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Methodenartikel

Hemmung der Aspergillus Flavus Wachstum und Aflatoxin in transgenen Mais mit dem Ausdruck der α-Amylase-Inhibitor von Lablab Purpureus L.

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DOI:

10.3791/59169

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15. Februar 2019

 ,  ,  ,  , 
1Southern Regional Research Center, USDA-ARS, Food and Feed Safety Research Unit, 2Department of Plant Pathology, University of Arkansas

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll um Aspergillus Flavus Wachstum und Aflatoxin in Maiskörner mit dem Ausdruck einer antimykotischen Proteins zu analysieren.  Mit GFP exprimierenden A. Flavus Belastung überwacht wir die Infektion und die Ausbreitung des Pilzes in Reife Kerne in Echtzeit. Der Test ist schnell, zuverlässig und reproduzierbar.

Zusammenfassung

Aflatoxinkontamination in Nahrungs-und Futtermitteln ist eine große Herausforderung weltweit. Aflatoxine, produziert durch den Pilz Aspergillus Flavus (A. Flavus) sind potente Karzinogene, die Ernte Wert in Mais und andere Öl reiche Ernten wie Erdnuss neben posieren ernsthafte Bedrohung für die menschliche und tierische Gesundheit erheblich reduzieren. Unterschiedliche Ansätze, einschließlich der klassischen Züchtung, transgene Ausdruck von Widerstand verbunden sind Proteine und RNA-Interferenz (RNAi)-basierten Host-induzierte Gen-silencing von kritischen A. Flavus gen Ziele werden ausgewertet, um zu erhöhen Aflatoxin Widerstand in anfälligen Pflanzen. Frühere Studien haben gezeigt, dass eine wichtige Rolle in der Pathogenese und Aflatoxin Produktion A. Flavus , schlägt dieses Gen/Enzym α-Amylase ist ein potenzielles Ziel, A. Flavus Wachstum und Aflatoxin-Produktion zu reduzieren. In diesem Zusammenhang wurde die aktuelle Studie durchgeführt, um heterologen Expression (unter Kontrolle der konstitutiven CaMV 35 s -Promoter) eines Lablab Purpureus L. α-Amylase-Inhibitor-ähnlichen Proteins (AILP) im Mais gegen A. Flavusbewerten. AILP ist ein 36-kDa-Protein, das ist ein kompetitiver Inhibitor des Enzyms A. Flavus α-Amylase und gehört zur Familie der Lektine – Arcelin – α-Amylase-Inhibitor Protein gemeinsam Bohne. In-vitro-Studien vor der aktuellen Arbeit hatte die Rolle des AILP bei der Hemmung von A. Flavus α-Amylase-Aktivität und Pilzwachstum gezeigt. Pilzwachstum und Aflatoxin-Produktion in Reife Kerne wurden mit GFP exprimierenden A. Flavus Belastung in Echtzeit überwacht. Dieser Kernel screening Assay (KSA) ist sehr einfach einzurichten und bietet zuverlässige und reproduzierbare Daten auf Infektion und das Ausmaß der Ausbreitung, die quantifiziert werden konnte zur Beurteilung von Genetik und transgenen Linien. Die Fluoreszenz von den Strapazen der GFP ist eng korreliert, pilzartige Wachstum und durch Verlängerung, es ist gut für Aflatoxin-Werte korrelierten.  Das Ziel der aktuellen Arbeit war, dieses Vorwissen in ein kommerziell wichtigen Getreide wie Mais, Aflatoxin Widerstand erhöhen zu implementieren. Unsere Ergebnisse zeigen eine Ermäßigung von 35 % – 72 % A. Flavus Anstieg AILP exprimierenden transgener Maiskörner, die wiederum in einer 62 bis 88 % Verringerung Aflatoxin übersetzt.

Einleitung

Mykotoxinbelastungen durch die Pilz-Gattungen, Aspergillus, Fusarium, Penicilliumund Alternaria ist ein großes Problem der Lebensmittel und Futtermittel angebauten weltweit1,2,3. Unter diesen phytopathogenen Pilzen hat Aspergillus die höchsten negative Auswirkungen auf die Ernte Wert und die Gesundheit von Mensch und Tier. Aspergillus flavus (A. Flavus) ist eine opportunistische Pflanze-Erreger, die infiziert Öl reichen Ernten wie Mais, Baumwollsaat und Erdnuss und produziert die potente Karzinogene, Aflatoxine, sowie zahlreiche giftige sekundäre Pflanzenstoffe (SMs). Mais ist ein wichtiges Nahrungsmittel und Futtermittel weltweit angebaut und ist sehr anfällig für Verunreinigungen durch A. Flavus. Die wirtschaftliche Auswirkungen einer Aflatoxinkontamination auf verliert und Minderwert bei Mais kann so viel wie $ 686,6 Millionen/Jahr in den USA2 mit prognostizierten Veränderungen des globalen Klimas, die Auswirkungen von Aflatoxinen kann dazu führen, dass größere wirtschaftliche Verluste in Mais mit Schätzungen so hoch wie $ 1,68 Milliarden/Jahr in die nahe Zukunft2. Angesichts der wirtschaftlichen und gesundheitlichen Beeinträchtigungen von Aflatoxinen in Mensch und Tier, möglicherweise vor der Ernte Aflatoxin Kontrolle im Mais der effizienteste Weg zur Verhinderung von Aflatoxinkontamination in Lebensmitteln und Futtermitteln.

Die großen vor der Ernte Kontrollansatz für Aflatoxin Widerstand in Mais, der in den letzten Jahrzehnten eingesetzt hat ist in erster Linie durch Züchtung, die eine erhebliche Menge an Zeit4erfordert. Vor kurzem hatte Biocontrol einige Erfolge bei der Reduzierung der Aflatoxin in groß angelegte Feld Anwendungen5,6. Neben Biocontrol hatte Anwendung modernster molekularer Tools wie z. B. "Host induzierte Gen-Silencing" (HIGS) durch RNAi und transgene Ausdruck des Widerstands-assoziierte Proteine einige Erfolge bei der Reduzierung von A. Flavus Wachstum und aflatoxin Produktion in kleinem Maßstab Labor- und Studien. Diese Ansätze werden derzeit neben der Identifizierung von neuen potenziellen A. Flavus gen Zielen für zukünftige Manipulation optimiert.

Neben Gene, die Mykotoxinproduktion als potentielle Ziele von transgenen Kontrollstrategien direkt beteiligt sind, haben Pilze Amylasen gezeigt worden, um eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Pathogenese und Mykotoxin-Erfolgsproduktion in frühen Phasen der Host-Pflanze-Infektion. Ein paar Beispiele Pythium Pleroticum (kausaler Agent Ingwer Rhizom Fäulnis), Fusarium Solani (kausaler Agent der Blumenkohl willst), wo positive Korrelationen zwischen Pathogenität und α-Amylase Expression und Aktivität beobachtet 7,8. Hemmung der α-Amylase-Aktivität durch gen-Knockout oder Knockdown Ansätze wirkt sich negativ auf Pilz Wachstum und Toxin-Produktion. Ein α-Amylase-Ko-Mutante von A. Flavus konnte Aflatoxine wenn auf Stärke Substrat oder entkeimten Maiskörner9gewachsen zu produzieren. In Fusarium Verticillioides , keine α-Amylase Ko-Belastung während der Infektion von Maiskörnern10Fumonisin B1 (Mykotoxine) produzieren. In einer neueren Studie Gilbert Et Al. (2018) gezeigt, dass ein RNAi-basierten Knock down- A. Flavus α-Amylase Ausdrucksformen durch HIGS A. Flavus Wachstum und Aflatoxin Produktion während Maiskorn Infektion11 deutlich reduziert .

Spezifische Inhibitoren der α-Amylase-Aktivität haben auch ähnliche Ergebnisse produziert, wie Down-Regulierung der α-Amylase Ausdruck entnommen. Der erste Bericht über die Rolle der ein α-Amylase-Inhibitor in Pilzresistenz kamen aus der Isolierung und Charakterisierung von einer 14-kDa-Trypsin-α-Amylase-Inhibitor von Maislinien resistent gegen A. Flavus12. Weitere screening von mehreren hundert Pflanzenarten Fakhoury und Woloshuk führten zur Identifizierung eines 36-kDa α-Amylase-Inhibitor-ähnlichen Proteins (AILP) aus den Samen der Hyazinthe Bohnen, Lablab Purpureus L.13. Der Peptidsequenz AILP glich Lektine aus der Familie der Lektine – Arcelin – α-Amylase-Inhibitor berichtet gemeinsam Bohne14,15. Gereinigten AILP wird keine hemmende Aktivität gegenüber Säugetieren Trypsin und weitere in-vitro Charakterisierung zeigte deutliche Hemmung der A. Flavus Wachstum und conidial Keimung13aufweisen. Die Berichte hier eindeutig zeigt α-Amylase kann dienen als Target in der Steuerung Ansätze beschränken, Krankheitserreger oder Schädlinge, die abhängig von Stärke Mobilisierung (durch α-Amylase-Aktivität) und Erwerb der lösliche Zucker als Energiequelle während ihrer Pathogene Interaktion mit Wirtspflanzen.

Alpha-Amylase ist bekannt, dass kritische A. Flavus Pathogenität9,10,11, und angesichts der Bedeutung der AILP als ein potenter Anti-A. Flavus Agent (α-Amylase Hemmung/Antigrowth)13, Wir generierten transgene Maispflanzen mit dem Ausdruck Lablab AILP gen unter der konstitutiven CaMV-35 s-Promoter. Ziel war es zu untersuchen, ob heterologen Expression von dieser α-Amylase-Inhibitor in Mais gegen A. Flavus Pathogenese und Aflatoxin Produktion während Maiskorn Infektion wirksam ist. Unsere Ergebnisse zeigen, dass transgene Maiskörner mit dem Ausdruck AILP deutlich A. Flavus Wachstum und Aflatoxin Produktion während der Kernel-Infektion reduziert.

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Protokoll

(1) Plasmid Konstrukte und Mais transformation

  1. PCR verstärkt Lablab AILP mithilfe der Primer 5'-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 'und 5'-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3"einfügen. Die PCR-Bedingungen umfassen einen anfängliche Denaturierung Schritt bei 98 ° C für 30 s (Schritt 1), gefolgt von Denaturierung bei 98 ° C für 10 s (Schritt 2), Glühen bei 55 ° C für 30 s (Schritt 3), Dehnung bei 72 ° C für 20 s (Schritt 4), 31 Zyklen von Schritt 2 zu Schritt 4 , und eine endgültige Dehnung Schritt bei 72 ° C für 5 min. Klon das PCR-Produkt in einer modifizierten pCAMBIA 1.300 Vektor mit Xbaich und Pstich Restriktionsschnittstellen. Reihenfolge der letzten Pflanze Ziel Vektor, die Ausrichtung und die Sequenz des Gens geklonte AILP im Vektor zu bestätigen.
  2. Agrobakterium Stamm EHA101 mit dem letzten Vektor-Konstrukt (Abbildung 1) als früher beschriebenen 16zu verwandeln.
  3. Nutzung umgewandelt Agrobacterium , enthält die letzte Pflanze Ziel Vektor, unreifen Mais (Zea Mays L. Hi-II) Embryonen (die Pflanze Transformation Anlage der Iowa State University durchgeführt) zu verwandeln 16.
  4. T0 Pflanzen im Gewächshaus (26-29 ° C; 16/8 h Photoperiode ergänzt mit Hochdruck Na-Lampen) und wiederholt werden um T-6 -Generation um Homozygotie für transgene Merkmal zu erreichen zu erhalten.

2. Spore Keimung assay

  1. Blattproben zu ernten und Lagern bei-80 ° C. Blattproben mit einem Mörser und Stößel mit flüssigem Stickstoff zu mahlen. In 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen 0,5 g wiegen Sie ab, fügen Sie 17 µL Protease-Inhibitor hinzu und legen Sie Rohre auf Eis.
  2. Zentrifugieren Sie Rohre für 10 min bei 16.000 X g. 225 µL Pflanzenextrakt zu 0,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und auf Eis.
  3. Bereiten Sie in einem 15 mL Zentrifugenröhrchen eine 5 mL-Spore-Aussetzung der Aspergillus Flavus 70 – GFP in 1 %-Kartoffel-Dextrose-Bouillon (w/V). Wirbel und Spore Konzentration 105 Sporen/ml mit einem Zählkammern anpassen.
    Achtung: A. Flavus produziert Aflatoxine, alle Arbeiten mit dieser Pilz in einem biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt werden.
  4. Brüten Sie in PDB bei 28 ° C bis Kultur 50 % Initiation der Spore Keimung erreicht durch Vorwölbung der Sporen.
  5. Wirbel und aliquoten 25 µL Spore-Lösung für die 225 µL Pflanze zu extrahieren. 20 Stunden bei 28 ° C mit intermittierenden schütteln inkubieren Sie Proben.
  6. Aliquoten 25 µL Spore-Lösung auf einem Objektträger und Messen Sie die Länge der Keim Röhren Sporen mit der Digitalkamera-Software. Verwenden Sie ein Minimum von 20 wiederholte Messungen für jede Zeile.
    Hinweis: In dieser Phase legen Sie alle Kulturen bei 4 ° C Kolonie Wachstumsstop bis bereit zu zählen.

3. Kernel Screening Assay (KSA)

  1. KSA-Kappen durch Kleben 4 Snap Caps (22 mm) in einer Petrischale 60 x 15 mm zu konstruieren. Lassen Sie Kleber für 48 Stunden trocknen, bevor Sie Kappen verwenden. Jede KSA-Kappe bildet ein Rep (Abbildung 2).
  2. Sprühen Sie in einem sterilen biologischen Sicherheitsschrank eine quadratischen Bioassay-Fach (24 x 24 cm) mit 70 % Ethanol: H2O (V/V) und lassen Sie an der Luft trocknen. Das Fach sterile Chromatographiepapier hinzufügen. Sprühen Sie 9 KSA-Kappen mit 70 % Ethanol, lassen Sie Luft trocknen, und legen Sie in die Bioassay-Fach.
  3. Für jeden getesteten transgenen Maislinie 20 unbeschädigt Kerne auswählen und platzieren in einem 50 mL Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie 70 % Ethanol und 4 Minuten ruhen lassen. Schütteln Sie Röhren während der Sterilisation. Gießen Sie das Ethanol und spülen Kerne dreimal in sterilen entionisiertem H2O.
  4. Bereiten Sie eine Spore-Aussetzung der Aspergillus Flavus 70 – GFP17 aus einer 6 Tage alten Kultur auf V8-Medium (5 % V8 Saft, 2 % Agar, pH 5,2) angebaut.
    1. Fügen Sie 20 mL steriles 0,02 % Triton X-100/entionisiertem H2O (V/V) und Schrott aus Sporen mit einer sterilen Schleife. Aus dem Inokulum und in eine sterile 300 mL-Becherglas pipettieren.
    2. Vorbereiten eine 5-fold Verdünnung mit 0,02 % Triton x-100, führen Sie dann eine Spore-Zählung mit einem Zählkammern. Verdünnen Sie wieder, wenn notwendig, 100 mL mit einer Konzentration von 4 x 106 Sporen/mL zu erhalten.
  5. Kerne in einer sterilen 300 mL-Becherglas mit Stir Bar zu platzieren. Das Becherglas Inokulum hinzufügen.
    Achtung: Inokulum Kerne hinzufügen bewirkt Lösung zu spritzen. Becherglas auf einer Platte unter Rühren 3 Minuten lang. Nach 3 Minuten Inokulum in eine leere Becherglas abgießen.
  6. Mit einer Pinzette, legen Sie Kerne in die Bioassay-Teller (1 Kernel/GAP). Fügen Sie 30 mL entionisiertem Wasser am unteren Rand jeder Bioassay-Tablett und 7 Tage bei 31 ° C im Dunkeln inkubieren.
  7. Bereiten Sie Kerne für die Fotografie.
    1. 4 Kerne aus jeder Zeile für mikroskopische Analyse und Fotografie beiseite.
      Hinweis: Kerne können bei 4 ° C nicht länger als 5 Tage vor dem Abschluss Fotografie gespeichert werden.
    2. Fotografieren Sie Kerne nach sieben Tagen nach der Impfung mit A. Flavus (Abbildung 3).
    3. Saubere äußere der Kerne mit einem weichen Tuch und deionisiertes Wasser. Führen Sie Längsprofile der Kerne und sofort Fotografieren unter dem Fluoreszenz-Mikroskop.
  8. Kerne für die Analyse vorbereiten.
    1. Saubere Fassade der verbleibenden Kerne mit einem weichen Tuch und deionisiertes Wasser.
    2. Platz 4 Kerne, bilden 1 Rep, in einem 15 mL Schraubverschluss Polycarbonat Fläschchen mit 2 Kugeln aus rostfreiem Stahl. Sofort frieren Sie Fläschchen in flüssigem Stickstoff und Store bei-80 ° C bis zu Weiterverarbeitung und Analyse ein.
    3. -80 ° C Gefrierschrank entnehmen Sie Fläschchen und Mahlen Sie der Kerne in einem Homogenisator bei 1.500 u/min für 3 Minuten.
      Hinweis: Bewahren Sie Kerne mit flüssigem Stickstoff eingefroren.

(4) PCR-Screening von transgener Maiskörner

  1. Verwenden Sie DNA-Isolierung-Kit genomischen DNA (gDNA) isolieren aus pulverisierte Maiskörner infiziert mit A. Flavus gemäß den Anweisungen des Herstellers. 10-15 mg pulverisierte Maiskörner kurz, 280 µL Puffer F, 20 µL Protease und 3 µL Dithiothreitol (DTT) hinzufügen. Brüten und schütteln in einem Thermomixer (56 ° C, 1.200 u/min, 30 min). 10.000 x g für 1 min Zentrifugieren und den klare Überstand auf äquilibriert Spalte übertragen. Inkubation bei Raumtemperatur für 3 min und Zentrifuge bei 700 X g für 1 min zum gDNA eluieren.
  2. 0,8 µL der extrahierten gDNA zum Einrichten einer 20 µL-PCR-Reaktion für jede Probe mit einem PCR-Kit zu nehmen. Folgen Sie Thermocyclings Bedingungen, wie im Protokoll des Herstellers empfohlen. Die PCR-Bedingungen umfassen einen anfängliche Denaturierung Schritt bei 98 ° C für 5 min (Schritt 1) gefolgt von Denaturierung bei 98 ° C für 5 s (Schritt 2), Glühen bei 55 ° C für 5 s (Schritt 3), Dehnung bei 72 ° C für 20 s (Schritt 4), 40 Zyklen von Schritt 2 zu Schritt 4 , und eine endgültige Dehnung Schritt bei 72 ° C für 1 min (Schritt 5).
  3. Verwenden Sie vorwärts Primer 5'-TATACCACCCCCATCCGTGT-3' und reverse-Primer 5'-AGCTCGGAAGCAAAAGACCA-3 "bestätigen das Vorhandensein von Lablab AILP gen in transgener Maiskörner.

(5) RNA-Isolierung, cDNA Synthese und semi-quantitativen RT-PCR

  1. Nehmen Sie homogenisiert A. Flavus infiziert Maiskörner zuvor gespeichert bei-80 ° C für die RNA-Extraktion. Mit einem total RNA Isolierungskit laut Protokoll des Herstellers aber mit geringfügigen Änderung18RNA extrahieren. Mischen Sie nach Zugabe von 50 mg Pulver homogenisiert Maiskorn in dem Extraktionspuffer es gut (ohne Heizungsjobstep) mit einer 1 mL Pipettieren Spitze und lassen Sie es auf Eis für 5-6 Minuten, bevor Sie fortfahren Folgeschritte wie im Protokoll des Herstellers beschrieben.
  2. Bereiten Sie mithilfe eines cDNA Synthese Kits nach des Herstellers Protokoll 18cDNA.
  3. Verwenden Sie 0,5 µL unverdünnte cDNA pro PCR-Reaktion für semi-quantitativen RT-PCR als früher beschriebenen18. Verwenden Sie vorwärts und rückwärts Primer qAILP-F 5'-TCCCAACAAGGCAACTACTG-3' und qAILP-R 5' - CGGTGTCGAAGAGACCTAGATA - 3' bzw. zu erkennen Lablab AILP Genexpression und forward und reverse Primer qRib-F 5ʹ-GGCTTGGCTTAAAGGAAGGT-3ʹ und qRib-R 5ʹ-TCAGTCCAACTTCCAGAATGG-3ʹ bzw. für den Ausdruck von Mais ribosomale Strukturgen (Rib), GRMZM2G02483819 als Zimmermädchen gen.

(6) GLP Quantifizierung

  1. Bereiten Sie 50 mL 0,2 M monobasic Natriumphosphat (NaH2PO4) und 0,2 M Diabas-Natriumphosphat (Na2HPO4·7H2O) in entionisiertem H2O.
  2. 100 mL Phosphatpuffer pH 7,0 Sorenson bilden. Für pH 7,0 hinzufügen von 19,5 mL NaH2PO4 Lager, 30,5 mL NaHPO4·7H2O Lager und 50 mL entionisiertem H2O.
  3. 25 mg Kernel Mahlgut (Frischgewicht, FW) wiegen Sie ab und in einen 1,0 mL Microcentrifuge Schlauch. Hinzu kommen die Zentrifugenröhrchen und Wirbel für 30 500 µL Phosphatpuffer s.
  4. Zentrifugieren Sie Proben für 15 Minuten bei 16.000 X g. Pipettieren 100 µL Überstand in ein schwarz 96-well-Platte. Lesen Sie die Proben mit einem Fluorometer (Erregung 485 nm, Emission 528 nm).

7. total Aflatoxin-Analyse

  1. Verarbeitung und Aflatoxin Probengewinnung
    1. Trocken-Kernel Proben in einem Umluft-Ofen für 2 Tage bei 60 ° C. Wiegen Sie Proben und legen Sie in ein 50-mL-Erlenmeyerkolben mit einem Glasstopfen.
    2. Verleihen Sie in einer Dampfhaube 25 mL Methylenchlorid jedem Kolben.
      Achtung: Methylenchlorid ist sehr volatil und gilt als gefährlicher (reizend, karzinogen). Latex weder Nitril-Handschuhe sind sicher für die Arbeit mit Methylenchlorid. Verwenden Sie verbesserte organische Lösungsmittel beständig PolyVinylAlcohol Handschuhe.
    3. Schütteln Sie Proben für 30 min auf ein Handgelenk Aktion Shaker. Gießen Sie nach 30 min langsam den Extrakt durch eine geriffelte Filterpapier Kreis in einer 80-mL-Becherglas. Lassen Sie die Becher über Nacht trocknen unter einem Abzug.
    4. Am nächsten Tag Spritzen Methylenchlorid (ca. 5 mL) um die innere Felge von der trockenen Becher, wirbeln herum und gießen Sie in 2 Dram Glasfläschchen. Lassen Sie Fläschchen öffnen, um in einer Abzugshaube über Nacht trocknen.
  2. Aflatoxin-Analyse
    1. 4,0 mL 80 % Methanol hinzufügen: entionisiertem H2O (V/V), Fläschchen.
    2. Verwendung eines Aflatoxin Extraktion Kit Filtern reinigen Methanol-Lösung mit der angegebenen Spalte. Analysieren Sie total Aflatoxin Ebenen mit einem Fluorometer gemäß den Anweisungen des Herstellers.

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Ergebnisse

Mais-Transformation und molekulare Screening von transgenen Pflanzen

Unreife Embryonen Hi-II-Maislinien verwandelten sich mit Agrobacterium Tumefaciens EHA101 Stamm, enthält die letzte Pflanze Ziel Vektor mit dem Ausdruck der Lablab Purpureus AILP gen unter der Kontrolle des CaMV- 35 s Promotor. Fünf unabhängig transformierte Maislinien wurden an die T6-Generation für nachfolg...

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Diskussion

Ertragsverluste bei landwirtschaftlichen Nutzpflanzen durch Erreger und Schädlinge ist ein globales Problem-20. Derzeit, Anwendung von synthetischen Fungiziden und Pestiziden ist das vorherrschende Mittel für steuernde Anlage Krankheitserreger und Schädlinge, aber passives Toxizität von diesen Biochemikalien in Lebens- und Futtermitteln kann ernsthafte Bedrohung für die menschliche und tierische Gesundheit21darstellen. Angesichts der wirtschaftlichen Bedeutung der Mais als ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

Wir danken David Meints, University of Arkansas für seine Hilfe bei der Entwicklung und Analyse von transgenem Mais während der frühen Generationen. Diese Arbeit erhielt die finanzielle Unterstützung des USDA-ARS CRIS-Projekts 6054-42000-025-00D. Erwähnung von Handelsnamen oder kommerzielle Produkte in diesem Artikel wird ausschließlich zum Zweck der Bereitstellung von spezifischen Informationen und bedeutet keine Empfehlung oder Billigung durch das US Department of Agriculture. USDA-ARS gleicher Beschäftigung Gelegenheit (EEO) Politik Mandate Chancengleichheit für alle Personen und verbietet Diskriminierung in allen Aspekten der Agentur Personalpolitik, Methoden und Erfahrungen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AgarCaisson
Amazing Marine GoopEclectic Products
C1000 Touch CFX96 Echtzeit-SystemBio-Rad
Corning  Falcon Gewebekulturschalen, 60 mmFisher Scientific08-772F
Eppendorf  5424 MikrozentrifugeFisher Scientific
Erlenmeyerkolben mit Stopfen, 50 mLAce Glass6999-10
Ethanol
FluoroQuant AflaRomer LabsCOKFA1010
geriffelte qualitative Filterpapierkreise, 15 cmFisher Scientific09-790-14E
Force Air OvenVWR
FQ-ReaderRomer LabsEQFFM3010
Geno/Grinder 2010OPS DiagnosticsSP 2010-115
Verbesserte PolyVinylAlkohol Organic Solvent Resistant HandschuheAnsell012-15-554
Innova 44 Inkubator ShakerBrunswick Scientific
iScript cDNA Synthesis KitBio-Rad1708890
flüssiger Stickstoff
Low Form Griffin Becher, 100 mLDKW Life Sciences14000-100
Methanol
Methylenchlorid
Nexttec 1-stufiges DNA-Isolationskit für PflanzenNexttec47N
Nikon Eclipse E600 Mikroskop mit Nikon DS-Qi1 KameraNikon
Nikon SMZ25 Stereomikroskop mit C-HGFI Episcopic Illuminator und Andor Zyla 4.2 sCMOS-KameraNikon
Nunc Square BioAssay DishesThermoFisher Scientific240835
Phire Plant Direct PCR KitThermoFisher ScientificF130WH
Polycarbonat-Fläschchen, 15 mlOPS DiagnosticsPCRV 15-100-23
Kartoffel Dextrose-Bouillon-Schnappverschluss
, 22 mmDKW Life Sciences242612
Natriumphosphat zweibasisches HeptahydratSigma-Aldrich
Natriumphosphat monobasischesSigma-Aldrich
Spectrum Plant Total RNA KitSigma-AldrichSTRN50
Edelstahl-Schleifkugeln, 3/8''OPS DiagnosticsGBSS 375-1000-02
Rührplatte
Synergy 4 FluorometerBiotek
T100 ThermocyclerBio-Rad
Triton X-100Sigma-AldrichT-9284
V8 SaftCampbell's
Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Klasse 3Fisher Scientific09-820P
Schüttler am HandgelenkBurrell Scientific

Referenzen

  1. Ismaiel, A., Papenbrock, J. Mycotoxins: Producing fungi and mechanisms of phytotoxicity. Agriculture. 5 (3), 492-537 (2015).
  2. Mitchell, N., Bowers, E., Hurburgh, C., Wu, F. Potential economic losses to the USA corn industry from aflatoxin contamination. Food Additives & Contaminants: Part A. 33 (3), 540-550 (2016).
  3. Umesha, S., Manukumar, H. M., Chandrasekhar, B., Shivakumara, P., Shiva Kumar, J., Raghava, S., Avinash, P., Shirin, M., Bharathi, T. R., Rajini, S. B., Nandhini, M., Vinaya Rani, G., Shobha, M., Prakash, H. S. Aflatoxins and food pathogens: Impact of biologically active aflatoxins and their control strategies. Journal of the Science of Food and Agriculture. , (2016).
  4. Brown, R. L., Menkir, A., Chen, Z. Y., Bhatnagar, D., Yu, J., Yao, H., Cleveland, T. E. Breeding aflatoxin-resistant maize lines using recent advances in technologies - a review. Food Additives & Contaminants - Part A Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 30 (8), 1382-1391 (2013).
  5. Abbas, H., Accinelli, C., Shier, W. T. Biological control of aflatoxin contamination in U.S. crops and the use of bioplastic formulations of Aspergillus flavus biocontrol strains to optimize application strategies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65, 7081-7087 (2017).
  6. Udomkun, P., Wiredu, A. N., Nagle, M., Müller, J., Vanlauwe, B., Bandyopadhyay, R. Innovative technologies to manage aflatoxins in foods and feeds and the profitability of application – A review. Food Control. 76, 127-138 (2017).
  7. Dohroo, N. P., Bhardwaj, S. S., Shyram, K. R. Amylase and invertase activity as influenced by Pythium pleroticum causing rhizome rot of ginger. Plant Disease Research. 2, 106-107 (1987).
  8. Singh, R., Saxena, V. S., Singh, R. Pectinolytic, cellulolytic, amylase and protease production by three isolates of Fusarium solani variable in their virulence. Indian Journal of Mycology and Plant Pathology. 19, 22-29 (1989).
  9. Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Amy1, the α-amylase gene of Aspergillus flavus: Involvement in aflatoxin biosynthesis in maize kernels. Phytopathology. 89 (10), 908-914 (1999).
  10. Bluhm, B. H., Woloshuk, C. P. Amylopectin induces Fumonisin B1 production by Fusarium verticillioides during colonization of maize kernels. Molecular Plant-Microbe Interactions. 18 (12), 1333-1339 (2005).
  11. Gilbert, M. K., Majumdar, R., Rajasekaran, K., Chen, Z. Y., Wei, Q., Sickler, C. M., Lebar, M. D., Cary, J. W., Frame, B. R., Wang, K. RNA interference-based silencing of the a-amylase (amy1) gene in Aspergillus flavus decreases fungal growth and aflatoxin production in maize kernels. Planta. 247 (6), 1465-1473 (2018).
  12. Chen, Z. Y., Brown, R. L., Russin, J. S., Lax, A. R., Cleveland, T. E. A corn trypsin inhibitor with antifungal activity inhibits Aspergillus flavus α-amylase. Phytopathology. 89 (18944733), 902-907 (1999).
  13. Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Inhibition of growth of Aspergillus flavus and fungal α-amylases by a lectin-like protein from Lablab purpureus. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (8), 955-961 (2001).
  14. Mirkov, T. E., Wahlstrom, J. M., Hagiwara, K., Finardi-Filho, F., Kjemtrup, S., Chrispeels, M. J. Evolutionary relationships among proteins in the phytohemagglutinin-arcelin-a-amylase inhibitor family of the common bean and its relatives. Plant Molecular Biology. 26 (4), 1103-1113 (1994).
  15. Kim, Y. H., Woloshuk, C. P., Cho, E. H., Bae, J. M., Song, Y. S., Huh, G. H. Cloning and functional expression of the gene encoding an inhibitor against Aspergillus flavus a-amylase, a novel seed lectin from Lablab purpureus (Dolichos lablab). Plant Cell Reports. 26 (4), 395-405 (2007).
  16. Frame, B., Main, M., Schick, R., Wang, K. Ch. 22. Plant Embryo Culture. Thorpe, T. A., Yeung, E. C. 710, Humana Press. Methods in Molecular Biology 327-341 (2011).
  17. Rajasekaran, K., Sickler, C. M., Brown, R. L., Cary, J. W., Bhatnagar, D. Evaluation of resistance to aflatoxin contamination in kernels of maize genotypes using a GFP-expressing Aspergillus flavus strain. World Mycotoxin Journal. 6 (2), 151-158 (2013).
  18. Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Sickler, C. M., Majumdar, R., Jaynes, J. M., Cary, J. W. Control of Aspergillus flavus growth and aflatoxin production in transgenic maize kernels expressing a tachyplesin-derived synthetic peptide, AGM182. Plant Science. , 150-156 (2018).
  19. Shu, X., Livingston, D. P., Franks, R. G., Boston, R. S., Woloshuk, C. P., Payne, G. A. Tissue-specific gene expression in maize seeds during colonization by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides. Molecular Plant Pathology. 16 (4), 662-674 (2015).
  20. Savary, S., Ficke, A., Aubertot, J. -N., Hollier, C. Crop losses due to diseases and their implications for global food production losses and food security. Food Security. 4, 519-537 (2012).
  21. Damalas, C. A., Eleftherohorinos, I. G. Pesticide exposure, safety issues, and risk assessment indicators. International Journal of Environmental Research and Public Health. 8 (5), 1402-1419 (2011).
  22. Kowalska, A., Walkiewicz, K., Kozieł, P., Muc-Wierzgoń, M. Aflatoxins: Characterisitcs and impact on human health. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej (Online). 71, 315-327 (2017).
  23. Rajasekaran, K., Cary, J. W., Cotty, P. J., Cleveland, T. E. Development of a GFP-expressing Aspergillus flavus strain to study fungal invasion, colonization, and resistance in cottonseed. Mycopathologia. 165 (2), 89-97 (2008).
  24. Punt, P., Dingemanse, M. A., Kuyvenhoven, A., Soede, R. D., Pouwels, P. H., van den Hondel, C. A. Functional elements in the promoter region of the Aspergillus nidulans gpdA gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Gene. 93 (1), 101-109 (1990).
  25. Lee, L. W., Chiou, C. H., Klomparens, K. L., Cary, J. W., Linz, J. E. Subcellular localization of aflatoxin biosynthetic enzymes Nor-1, Ver-1, and OmtA in time-dependent fractionated colonies of Aspergillus parasiticus. Archives of Microbiology. 181 (3), 204-214 (2004).
  26. Bhatnagar, D., Cary, J. W., Ehrlich, K., Yu, J., Cleveland, T. E. Understanding the genetics of regulation of aflatoxin production and Aspergillus flavus development. Mycopathologia. 162, 155-166 (2006).
  27. Williams, W. P., Krakowsky, M. D., Scully, B. T., Brown, R. L., Menkir, A., Warburton, M. L., Windham, G. L. Identifying and developing maize germplasm with resistance to accumulation of aflatoxins. World Mycotoxin Journal. 8 (2), 193-209 (2015).
  28. Broekaert, W. F., van Parijs, J., Leyns, F., Joos, H., Peumans, W. J. A chitin-binding lectin from stinging nettle rhizomes with antifungal properties. Science. 245 (4922), 1100-1102 (1989).
  29. Vanparijs, J., Broekaert, W. F., Goldstein, I. J., Peumans, W. J. Hevein-an antifungal protein from rubber-tree (Hevea brasiliensis) latex. Planta. 183, 258-264 (1991).
  30. Gozia, O., Ciopraga, J., Bentia, T., Lungu, M., Zamfirescu, I., Tudor, R., Roseanu, A., Nitu, F. Antifungal properties of lectin and new chitinases from potato tubers. Comptes Rendus de l'Academie des Sciences - Series III. 316 (8), 788-792 (1993).
  31. Wisessing, A., Choowongkomon, K. Amylase inhibitors in plants: Structures, Functions and Applications. Functional Plant Science and Biotechnology. 6 (1), 31-41 (2012).
  32. Tyagi, B., Trivedi, N., Dubey, A. a-amylase inhibitor: A compelling plant defense mechanism against insect/pests. Environment & Ecology. 32 (3), 995-999 (2014).
  33. Powers, J. R., Culbertson, J. D. In vitro effect of bean amylase inhibitor on insect amylases. Journal of Food Protection. 45, 655-657 (1982).
  34. Gatehouse, A. M. R., Fenton, K. A., Jepson, I., Pavey, D. J. The effects of a-amylase inhibitors on insect storage pests: Inhibition of a-amylase in vitro and effects on development in vivo. Journal of the Science of Food and Agriculture. 37, 727-734 (1986).
  35. Blanco-Labra, A., Chagolla-Lopez, A., Martinez-Gallardo, N., Valdes-Rodriguez, S. Further characterization of the 12-kDa protease a-amylase inhibitor present in maize seeds. Journal of Food Biochemistry. 19, 27-41 (1995).
  36. Abdollahi, A., Buchanan, R. L. Regulation of aflatoxin biosynthesis: Induction of aflatoxin production by various carbohydrates. Journal of Food Science. 46, 633-635 (1981).
  37. Liu, J., Sun, L., Zhang, N., Zhang, J., Guo, J., Li, C., Rajput, S. A., Qi, D. Effects of nutrients in substrates of different grains on aflatoxin B1 production by Aspergillus flavus. BioMed Research International. 2016, (2016).
  38. Uppala, S. S., Bowen, K. L., Woods, F. M. Pre-harvest aflatoxin contamination and soluble sugars of peanut. Peanut Science. 40 (1), 40-51 (2013).

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Kernel-Screening-AssayGFP-exprimierender StammHemmung des PilzwachstumsAILP-ExpressionAgrobacterium-TransformationSporenzählungFluorometer-Analyse
Hemmung der Aspergillus Flavus Wachstum und Aflatoxin in transgenen Mais mit dem Ausdruck der α-Amylase-Inhibitor von Lablab Purpureus L.
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