ziel Vektor mit dem Ausdruck der Lablab Purpureus AILP gen unter der Kontrolle des CaMV- 35 s Promotor. Fünf unabhängig transformierte Maislinien wurden an die T6-Generation für nachfolg.......

Discussion

Ertragsverluste bei landwirtschaftlichen Nutzpflanzen durch Erreger und Schädlinge ist ein globales Problem-²⁰. Derzeit, Anwendung von synthetischen Fungiziden und Pestiziden ist das vorherrschende Mittel für steuernde Anlage Krankheitserreger und Schädlinge, aber passives Toxizität von diesen Biochemikalien in Lebens- und Futtermitteln kann ernsthafte Bedrohung für die menschliche und tierische Gesundheit²¹darstellen. Angesichts der wirtschaftlichen Bedeutung der Mais als .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Caisson
Amazing Marine Goop	Eclectic Products
C1000 Touch CFX96 Echtzeit-System	Bio-Rad
Corning  Falcon Gewebekulturschalen, 60 mm	Fisher Scientific	08-772F
Eppendorf  5424 Mikrozentrifuge	Fisher Scientific
Erlenmeyerkolben mit Stopfen, 50 mL	Ace Glass	6999-10
Ethanol
FluoroQuant Afla	Romer Labs	COKFA1010
geriffelte qualitative Filterpapierkreise, 15 cm	Fisher Scientific	09-790-14E
Force Air Oven	VWR
FQ-Reader	Romer Labs	EQFFM3010
Geno/Grinder 2010	OPS Diagnostics	SP 2010-115
Verbesserte PolyVinylAlkohol Organic Solvent Resistant Handschuhe	Ansell	012-15-554
Innova 44 Inkubator Shaker	Brunswick Scientific
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad	1708890
flüssiger Stickstoff
Low Form Griffin Becher, 100 mL	DKW Life Sciences	14000-100
Methanol
Methylenchlorid
Nexttec 1-stufiges DNA-Isolationskit für Pflanzen	Nexttec	47N
Nikon Eclipse E600 Mikroskop mit Nikon DS-Qi1 Kamera	Nikon
Nikon SMZ25 Stereomikroskop mit C-HGFI Episcopic Illuminator und Andor Zyla 4.2 sCMOS-Kamera	Nikon
Nunc Square BioAssay Dishes	ThermoFisher Scientific	240835
Phire Plant Direct PCR Kit	ThermoFisher Scientific	F130WH
Polycarbonat-Fläschchen, 15 ml	OPS Diagnostics	PCRV 15-100-23
Kartoffel Dextrose-Bouillon-Schnappverschluss
, 22 mm	DKW Life Sciences	242612
Natriumphosphat zweibasisches Heptahydrat	Sigma-Aldrich
Natriumphosphat monobasisches	Sigma-Aldrich
Spectrum Plant Total RNA Kit	Sigma-Aldrich	STRN50
Edelstahl-Schleifkugeln, 3/8''	OPS Diagnostics	GBSS 375-1000-02
Rührplatte
Synergy 4 Fluorometer	Biotek
T100 Thermocycler	Bio-Rad
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-9284
V8 Saft	Campbell's
Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Klasse 3	Fisher Scientific	09-820P
Schüttler am Handgelenk	Burrell Scientific