Datenerfassung und -analyse in Brainstem Evokierte Reaktion Audiometrie bei Mäusen

Ein zentraler Aspekt der Hirnphysiologie ist seine Fähigkeit, Umweltinformationen zu verarbeiten, die zu unterschiedlichen intrinsischen oder extrinsischen Ergebnissen führen, wie Lernen, Gedächtnis, emotionale Reaktionen oder motorische Reaktionen. Verschiedene experimentelle und diagnostische Ansätze können verwendet werden, um die elektrophysiologische Reaktionsfähigkeit einzelner neuronaler Zelltypen oder Cluster/Ensembles von Neuronen innerhalb einer stimulusbezogenen neuronalen Schaltung zu charakterisieren. Diese elektrophysiologischen Techniken decken verschiedene raumzeitliche Dimensionen auf der Mikro-, Meso- und Makroskala¹ab. Der Mikroskala-Pegel umfasst Spannungs- und Stromklemmenansätze in verschiedenen Patch-Clamp-Modi, z.B. mit kultivierten oder akut dissoziierten Neuronen¹. Diese In-vitro-Techniken ermöglichen die Charakterisierung einzelner Stromentitäten und deren pharmakologische Modulation^2,3. Ein wesentlicher Nachteil ist jedoch der Mangel an systemischen Informationen in Bezug auf die Integration und Verarbeitung von Mikro- und Makroschaltungsinformationen. Diese Beeinträchtigung wird teilweise durch In-vitro-Techniken der Mesoskala überwunden, wie Z. B. Multielektroden-Arrays, die gleichzeitige extrazelluläre Mehrelektrodenaufnahmen nicht nur in kultivierten Neuronen, sondern auch in akuten Hirnscheiben ermöglichen^{4, 5}. Während Mikroschaltungen in den Hirnscheiben in einem bestimmten Ausmaß (z.B. im Hippocampus) konserviert werden können, gehen in der Regel weiträumige Verbindungen^{verloren 6}. Letztlich sind die systemischen in vivo elektrophysiologischen Techniken auf der Makroskala die Methode der Wahl⁷. Diese Ansätze umfassen unter anderem Oberflächen- (epidurale) und tiefe (intracerebrale) EEG-Aufnahmen, die sowohl in Menschen- als auch in Tiermodellen 1 durchgeführt werden. EEG-Signale basieren überwiegend auf dem synchronisierten synaptischen Input auf pyramidenförmigen Neuronen in verschiedenen kortikalen Schichten, die trotz der allgemeinen Dominanz des exzitatorischen Eingangs⁸hemmend oder erregend sein können. Bei der Synchronisation werden exzitatorische postsynaptische potentialbasierte Verschiebungen in extrazellulären elektrischen Feldern summiert, um ein Signal von ausreichender Stärke zu bilden, um mit Oberflächenelektroden auf der Kopfhaut aufgezeichnet zu werden. Insbesondere erfordert eine nachweisbare Kopfhautaufnahme von einer einzelnen Elektrode die Aktivität von zehntausend pyramidenförmigen Neuronen und ein komplexes Bewaffnungsarium von technischen Geräten und Verarbeitungswerkzeugen, einschließlich eines Verstärkers, Filterverfahren (Tiefpassfilter, Hochpassfilter, Kerbfilter) und Elektroden mit spezifischen Leitereigenschaften.

Bei den meisten Versuchstierarten (z. B. Mäusen und Ratten) ist der humanbasierte EEG-Ansatz der Kopfhaut technisch nicht anwendbar, da das vom zugrunde liegenden Kortex erzeugte Signal aufgrund der begrenzten Anzahl synchronisierter pyramidaler Neuronen zu schwach ist^{9, 10,11}. Bei Nagetieren sind Oberflächenelektroden oder subdermale Elektroden daher stark mit Elektrokardiogramm enden und vorwiegend Elektromyogramm-Artefakte, die hochwertige EEG-Aufnahmen unmöglich machen^{9,11, 12}. Bei Verwendung von nicht entsäuerten, frei beweglichen Mäusen und Ratten ist es daher zwingend erforderlich, entweder aus dem Kortex über epidurale Elektroden oder aus den tiefen, intracerebralen Strukturen direkt aufzuzeichnen, um die direkte physikalische Verbindung der Sensorspitze zu gewährleisten. der Blei-/Implantationselektrode zu den signalerzeugenden neuronalen Zellclustern. Diese EEG-Ansätze können entweder in einem zurückhaltenden Systemaufbau oder unter Verwendung des nicht aufhaltenden implantierbaren EEG-Radiotelemetrieansatzes^9,10,11durchgeführt werden. Beide Techniken haben ihre Vor- und Nachteile und können ein wertvoller Ansatz in der qualitativen und quantitativen Charakterisierung der Anfallsanfälligkeit/Seizure-Aktivität, zirkadiane Rhythmizität, Schlafarchitektur, Oszillationsaktivität und Synchronisation sein, einschließlich Zeit-Frequenz-Analyse, Quellenanalyse, etc.^{9,10,13,14,15,16,17}.

Während gebundene Systeme und Funktelemetrie EEG-Aufnahmen unter restriktiven bzw. nicht zurückhaltenden Bedingungen ermöglichen, entsprechen die damit verbundenen Versuchsbedingungen nicht den Anforderungen für ABR-Aufnahmen. Letztere forderung nach definierten akustischen Reizen, die sich im Laufe der Zeit mit definierten Positionen eines Lautsprechers und Versuchstieren und kontrollierten Schalldruckpegeln (SPLs) wiederholen. Dies kann entweder durch Kopffixierung unter restriktiven Bedingungen oder nach Anästhesie^18,19erreicht werden. Um den experimentellen Stress zu reduzieren, werden die Tiere normalerweise während ABR-Experimenten anästhesiert, aber es sollte berücksichtigt werden, dass Anästhesie abRs^19,20stören kann.

Als allgemeines Merkmal besteht das EEG aus unterschiedlichen Frequenzen in einem Spannungsbereich von 50-100 V. Hintergrundfrequenzen und Amplituden hängen stark vom physiologischen Zustand des Versuchstiers ab. Im Wachzustand überwiegen die Beta- und Gamma-Frequenzen mit geringerer Amplitude. Wenn Tiere schläfrig werden oder einschlafen, entstehen Alpha-Frequenzen, Theta (-) und Delta-Frequenzen, die eine erhöhte EEG-Amplitude²¹aufweisen. Sobald ein Sensorkanal (z.B. der akustische Weg) stimuliert wird, wird die Informationsausbreitung über die neuronale Aktivität durch das periphere und zentrale Nervensystem vermittelt. Eine solche sensorische (z.B. akustische) Stimulation löst sogenannte EPs oder evozierte Reaktionen aus. Insbesondere sind ereignisbezogene Potenziale (ERP) in der Amplitude viel geringer als das EEG (d. h. nur ein paar Mikrovolt). Somit würde jedes einzelne ERP, das auf einem einzelnen Stimulus basiert, vor dem eEG-Hintergrund mit höherer Amplitude verloren gehen. Daher erfordert eine Aufzeichnung eines ERP die wiederholte Anwendung identischer Reize (z. B. Klicks in ABR-Aufnahmen) und eine nachfolgende Mittelung, um jegliche EEG-Hintergrundaktivität und Artefakte zu eliminieren. Wenn ABR-Aufnahmen bei anästhesierten Tieren gemacht werden, ist es einfach, hier subdermale Elektroden zu verwenden.

Hauptsächlich umfassen AEPs Kurzlatenz-EPs, die normalerweise mit ABRs oder BERA zusammenhängen, und weitere, später eingesetzte Potenziale wie Midlatenz-EPs (Midlatenz-Antworten [MLR]) und EPs mit langer Latenz²². Wichtig ist, dass Störungen in der Informationsverarbeitung der auditiven Informationen oft ein zentrales Merkmal neuropsychiatrischer Erkrankungen (demyelinisierende Krankheiten, Schizophrenie usw.) und im Zusammenhang mit AEP-Änderungen^23,24 sind. ^,25. Während Verhaltensuntersuchungen nur funktionelle Beeinträchtigungen aufdecken können, ermöglichen AEP-Studien eine präzise raumzeitliche Analyse der auditiven Dysfunktion im Zusammenhang mit spezifischen neuroanatomischen Strukturen²⁶.

ABRs als frühe, kurzlatenzakustische EPs werden normalerweise bei mäßiger bis hochintensiver Klickanwendung erkannt, und es kann bis zu sieben ABR-Peaks (W_I-W_VII)auftreten. Die wichtigsten Wellen (W_I-W_V) beziehen sich auf die folgenden neuroanatomischen Strukturen: W_I mit dem Hörnerv (distaler Teil, im Innenohr); W_II an den Cochlea-Kern (proximaler Teil des Gehörnervs, Hirnstammbeendigung); W_III zum überlegenen Olivary-Komplex (SOC); W_IV zum lateralen Lemniscus (LL); W_V zur Beendigung des lateralen Lemniskus (LL) innerhalb des minderwertigen Colliculus (IC) auf der kontralateralen Seite²⁷ (Ergänzende Abbildung 1). Es sei darauf hingewiesen, dass W_II-W_V wahrscheinlich mehr als eine anatomische Struktur des aufsteigenden Gehörpfades haben, die zu ihnen beiträgt. Insbesondere die genaue Korrelation der Spitzen und der zugrunde liegenden Strukturen des Hörtraktes ist noch nicht vollständig geklärt.

In der Audiologie können ABRs als Screening- und Diagnosewerkzeug sowie zur chirurgischen Überwachung^28,29eingesetzt werden. Es ist am wichtigsten für die Identifizierung von Dysakus, Hypakus und Anakusis (z. B. bei altersbedingtem Hörverlust, lärmbedingtem Hörverlust, metabolischem und angeborenem Hörverlust sowie asymmetrischem Hörverlust und Hördefiziten aufgrund von Fehlbildungen, Verletzungen und Neoplasmen)²⁸. ABRs sind auch als Screening-Test für hyperaktive, geistig behinderte Kinder oder für andere Kinder relevant, die nicht in der Lage wären, auf konventionelle Audiometrie zu reagieren (z. B. bei neurologischen/psychiatrischen Erkrankungen wie ADHS, MS, Autismus usw.^{29 , 30}) und in der Entwicklung und chirurgischen Montage von Cochlea-Implantaten²⁸. Schließlich können ABRs wertvolle Einblicke in die möglichen ototoxischen Nebenwirkungen von Neuropsychopharmaka, wie Antiepileptika^31,32, geben.

Der Wert der Übersetzung neurophysiologischer Kenntnisse aus pharmakologischen oder transgenen Mausmodellen auf den Menschen wurde in zahlreichen Situationen nachgewiesen, insbesondere auf der Ebene der ERPs bei auditiven Paradigmen bei Mäusen und Ratten^{33, 34,35}. Neue Einblicke in veränderte frühe AEPs und damit verbundene Veränderungen in der auditiven Informationsverarbeitung bei Mäusen und Ratten können so auf den Menschen übertragen werden und sind von zentraler Bedeutung bei der Charakterisierung und Endophenotypisierung von Audit, neurologischen und neuropsychiatrischen Erkrankungen in der Zukunft. Hier finden Sie eine detaillierte Beschreibung, wie ABRs erfolgreich bei Mäusen für grundlegende wissenschaftliche, toxikologische und pharmakologische Zwecke aufgezeichnet und analysiert werden können.

Alle Tierverfahren wurden nach den Richtlinien des Deutschen Tierschutzrates durchgeführt und alle Protokolle wurden vom Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz genehmigt. Amt Nordrhein-Westfalen, Ministerium für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV NRW). Die Autoren bescheinigen ferner, dass alle Tierversuche in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publications No. 80-23) revidiert 1996 oder dem UK Animals (Scientific Procedures) Act durchgeführt wurden. 1986 und die dazugehörigen Leitlinien oder die Richtlinie des Rates der Europäischen Gemeinschaften vom 24. November 1986 (86/609/EWG) und vom 22. September 2010 (2010/63/EU). Es wurden besondere Anstrengungen unternommen, um die Anzahl der verwendeten Tiere und ihr Leiden zu minimieren (3R[Ersatz-, Reduktions- und Verfeinerungsstrategie).

1. Versuchstiere

1. Auswahl von Versuchstieren und Arten
   1. Führen Sie ABR-Studien an Nagetieren/Nagetieren-Modellen (z. B. Mäuse naden Mäusen oder Ratten) durch, die die Anforderungen der Homologie, Isomorphismus und Vorhersehbarkeit im Zusammenhang mit einer bestimmten menschlichen Krankheit erfüllen. Dies ist von besonderer Bedeutung für grundlegende Aspekte in der translationalen Neurowissenschaft.
      HINWEIS: Beachten Sie, dass verfügbare verschiedene Maus- und Rattenstämme Unterschiede in den grundlegenden physiologischen und pathophysiologischen Eigenschaften aufweisen können^36,37,38. Diese maus-rattenlinienbezogenen Besonderheiten müssen bei der experimentellen Planung berücksichtigt werden.
   2. Betrachten Sie maus- und ratten-dehnungsspezifische Veränderungen in der Physiologie und Pharmakologie, die auswirkungen auf elektrophysiologische Experimente haben könnten (z. B. veränderte anästhetische Empfindlichkeiten, zirkadiane Rhythmik, [audiogene] Anfallsanfälligkeit, Alter, und genetischen Hintergrund)^39,40,41,42.
   3. Beziehen Sie die geschlechtsspezifische Schichtung in das Studiendesign ein. Denken Sie daran, dass der estre Zyklus die Anästhesieanfälligkeit, die zentrale Rhythmik, die zirkadiane Abhängigkeit und die Anfallsaktivität (auditive Anfälle) und die sensorische (auditive) Informationsverarbeitung stark beeinträchtigen kann^{43,44 , 45}. Führen Sie daher eine geschlechtsspezifische Analyse durch.
      HINWEIS: Beschränken Sie sich auf männliche Mäuse, wenn die finanzielle und experimentelle Kapazität begrenzt ist, obwohl verschiedene neurophysiologische Parameter von normalerweise radfahrenden Weibchen scheinen nicht erhöhte Variabilität im Vergleich zu Männern⁴⁶aufweisen.
2. Tierhaltung und -handhabung
   1. Hausmäuse oder Ratten in individuell belüfteten Käfigen in einer Tieranlage.
   2. Bewegen Sie die Versuchstiere aus der Tieranlage in belüftete Schränke, die sich in speziellen Laborräumen für Anästhesie, ABR-Elektrodenplatzierung und ABR-Aufnahmen befinden.
   3. Stellen Sie sicher, dass die Tiere in einem belüfteten Schrank unter standardökologischen Bedingungen untergebracht sind (d. h. bei einer Temperatur von 21 °C, einer relativen Luftfeuchtigkeit von 50 %-60 % und einem herkömmlichen 12/12 h-Licht-/Dunkelzyklus). Erlauben Sie den Tieren, sich zu akklimatisieren und sich an dieses zirkadiane Muster für mindestens 14 Tage vor den nachfolgenden Experimenten anzupassen.
   4. Verwenden Sie klare Polycarbonatkäfige Typ II (26,7 cm x 20,7 cm x 14,0 cm, eine Fläche von 410 cm²) für das Gehäuse von Mäusen in Gruppen von 3-4 und verwenden Sie klare Polycarbonatkäfige Typ III (42,5 cm x 26,6 cm x 18,5 cm, eine Fläche von 800 cm²) für Ratten. Bieten Sie ad libitum Zugang zu Trinkwasser und Standard-Lebensmittelpellets.
   5. Vermeiden Sie die Trennung/Isolierung der Versuchstiere vor und nach ABR-Aufnahmen, da die Isolierung starke Belastungen ausüben kann, die die experimentellen Ergebnisse beeinflussen. Legen Sie die Tiere nach Anästhesie, ABR-Elektrodenplatzierung und ABR-Aufnahmen wieder in ihren Heimischen Käfig.
   6. Wenden Sie keine offenen Wohnbedingungen an, da sie einer Vielzahl experimenteller Nachteile unterliegen, insbesondere in Auditstudien. Belüftete Schränke schützen stattdessen vor akustischer Belastung vor und zwischen experimentellen Auditverfahren, die sonst zu sensorineuralem Hörverlust (z. B. lärminduzierter Hörverlust) führen und somit die Ergebnisse beeinflussen könnten.
   7. Nutzen Sie maus- und rattenspezifische sanitäre, anästhetische und technische Ausrüstung, so dass weder Mäuse noch Ratten die Anwesenheit von einander als gegenseitige Sinneswahrnehmung konkurrierender Arten wahrnehmen können, was zu vermeidbaren Störfaktoren in den Studien führen kann.

2. Mausanästhesie

1. Führen Sie eine Anästhesie mit injizierbaren Anästhetika durch. Bereiten Sie eine Kombination aus Ketaminhydrochlorid (Nagetierdosierung: 100 mg/kg) und Xylazinhydrochlorid (Nagetierdosierung: 10 mg/kg) in 0,9% NaCl- oder Ringer-Lösung vor und injizieren Sie das Tier intraperitoneal auf der Grundlage seines Körpergewichts.
   HINWEIS: Inhalation Narkose über Isoflurane wird nicht empfohlen, da das ABR-Verfahren normalerweise eine Schalldämpfungskabine und einen Faraday-Käfig erfordert, was zu räumlichen Einschränkungen innerhalb des Aufnahmeaufbaus führt. Obwohl viele Anästhetika auf das NMDA-System wirken und offensichtlich die Ergebnisse der ABR-Aufzeichnung beeinflussen, wird ein nicht-anästhetischer Halteansatz in ABR-Aufnahmen nicht empfohlen, da die Unterhaltemaßnahmen unter Bewusstsein dramatische Belastungen für das Tier mit schwere anschließende Artefaktbildung in ABRs.
2. Beobachten Sie die Tiere sorgfältig auf die Tiefe der Anästhesie, indem Sie eine Schwanzprise, Fußkneife und Überwachung der Atmungsrate (Mäuse: 150-220 Atemzüge/min). Prüfen Sie, ob es möglich ist, zu vergasen und ggf. gegenzusteuern.
   HINWEIS: Verschiedene Mauslinien oder pharmakologische Mausmodelle können unterschiedliche Empfindlichkeiten gegenüber Anästhesie aufweisen. Dasselbe gilt für mutierte Mausmodelle. Endotracheale Intubation ist in dieser experimentellen Umgebung kein Muss und wird nicht empfohlen. Da die Intubation das Traumarisiko für die Luftröhre und Infektion erhöht, ist der Nutzen/Risiko einer endotrachealen Intubation während des ABR-Verfahrens negativ.

3. Allgemeine Aspekte der perianesthetischen Anordnungen und Instrumentierung

1. Tragen Sie zusätzliche Wärme während und nach ABR-Aufnahmen mit einer hausothermen Heizdecke auf, um die Körperkerntemperatur des Tieres aufrechtzuerhalten. Bewahren Sie Letzteres bei 36,5-38,0 °C (98,6-100,4 °F) auf.
   ANMERKUNG: Hypothermie ist ein Risikofaktor bei kleinen Nagetieren aufgrund ihres hohen Verhältnisses an Körperoberfläche (Mauskörperoberfläche = 10,5 x (Gewicht in g)^2/3; Rattenkörperoberfläche = 10,5 x (Gewicht in g)^2/3) zum Volumen.
2. Bedecken Sie die Augen des Tieres mit künstlicher Tränensalbe auf Erdölbasis oder 5% Dexpanthenol während des gesamten ABR-Aufnahmeprozesses, um Hornhautaustrocknung zu vermeiden. Fahren Sie mit diesem Vorgang fort, bis der blinkende Reflex vollständig wiederhergestellt ist.
3. Sterilisieren Sie die experimentellen Instrumente (siehe Materialtabelle) mit einem Autoklaven oder Desinfektionsmitteln.
   HINWEIS: Die Verwendung eines wärmebasierten chirurgischen Instrumentensterilisators mit Glasperlen wird empfohlen.
4. Für eine exakte PLATZIERUNG der ABR-Elektroden verwenden Sie ein binokulares chirurgisches Vergrößerungsmikroskop mit einer Kaltlichtquelle für die intensive Beleuchtung über flexible oder selbsttragende bewegliche Lichtleiter.
5. Verwenden Sie einen sauberen Labormantel, eine Gesichtsmaske, eine Kopfabdeckung und sterile Handschuhe während der experimentellen Tierhandhabung und -experimente.
   HINWEIS: Optimale Instrumente und Zubehör können zwischen den Laboren variieren und müssen laborspezifischen und institutionellen Standards entsprechen.

4. ABR-Aufnahmen

HINWEIS: Das hier beschriebene Protokoll basiert auf einem handelsüblichen ABR-System für monaurale und binaurale Aufnahmen. Wichtig ist, dass die zu behandelnde wissenschaftliche Frage den technischen Spezifikationen des verwendeten ABR-Systems entsprechen muss. AbR-Analysen von binauralen Aufzeichnungen können beispielsweise verwendet werden, um die laterale Kodierung von Hörreizen im Hörweg zu untersuchen und die periphere laterale Asymmetrie bei neuropsychiatrischen Erkrankungen zu untersuchen.

1. Führen Sie eine Kalibrierung der Stimulationsfrequenzen an jedem Tag der Aufnahme durch, indem Sie ein Mikrofon, das an einen Vorverstärker und das Verarbeitungssystem angeschlossen ist (siehe Materialtabelle),in der Schalldämpfungskabine an der Stelle mit der richtigen Orientierung, wo das experimentelle murine Ohr positioniert wird.
   1. Schalten Sie den an das Mikrofon angeschlossenen Vorverstärker mindestens 5 min vor der Kalibrierung ein, um den Ausgleich des Systems zu ermöglichen.
   2. Schalten Sie das Oszilloskop ein.
   3. Positionieren Sie das Mikrofon, das an einen Vorverstärker innerhalb der Schalldämpfungskabine angeschlossen ist, um das experimentelle murine Ohr nachzuahmen.
   4. Öffnen Sie die handelsübliche Verarbeitungs- und Erfassungssoftware (siehe Tabelle der Materialien).
   5. Wählen Sie die Kalibrierung Cal200K Datei innerhalb der Software, um die Kalibrierung-Konfigurations-Modus zu aktivieren und wählen Sie Parameter nach den experimentellen Bedingungen.
   6. Verwenden Sie das Prozessorsystem, um den Kalibrierungsvorgang auszuführen. Stellen Sie sicher, dass die technischen Spezifikationen des Mikrofons und Lautsprechers in Bezug auf SPL-Grenzwerte, Frequenzbereich und Verteilung harmonisieren.
   7. Wählen Sie das vordefinierte Klickstimulationsprotokoll aus, und starten Sie es.
   8. Führen Sie eine Single-Click-SPL (vorzugsweise die maximale SPL) aus, um zu überprüfen, ob das Spektrum der Klangreize, wie es von der Online-Fast Fourier Transformation (FFT) des Oszilloskops analysiert wird, den Anforderungen (wesentlicher Energiebereich) entspricht.
   9. Wählen und starten Sie das vordefinierte Ton-Burst-Stimulationsprotokoll im Interessenbereich (z.B. 1-42 kHz).
   10. Bestätigen Sie das Frequenzspektrum der aufgezeichneten akustischen Testreize mit einem Oszilloskop und Online-FFT.
       HINWEIS: Eine tägliche Kalibrierung des Systems und stimulationsfrequenzen ist erforderlich, um sicherzustellen, dass die Stimulationsfrequenzen und SPLs innerhalb akzeptabler Arbeitsbereiche liegen.
2. Legen Sie die anästhesierte Maus in eine schalldämpfende Kabine, die mit Akustikschaum ausgekleidet ist.
   HINWEIS: Die gesamte Kabine sollte von einem Faraday-Käfig (maßgeschneidertes Mesh-Metall oder ein kommerzielles) abgedeckt werden, um die ABR-Aufnahmen vor äußeren elektrischen Störungen zu schützen und sie vor Lärm zu schützen.
3. Zur Erfassung von monauralen Hirnstamm-evozierten Hörpotentialen legen Sie subdermale Edelstahlelektroden am Scheitelpunkt, axial der Pinnae (positive [+] Elektrode) und ventrolateral der rechten oder linken Pinna (negative [-] Elektrode) je nach zu messendes Ohr. Legen Sie bei binauralen Aufnahmen die negativen Elektroden sowohl an der rechten als auch an der linken Pinnae. Positionieren Sie die Bodenelektrode an der Hüfte des Tieres (Zusatzabbildung 1).
   1. Vor dem Einsetzen eine Hakenform an der Spitze der Edelstahlelektrode bilden, so dass eine subdermale Fixierung der Elektroden garantiert ist⁴⁷.
4. Führen Sie Vor jeder Aufnahme Impedanzmessungen aller Elektroden durch, um die richtige Elektrodenpositionierung/-leitfähigkeit zu überprüfen. Verwenden Sie die Impedanz-Check-Taste auf der Vierkanal-Kopfbühne, um jeden Elektrodenimpedanzpegel zu überprüfen.
   HINWEIS: Die Impedanz sollte kleiner als 5 k" sein.
5. Zeichnen Sie ABRs unter Freifeldbedingungen mit einem einzigen Lautsprecher auf (Frequenzbandbreite, z. B. bei 1-65 kHz), die 10 cm gegenüber der Tribüne der Tiere platziert werden (die Vorderkante des Lautsprechers senkrecht zur Interauralachse der Maus). Stellen Sie sicher, dass die Position des Mauskopfes/der Mausohren die des Kalibriermikrofons ist, abhängig von dem gewählten spezifischen Abstand zwischen Lautsprecher und Mikrofon während der Kalibrierung.
   HINWEIS: Anstelle von Freifeldbedingungen können auch Ohrschläuche verwendet werden. Es sind jedoch besondere Vorsichtsmaßnahmen und Tests erforderlich, um SPLs in diesen Einstellungen zu bestimmen.
6. Programmieren Sie die Stimulusprotokolle für die Klicks und Tonbursts mit selbstprogrammierter oder kommerziell erhältlicher Software (siehe Tabelle der Materialien). Die unten aufgeführten einzelnen Stimulusparameter müssen der zugehörigen grafischen Benutzeroberfläche hinzugefügt werden.
   1. Beginnen Sie mit der Konfiguration des Klickreiz-Elements (d. h. eines 100-s-Dauerreizes mit abwechselnder Polarität [Wechsel zwischen Kondensation und Seltenheit] und der definierten wesentlichen Energie. Verwenden Sie diese Stimulusentität, um später Klickschwellen, ABR-Symmetrie des linken und rechten Ohrs, ABR W(I - IV)-Amplituden und W(I - IV) Latenzen zu analysieren und zu bestimmen.
   2. Initiieren Sie die Software, und verwenden Sie das Konfigurationsfenster, um die Klick-Stimulusparameter hinzuzufügen. Klicken Sie auf Ausführen, um das Protokoll auszuführen.
   3. Fahren Sie mit der Konfiguration der zweiten Stimuluseinheit fort, die ein 4,5 ms Tonburst (transienter sinusförmiger Puls) der abwechselnden Polarität mit Hann-Hüllkurvenanstieg und Fallzeiten von jeweils 1,5 ms (Tor-/Rampenzeitdauer) ist. Betrachten Sie eine minimale Tonburstdauer von 3 ms, insbesondere für niederfrequente Tonausbrüche. Verwenden Sie diesen Stimulus, um frequenzspezifische Hörschwellen in allen Genotypen zu analysieren und zu identifizieren.
   4. Verwenden Sie ähnlich wie in Schritt 4.6.2 das Konfigurationsfenster, um Ton-Burst-Stimulusparameter hinzuzufügen, und klicken Sie auf Ausführen, um das Protokoll auszuführen (wie vom Hersteller⁴⁸angegeben).
   5. Für Ton-Burst-Studien programmieren Sie den geeigneten Frequenzbereich, der je nach wissenschaftlicher Frage getestet werden soll (z.B. von 1-42 kHz in 6 kHz Schritten). Stellen Sie sicher, dass die anzuwendenden Frequenzbereiche den technischen Möglichkeiten des Lautsprechers entsprechen (in diesem Fall ein Mehrfeldmagnetlautsprecher mit einer Frequenzbandbreite von 1-65 kHz für Frei- oder Geschlossenfeldbedingungen).
   6. Für die Mittelung, stellen Sie die Anzahl der sequentiellen akustischen Reize (Klicks oder Ton Bursts), zum Beispiel, 300x mit einer Rate von 20 Hz.
   7. Erhöhen Sie die SPLs in 5 dB-Schritten für Klicks und 10 dB-Schritte für Tonbursts, beginnend mit 0 dB bis 90 dB (Erhöhung des SPL-Modus).
      HINWEIS: Sowohl steigende als auch abnehmende SPL-Modi wurden in der Literatur beschrieben. Die SPL-Schrittgröße kann aufgrund wissenschaftlicher Fragen angepasst werden.
7. Bestimmen Einer ABR-Datenerfassungsdauer von 25 ms, beginnend mit einem Basiszeitraum von 5 ms vor dem individuellen Beginn des akustischen Stimulus (Vor-ABR-Baseline) und Überschreitung eines ABR-Abschnitts von 10 ms um weitere 10 ms (Post-ABR-Baseline) (zusätzlicheAbbildung 1 ).
8. Wenden Sie eine entsprechende Abtastrate für ABR-Datenerfassung (z.B. 24,4 kHz) und Bandpassfilter (Hochpass: 300 Hz, Tiefpass: 5 kHz) mit einem 6-poligen Butterworth-Filter an. Aktivieren Sie ggf. den Kerbfilter.
   HINWEIS: Die Abtastrate und die Filtereigenschaften können aufgrund experimenteller Anforderungen angepasst werden.
9. Übertragen Sie die resultierenden bioelektrischen Signale, die von den subdermalen Elektroden aufgezeichnet werden, auf eine Kopfstufe und weiter vorwärts zu einem Vorverstärker mit entsprechender Verstärkung (z.B. 20-fach).
10. Verwenden Sie eine spezielle ABR-Systemverarbeitungssoftware, um Lautsprechersteuerung und ABR-Erfassung, -Verarbeitung, Mittelung und Datenmanagement zu koordinieren.
11. Versuchen Sie, die gesamten ABR-Protokolle (für klick- und ton-burst-evozierte Hörschwellen, Spitzenamplitude und Spitzenlatenzanalyse usw.) innerhalb von ca. 45 min auszuführen. Dies entspricht der Zeit der tiefen Narkose mit 100/10 mg Ketamin/Xylazin intraperitoneal.
12. Stellen Sie sicher, dass die Kalibrierung, Programmierung/Einstellungen für die Stimulusdarstellung und -erfassung, Filtereinstellungen usw. vor der Anästhesisierung des Tieres und der Durchführung der eigentlichen Aufzeichnung wie erwartet funktionieren.

5. ABR-Analyse

1. Klick- und Ton-Burst-evozierte ABR-Hörschwellenanalyse
   1. Führen Sie eine automatisierte Schwellenwerterkennung basierend auf früheren Veröffentlichungen durch, um mögliche Inkonsistenzen bei der ABR-Schwellenwertermittlung durch visuelle Inspektion/Schätzung^49,50,51,52zu vermeiden.
   2. Definieren Sie drei verschiedene Zeitfenster (TWs), um das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) zu berechnen: TW₁ (0-5 ms), TW₂ (5-15 ms) und TW₃ (15-25 ms) (Zusatzabbildung 1).
   3. Berechnen Sie die Lärmstandardabweichung der Basislinie innerhalb der beiden unterschiedlichen TWs (d. h. TW₁ und TW₃), bei denen keine AEPs beobachtet werden. Diese Berechnung kann mit selbstprogrammierter Software durchgeführt werden.
   4. Berechnen Sie für jede SPL-Messung innerhalb eines ABR-Datensatzes, der sowohl den Mittelwert als auch die Standardabweichung für die gepoolten Daten von TW₁ und TW₃festlegt.
   5. Setzen Sie alle Aufnahmeproben einzeln um den entsprechenden berechneten Mittelwert zurück, um einen DC-Offset zu entfernen.
   6. Identifizieren Sie für die Bestimmung des Hörschwellenwerts die niedrigste SPL (dB), bei der mindestens ein Wellenamplitudenwert (W_I-W_IV) im ABR-Antwortzeitfenster (TW₂) das Vierfache der zuvor berechneten Standardabweichung überstieg.
      HINWEIS: Wenn keine ABR-Welle für die Klick- und Frequenzschwellenanalyse bei der maximalen SPL erkannt wurde, wird dem Ohr ein nominaler Schwellenwert von 100 dB zugewiesen.
2. ABR-Wellenamplitude- und Wellenlatenzanalyse
   1. Führen Sie einen Wavelet-basierten Ansatz mit dem mexikanischen Hut-Wavelet durch, um die zeitlich-sequentielle Anordnung von positiven (p) Wellen (Spitzen) sowie der negativen (n) Wellen (Gruben) mit einem Standard-Wavelet durch die kontinuierliche Wavelet-Transformation (CWT) zu bestimmen Musterabgleichsalgorithmus⁵² (Ergänzende Abbildung 1).
      1. Mathematisch wird das CWT wie folgt dargestellt⁵³.
         
         Hier ist s(t) das Signal, a ist die Skala, b ist die Übersetzung, (t) ist das Mutter-Wavelet, a, _b(t) ist das skalierte und übersetzte Wavelet, und C ist die 2D-Matrix von Wellenkoeffizienten.
   2. Verwenden Sie zunächst die 55-dB-Messung jedes ABR-Laufs, um die besten Skalierungsparameter für jede Welle zu identifizieren, die an das CWT übergeben werden soll, was zu drei Klassen führt: Skalen 0,5-4 für alle n-Wellen, 0,5-6 für alle p-Wellen und 0,5-12 für W_IV, da dies die breiteste Welle innerhalb der Proben.
      HINWEIS: Die 55 dB SPL wurde gewählt, da Wellen hier in der Regel am prominentesten sind und zuverlässig erkannt werden können.
   3. Beweisen Sie allen Klassen, um die korrekte zeitliche Kollokation von W_I-W_IV in allen 55 dB-Messungen zuverlässig zu erkennen.
   4. Um ABR W_I-W_IV in der genauen zeitlichen Reihenfolge innerhalb der 55 dB-Messung zu bestimmen, werden p-Peaks und n-Peaks (Gruben) in einer festen Reihenfolge unter Verwendung relativer Positionen zuvor identifizierter Spitzen identifiziert, um das Zeitfenster von nachfolgende Scans.
   5. Sobald alle neun Peaks bei 55 dB identifiziert sind, verwenden Sie verwandte Werte als Ausgangspunkte für den zeitlichen Suchrahmen für die angrenzenden Schalldruckmessungen (50 dB und 60 dB), bevor die Identifizierung der Peaks 1-9 wiederholt wird.
   6. Auf diese Weise bestimmen Sie nach Möglichkeit p- und n-Peaks aller dB-Werte (55-0 dB und 60-90 dB). Sobald ein p- und n-Peak nicht mehr durch die Wavelet-Analyse identifiziert wird, wird seine zeitliche Anordnung durch Berechnung des zeitlichen Offsets des Peaks zu einem anderen Peak, der im vorherigen dB-Pegel identifiziert wurde, festgelegt.
   7. Die Anwendung des zeitlichen Offsets auf Spitzen wertet jeder andere p- und n-Peak innerhalb des aktuellen Dezibelpegels zu maximal acht ermittelten temporalen Positionen für die undefinierten Spitzen, wobei der Mittelwert als nächste Annäherung angenommen wird.
   8. Um die Amplitudenwachstumsfunktion und den Latenzvergleich aller Wellen (W_I-W_IV) zu bewerten, charakterisieren Sie die maximalen Amplituden und mittleren Latezen jedes der p-Peaks innerhalb des Zeitrahmens der zugehörigen n-Peaks.
   9. Alle Ergebnisse anschließend auf Basis des selbstprogrammierten automatischen Wavelet-Tools visuell überprüfen und bei Bedarf einzelne ABR-Läufe aus der Statistik ausschließen, wenn sie die strengen Inklusions-/Qualitätskriterien nicht erfüllen.
      HINWEIS: Sowohl bei der automatisierten Analyse als auch bei der visuellen Inspektion von ABRs wird ein doppelblinder Ansatz empfohlen.

6. Postoperative Pflege und Post-ABR-Behandlung

1. Überwachen Sie die Tiere kontinuierlich, bis sie das Bewusstsein wiedererlangt haben und in der Lage sind, die Brustbeschisse aufrechtzuerhalten.
2. Geben Sie ein Tier, das ABR-Aufnahmen unterzogen wurde, erst an die Gesellschaft anderer Tiere zurück, wenn es vollständig genesen ist.
3. Injizieren Sie Carprofen (Maus: 1x 5-10 mg/kg, subkutan; Ratte: 1x 2,5-5,0 mg/kg, subkutan) zur postoperativen Schmerzbehandlung.
   HINWEIS: Eine langanhaltende Schmerzbehandlung ist nicht erforderlich, da ABR-Aufnahmeelektroden subkutan eingesetzt werden.
4. Postoperativ feuchte Pellets füttern, um die Nahrungsaufnahme zu erleichtern. Sorgfältige Beobachtung des Verzehrs von Lebensmitteln (ca. 15 g/100 g Körpergewicht/Tag; 5 g/24 h) und Wasser (ca. 15 ml/100 g Körpergewicht/Tag; ca. 5 ml/24 h).
5. Überwachen Sie die Tiere genau auf die Rückkehr ihrer normalen Haltungen und Verhaltensweisen.
   HINWEIS: Die systemische Verabreichung von Antibiotika wie Enrofloxacin oder Trimethoprim-Sulfonamid wird hier nicht empfohlen, da die subdermale Elektrodenplatzierung nur minimaler Invasivität entspricht. Die Anwendung von Antibiotika sollte eingeschränkt werden, es sei denn, es treten Anzeichen einer lokalen oder generalisierten Entzündung auf.
6. Follow-up postexperimentelle Erholung nach ABR-Aufnahmen durch Kontrolle des Körpergewichts des Tieres.

Klick- und Ton-Burst-evozierte ABR-Aufnahmen können verwendet werden, um Hörschwellenunterschiede, Amplitudenwachstumsfunktion und Latenzvergleich zu bewerten. Klick-evozierte ABRs im SPL-Erhöhungsmodus sind in Abbildung 1 für Steuerungen und zwei beispielhaft emutierte Mauslinien dargestellt, die für den Cav3.2 T-Typ spannungsgebundenen Ca2+ Kanal (d.h. Cav3.2+/- und Ca) mangelhaft sind. v3.2 Nullmutanten [Cav3.2-/-]). Wie oben beschrieben, wird eine geschlechtsspezifische Untersuchung im Allgemeinen empfohlen, aufgrund geschlechtsspezifischer Unterschiede in den Hörparametern beim Menschen54,55 und Mäuse56,57. ABRs zum Freifeldklick (0,1 ms) und Tonburst (1–42 kHz in 6 kHz Schritten, 4,5 ms insgesamt mit einer Rampenzeit von 1,5 ms) akustische Reize wurden wie im Protokoll beschrieben aufgezeichnet. Beachten Sie, dass die Scheitelpunkt-positiven Potentiale als Aufwärtsverformungen dargestellt werden, wie in repräsentativen klickbeheb Aufnahmen für weibliche Cav3.2+/+ (Abbildung 1A), Cav3.2+/- dargestellt (Abbildung 1B ) und Cav3.2-/- Mäuse (Abbildung 1C). In dieser Einstellung schlugen repräsentative ABRs bei Frauen eine erhöhte klickevokte ABR-Hörschwelle und eine veränderte Amplitudenwachstumsfunktion bei weiblichen Cav3.2-/- Mäusen im Vergleich zu Cav3.2+/+ und Cav 3.2+/- Tiere. Die gleiche Tendenz wurde bei Männern beobachtet, die eine erhöhte Klick-evozierte ABR-Schwellenwerte und reduzierte Amplituden in Cav2.3-/- im Vergleich zu Kontrollen und heterozygoten Cav3.2+/- Mäusen nahelegten. Beispielhafte tongeplatzte ABRs sind in Abbildung 2 für weibliche Cav3.2+/+, Cav3.2+/-und Cav3.3-/- Mäuse dargestellt (alle Tiere waren 20 Wochen alt).

In einem ersten Schritt bei der Analyse der allgemeinen Hörleistung wurden klickbezicht tevokedierte ABRs für verschiedene SPLs (0–90 dB) mit dem automatisierten ABR-Schwellenwerterkennungssystem untersucht, das in Abschnitt 5 des Protokolls beschrieben ist (Abbildung 3). Die analysierten Tiere wurden altersgerecht, da das Altern einen dramatischen Einfluss auf den sensorineuralen Hörverlust58,59haben kann. Als nächstes wurden mögliche Änderungen der ABR-Schwellenwerte analysiert, die durch unterschiedliche Ton-Burst-Frequenzen (1–42 kHz, Abbildung4) hervorgerufen werden. In den beispielhaften Mauslinien zeigten Cav2.3+/- und Cav3.2-/- im Vergleich zu Kontrollen (alle Tiere waren 20 Wochen alt) erhöhte Klick- und Ton-Burst-bezogene Hörschwellen.

Unter Verwendung des oben beschriebenen Wavelet-basierten Ansatzes wurden die klickevokierte ABR-Amplitudenwachstumsfunktion und die ABR-Wellenformlatenzanalyse durchgeführt (Abb. 5 bzw. Abb. 6). Letzteres ermöglicht Einblicke in den möglichen räumlich-zeitlichen Einfluss des gens von Interesse auf die auditive Informationsverarbeitung im Innenohr und Hirnstamm.

Abbildung 1: Klick-evozierte ABRs in Steuerungen und mutierten Mäusen (Cav3.2+/-, Cav3.2-/-). Repräsentative ABRs, die von (A) Cav3.2+/+, (B) Cav3.2+/-und (C) Cav3.2-/- weiblichen Mäusen nach Klickstimulation im zunehmenden SPL-Modus (ab 0) erhalten wurden –90 dB mit 5 dB SPL Schritten). Für die Mittelung wurde jede Stimuluseinheit 300 Mal bei 20 Hz angewendet. Der Beginn des akustischen Stimulus wird durch eine vertikale rote Linie angezeigt. Diese Zahl wurde von Lundt et al.60geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Tone burst-evozierte ABRs in Kontrollen und mutierten Mäusen (Cav3.2+/-, Cav3.2-/-). Repräsentative ABRs von (A) Cav3.2+/+, (B) Cav3.2+/-und (C) Cav3.2-/- weibliche Mäuse nach Tonausbrüchen von 1–42 kHz (6 kHz Schritte) bei einer SPL von 80 dB. Für die Mittelung wurde jede Stimuluseinheit 300 Mal bei 20 Hz vorgestellt. Der Beginn des akustischen Stimulus wird durch eine vertikale rote Linie angezeigt. Diese Zahl wurde von Lundt et al.60geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Klick-evozierte ABR-basierte Hörschwellen in Kontroll- und Mutantenmäusen (Cav3.2+/-, Cav3.2-/-). Aufgeklickter audiometrischer Hörschwelle von (A) weiblich und (B) männlich Cav3.2+/+ (weiblich: n = 12; männlich: n = 13), Cav3.2+/- (weiblich: n = 10; männlich: n = 9) und Cav3.2-/- Mäuse (weiblich: n = 10; männlich: n = 9). Die Daten werden als Mittelwert dargestellt. Statistische Signifikanzen wurden mit den Werten von 0,05 und p-Werten, definiert als *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Diese Zahl wurde von Lundt et al.60geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Ton geplatzte ABR-basierte Hörschwellen in Kontroll- und Mutantenmäusen (Cav3.2+/-, Cav3.2-/-). 1–42 kHz (6 kHz Schritte) Ton burst-evozierte ABR-basierte audiometrische Hörschwellen für Cav3.2+/+ (weiblich: n = 12; männlich: n = 12; é), Cav3.2+/- (weiblich: n = 10; männlich: n = 8; und Cav3.2-/- Tiere (weiblich: n = 10; männlich: n = 9; DieDaten werden als Mittelwert dargestellt. Statistische Signifikanzen wurden mit den Werten von 0,05 und p-Werten, definiert als *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Diese Zahl wurde von Lundt et al.60geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Amplitudenwachstumsfunktion auf klickbasierten ABR-Aufnahmen in Steuerungen und mutierten Mäusen (Cav3.2+/-, Cav3.2-/-). WI–WIV Amplitude (in Mikrovolt) gegen eine steigende SPL (in Dezibel) für die klickbevoked ABR-Wellenanalyse in Cav3.2+/+ (weiblich: n = 12; männlich: n = 11; schwarze Linie, die die ungefähre Kontrollkurve einschließlich des 95%-Konfidenzintervalls in Grau), Cav3.2+/- (weiblich: n = 8; männlich: n = 7; ') und Cav3.2-/- Tiere (weiblich: n = 7; männlich: n = 9 ; Sowohl Cav3.2-/- weibliche als auch männliche Mäuse weisen einen signifikant verzögerten Anstieg des Amplitudenwachstums über die zunehmenden SPLs für (A und B) WI, (C und D) WIIauf, und (G und H) WIV im Vergleich zu Cav3.2+/+ und Cav3.2+/- Mäuse. (E und F) Für WIIIzeigten nur Cav3.2-/- männliche Mäuse eine signifikante Verzögerung des Amplitudenwachstums in der zunehmenden SPL im Vergleich zu weiblichen Cav3.2-/- Tieren. Die Daten werden als Mittelwert dargestellt. Statistische Signifikanzen wurden mit den Werten von 0,05 und p-Werten, definiert als *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Diese Zahl wurde von Lundt et al.60geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Latenzanalyse bei klickbezichten ABR-Aufnahmen in Steuerungen und mutierten Mäusen (Cav3.2+/-, Cav3.2-/-). Latenzen (in Millisekunden) für jede ABR-Welle (WI-WIV) bei 65 dB SPL sind für Cav3.2+/+ dargestellt (weiblich: n = 12; männlich: n = 11), Cav3.2+/- (weiblich: n = 8; männlich: n = 7) und Cav3.2-/- Mäuse (weiblich: n = 8; männlich: n = 9). Beachten Sie, dass Latenzanalysen auch auf bestimmten Empfindungsniveaus durchgeführt werden können. Die Daten werden als Mittelwert dargestellt. Statistische Signifikanzwerte wurden mit den Werten von 0,05 und p-Werten, definiert als *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Diese Zahl wurde von Lundt et al.60geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: ABR-Architektur und Elektrodenpositionierung. (A) Repräsentative ABR-Aufzeichnung bei 65 dB SPL. Auf die ausgangsbasis (TW1, 5 ms) folgten der Testreiz (Klick oder Tonburst) und TW2 (10 ms) mit den frühen Brainstem-evozierten Potentialen. Auf TW2 folgte eine weitere Baseline (TW3, 10 ms). Die Basislinienperioden wurden verwendet, um die SD des Basisrauschens zu berechnen. Immer wenn eine einzelne ABR-Welle (WI-WIV) amplitude die SD des Basisrauschens um das Vierfache überschritt, wurde die Hörschwelle erreicht. Für den Wellenamplituden- und Latenzvergleich wurde ein "mexikanischer Hut"-basierter Wavelet-Ansatz durchgeführt, um automatisch negative Spitzen (blau-gelb gestreifte Linien) und positive Spitzen (rot-grau gestreifte Linien) zu erkennen. Grüne Kreuze zeigen die absoluten maximalen ABR-Wellenamplituden an und zeigen keine ungefähren Werte basierend auf dem Wavelet-Ansatz an. (B) Für die ABR-Aufnahmen wurden subdermale Edelstahlelektroden mit Hakenspitze verwendet. Die Referenzelektrode wurde an der linken Hüfte platziert, die positive (+) Elektrode am Scheitelpunkt (axial der Pinnae) positioniert und die negative (-) Elektrode ventrolateral der rechten Pinna eingesetzt, je nachdem, ob eine monaurale oder binaurale Aufnahme Durchgeführt. Diese Zahl wurde von Lundt et al.60geändert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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