Bösartig und B-Zellen nicht bösartig aus Lck:eGFP Zebrafisch zu isolieren

Zusammenfassung

Transgenen Lck:eGFP Zebrafisch express GFP hoch in T-Lymphozyten und wurden verwendet, um die T-Zell-Entwicklung und akute lymphoblastische Leukämie zu studieren. Diese Linie dient zur Studie B-Zellen, die Lck auf den unteren Ebenen zum Ausdruck bringen. Dieses Protokoll beschreibt Reinigung von malignen und nicht-malignen B-Zellen aus Lck:eGFP Zebrafisch.

Zusammenfassung

Zebrafisch (Danio Rerio) sind ein leistungsfähiges Modell Lymphozyten Entwicklung zu studieren. Wie bei Säugetieren besitzen D. Rerio einen adaptiven Immunsystems, die B- und T-Lymphozyten enthält. Studien der Zebrafisch Lymphopoiese sind schwierig, weil Antikörper D. Rerio Zelle Oberflächenmarker zu erkennen in der Regel nicht verfügbar sind, erschweren, Isolierung und Charakterisierung von verschiedenen Lymphozyten Bevölkerungsgruppen, einschließlich B-Linie Zellen. Transgene Linien mit Abstammung-spezifische Fluorophor Ausdruck werden häufig verwendet, um diese Herausforderung zu umgehen. Die transgenen Lck:eGFP -Linie wurde verwendet, um D. Rerio T-Zell-Entwicklung zu studieren und auch für Modell T Zelle Entwicklung und akute lymphoblastische Leukämie (T-ALL) verwendet worden. Obwohl Lck:eGFP Fisch allgemein verwendet wurden, um die T-Linie zu analysieren, wurden sie nicht zur B-Zellen zu studieren. Vor kurzem entdeckten wir, dass viele Zebrafisch B Zellen Lck, auch zum Ausdruck bringen, wenn auch auf einem niedrigeren Niveau. Infolgedessen express Lck:eGFP B-Zellen ebenfalls niedrige Konzentrationen von GFP. Ausgehend von dieser Feststellung, entwickelten wir ein Protokoll, um die Zellen der B-Linie von Lck:eGFP Zebrafisch, reinigen, das wir hier berichten. Unsere Methode beschreibt, wie Sie einen Leuchtstoff-activated Cell Sorter (FACS) B-Zellen aus Lck:eGFP Fisch oder verwandte Linien, wie Doppel-transgenen Rag2:hMYCzu reinigen zu nutzen; LCK:eGFP Fisch. In diesen Zeilen, B-Zellen, insbesondere unreife B-Zellen, ausdrückliche GFP auf niedrig aber nachweisbar Ebenen, so dass sie zu unterscheiden von T-Zellen, die GFP hoch zum Ausdruck zu bringen. B-Zellen können von Knochenmark, Thymus, Milz, Blut oder anderen Geweben isoliert werden. Dieses Protokoll bietet eine neue Methode um D. Rerio B-Zellen, Studien zu Themen wie Entwicklung von B-Zellen und B-Lymphozyten maligne Erkrankungen konzentriert zu reinigen.

Einleitung

Zebrafisch bieten leistungsfähige Attribute, z. B. genetischen Manipulierbarkeit, hohe Fruchtbarkeit, optische Transparenz und schnelle Entwicklung, die studiert vertebrate Entwicklung mit gentechnische Ansätze ermöglichen. Diese Vorteile zusammen mit der Gemeinsamkeiten der teleost und Säugetieren Hämatopoese machen D. Rerio ideal für in-vivo-Analysen von Lymphopoiese und Lymphozyten Funktion, von ihren ersten Auftritt in Larven im gesamten Erwachsenenalter. Blut-Entwicklung im Zebrafisch stützt sich auf gut erhaltenen genetische Prozesse, die mit Säugetieren geteilt werden, und diese erstrecken sich auf das adaptive Immunsystem. Darüber hinaus sind molekula....

Protokoll

Alle Verfahren im Zusammenhang mit Zebrafisch stimmten die institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) an der University of Oklahoma Health Sciences Center.

1. nicht-malignen B und T-Lymphozyten aus transgenen Lck:eGFP Fische isolieren

1. Den Fisch mit 0,02 % Tricaine (MS-222) im System Fischwasser zu betäuben.
2. 2 – 6 Monate alten Fisch für fluoreszierende Thymi an der Dorsomedial Aspekt der Kiemen Hohlraum der Zebrafisch und anderen umkonstruiert¹⁴befinden zu untersuchen. Verwenden Sie eine Epifluoreszenz-Mikroskop (470/40 Erregung Wellenlänge und 525/50 Emis....

Ergebnisse

Wir nutzten Durchflusszytometrie analysiert und FACS, GFP^lo und GFP^Hallo Zellen aus Thymus, Knochenmark Niere und Milz Lck:eGFP transgenen Zebrafisch zu isolieren. Analyse der 3-Monate-alten Fisch ergab, dass der Thymus enthalten meist GFP⁺ Lymphozyten. GFP⁺ Zellen wurden weitgehend auf die lymphatischen Tor zuvor beschrieben von Traver Et Al.¹⁷beschränkt. ^{Zwei verschiedene Populationen der GFP+ ,.......}

Diskussion

Wir entwickelt und bieten ein Protokoll zur B-Zellen aus Lck:eGFP transgenen Zebrafisch, isolieren das Hinzufügen anderer D. Rerio Modelle mit B-Linie Etiketten^3,4. Etwas überraschend ging die Identifizierung der GFP^lo B Zellen in dieser Zeile seit seiner Beschreibung im Jahr 2004 unbemerkt. In der Regel Lck gilt als T-Zell-spezifische⁶, aber neuere Studien gefunden, unerwartete Lck Ausdruck v.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
35 & Mikro; m mesh	Sefar Filtertechnologie	7050-1220-000-13
5 mL Polystyrol Rundbodenröhrchen mit Zellsiebkappe	Falcon Corning Marke	352235
50 mL konisches Röhrchen	VWR international	525-0448
AZ APO 100 Leuchtstoffmikroskop	Nikon
Cytoflex	Beckman Coulter
DS-Qi1MC camara	Nikon
Ethyl-3-aminobenzoat, methansesulfonat; MS-222	Sigma	E-10521
FACSJazz	BD Biosciences
Fetal bovine Serum	Thermo Fisher	10437028
FlowJo v10.2	FlowJo, LLC
em>lck:eGFP			Siehe Langeneu et al., 2004
NIS Elements Software	Nikon	Version 4.13
Penicilin-Streptomycin	Sigma	P4333
Stößel-Mikroröhrchen-Homogenisatoren	Elektronenmikroskopie Wissenschaften	64788-20
Plastic Transfer Pippetes
rag2:hMYC-ER			Siehe Gutierrez et al., 2011
RPMI Media 1640 1x	Life Technologies	11835-030

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