Methodenartikel

Festsetzung des Ei Befruchtung Tabak Tabaci mit einer zytogenetischen Technik

DOI:

10.3791/59213

⸱

1. April 2019

 , 
1Graduate Interdisciplinary Program in Entomology and Insect Science, University of Arizona, 2Department of Entomology, University of Arizona

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir präsentieren eine einfache zytogenetische Technik mit 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) zu bestimmen, die Befruchtungsrate und primäre Geschlechtverhältnis der diploide invasive Schädling Tabak Tabaci.

Zusammenfassung

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Einige Arten von saugenden weiße fliegen sind einige der weltweit schädlichsten terrestrischen Schädlinge wegen der Ernte Schaden, den sie anrichten und Pflanzenviren sie Vektor. Trotz zahlreichen Studien über die Biologie dieser Arten in verschiedenen Umgebungen einem wichtigen Lebensgeschichte Parameter, Nachkommen Geschlechtverhältnisse, wenig Aufmerksamkeit erhalten hat, noch ist wichtig für die Vorhersage der Populationsdynamik. Die primäre Geschlechterverhältnis (Geschlechterverhältnis bei der Eiablage) Tabak Tabaci wurde nie berichtet aber kann durch die Bestimmung der Ei Befruchtungsrate dieses Insekts diploide gefunden werden. Bei dieser Technik wird die Dechorionation von Eiern mit Bleichmittel, eine Reihe von Schritten Fixierung und die Anwendung der allgemeinen DNA fluoreszierende Fleck, DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole, eine DNA-Bindung Fluoreszenzfarbstoff) an weiblichen und männlichen Vorkerne binden. Hier stellen wir die Technik und ein Beispiel für die Anwendung zu testen, ob ein endosymbiontische Bakterium Rickettsia SP. nr. Bellii, beeinflusst das primäre Geschlechtverhältnis von B. Tabaci. Diese Methode kann helfen, in Bevölkerungsstudien der weiße fliegen oder bei der Bestimmung, wenn Geschlecht Zuweisung mit bestimmte Reize aus der Umwelt vorhanden ist.

Einleitung

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Das Studium der Geschlecht-Zuweisung oder die relative Investition in männlichen und weiblichen Nachkommen, ist ein Eckpfeiler der Verhaltensökologie1,2,3. Neben seiner Kraft zu Testzwecken adaptive Modelle des Verhaltens kann zu wissen, die Sex-Allocation-Strategie eines Organismus Modelle der Populationsdynamik verbessern. Bei vielen Arten ist Sex Zuordnung von Müttern gesteuert. Um Sex-Zuweisung zu bestimmen, ist es wichtig zu bestimmen, der primäre Sex-Verhältnis oder der Anteil der Frauen bei der Eiablage. Obwohl das Geschlechterverhältnis bei Erwachsenen auftreten können Hinweise auf Geschlecht-Zuweisung vorsehen, kann differentielle Entwicklungsstörungen Mortalität zwischen männlichen und weiblichen Jugendlichen Erwachsenen Sex-Verhältnis häufig erheblich verzerren. Bei einigen Arten der Hautflügler, die Ordnung der Insekten, die Ameisen, Bienen und Wespen, enthält wurde das primäre Geschlechtverhältnis zytogenetische Tests, Färbung der Embryonen genetische DNA anzeigen ermittelt. Weil Hautflügler diploide, eine beginnende männlichen Ei ist haploid und enthält nur die weiblichen Vorkern (n), während beginnende weibliche Eier diploid sind und sowohl männliche als auch weibliche Vorkerne (2n enthalten). Obwohl Aleyrodidae, die Sap-Fütterung Familie True Wanzen (Hemiptera) bekannt als weiße fliegen, auch diploide, hat nicht stattgefunden ein etablierte Assay, der primäre Sex-Verhältnis in dieser Insekten zu finden. Dies ist vielleicht überraschend, da die Intensität der Studie über die paar kosmopolitischen ernsthafte Schädlinge in dieser Familie und die Bedeutung der Geschlechtverhältnisse in wettbewerbsfähige Interaktionen weiße fliegen4,5,6,7 ,8,9,10 und Populationsdynamik im Allgemeinen. In diploide Insekten sind auch Geschlechtverhältnisse ungezwungen Sex Bestimmung Systeme, die Möglichkeit der selektiven Düngung und labile Geschlechtverhältnisse, die mit der Umwelt2variieren. Hier präsentieren wir eine Technik, um festzustellen, das primäre Geschlechtverhältnis des Komplexes Arten der weiße fliegen, zusammen bekannt als die Süßkartoffel Mottenschildläuse, B. Tabaci. Dieser ein Artname umfasst mehr als 28 Arten weltweit11und beinhaltet einige der schädlichsten global invasive Schädlinge12,13. Die Anwendung dieser Technik bestimmen Geschlecht Zuordnungsmuster in B. Tabaci und andere Aleyrodidae ermöglicht eine gründlichere Untersuchung von Variablen, einschließlich Temperatur, Wirtspflanze, endosymbiontische Bakterien oder Pflanzen/Mottenschildläuse Krankheitserreger, die primäre Geschlechtverhältnisse Pflanzensaft und Mottenschildläuse Populationsdynamik beeinflussen können.

Wir sind keine vergleichbaren Ei-beflecken Techniken für B. Tabacinicht bewusst. Das Protokoll ist bequem im Vergleich zu Färbung Methoden für andere Insekteneier14 verwendet, da es einen Übernachtung Fixierung Schritt unterlässt und daher innerhalb von 3 Stunden abgeschlossen werden kann. Als ein Beispiel für eine Anwendung, ein endosymbiontische Bakterium, Rickettsien SP. nr. Bellii, ist verbunden mit weiblicher Neigung in unserem Labor Zeilen von B. Tabaci Nahost-Asia Minor 1 (MEAM1)15,16. In B. Tabaci MEAM1 Labor einzeilig ("MAC1," von der Maricopa Agricultural Center gesammelt), wir testen ob Rickettsia-infizierten (R+) Weibchen befruchten mehr Eier als nicht infizierte Frauen (R–).

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Protokoll

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Hinweis: Stellen Sie sicher, dass alle Arbeiten bei Raumtemperatur in einem gut belüfteten Raum oder unter einem Abzug durchgeführt wird. Alle "Tropfen" in diesem Protokoll sind definiert als 5 – 20 µL, je nach Vorliebe des Betreibers.

1. Ersteinrichtung

  1. Weibliche weiße fliegen, auf saubere Blätter oviposit zu ermöglichen. Beispiele für die Eiablage Arenen Clip Käfige oder Blätter geschnitten, um auf Agar in einer Petrischale. Machen Sie ein abdeckbar Loch in der Clip-Käfig oder Petrischale Cover einfügen und entfernen die Erwachsenen. Alternativ ein Gefäß der gesammelten Erwachsene schnell auf Eis gelegt und dann auf dem Blatt zu hinterlegen. Begrenzen Sie die Zeit zwischen Eiablage und Ei Fixierung auf nicht mehr als 60 min, um die Beobachtung von den Spermien Übergang in die väterliche Vorkern in Eiern zu gewährleisten.
    Hinweis: Eier, die nicht aus dem Blatt entfernt können bis zum Erwachsenenalter Erwachsenen Geschlechtverhältnisse aufzeichnen aufgezogen werden.
  2. Bereiten Sie vor oder bei der Eiablage Pflanzensaft einen Objektträger durch Reinigung mit Seife und Wasser, trocknen es gut, und dann ein Stück Paraffin Film über ein Ende, dafür, dass die Filmoberfläche Paraffin nicht bricht (Abbildung 1).
    Hinweis: Paraffin-Film ist hydrophob und halbdeckend, fällt und Eier leichter abzuwarten, so dass Flüssigkeiten zu bilden.

(2) Dechorionation

  1. Mit einem Glas Pasteur pipette, Tropfen von Bleichmittel-Lösung (0,83 % Natriumhypochlorit) auf der Paraffin-Film.
    Hinweis: Es ist einfacher zu behalten Eier wenn nur 2 – 3 Eier in jedem Tropfen sind. Alternativ, um ein großes Ei Nummer zu verwalten, sammeln Sie die Eier in Tropfen 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
    Vorsicht: Bleach ist ätzend; tragen Sie Handschuhe beim Umgang mit bleichen und nicht einatmen.
  2. Entfernen Sie die Erwachsenen weiße fliegen aus dem Blatt.
  3. Legen Sie das Blatt unter dem Mikroskop zu sehen die Eier deutlich und sammeln die Eier einzeln und vorsichtig mit einer dünnen Sonde. Um eine Probe zu machen, setzen Sie einen Minuten Nadel Stift, bei 45° oder auf einem bequemen Arbeitswinkel in eine geschmolzene Pipettenspitze (Abbildung 2).
  4. Übertragen Sie die Eier auf Bleichmittel oder 1 X PBS. Wenn 1 X PBS verwenden, entfernen Sie das 1 X PBS mit einem Glas Pasteur pipette einmal alle Eier werden gesammelt und dann fügen Sie Bleichmittel auf die Eier.
    Hinweis: Beim Sammeln von Eiern heben Sie langsam das Ei von der Basis bis der Stiel aus dem Blatt entfernt wird. Der Stiel ist klebrig, und das Ei wird häufig halten Sie sich an der Sondenspitze bis es in der Bleiche getaucht wird.
    Hinweis: Es wird empfohlen, separate Glas, die Pasteur Pipetten für alle Reagenzien zu verwenden, und die Pipetten mit Hitze, um die Spitzen schmaler zu machen und das Risiko von versehentlich Absaugen Mottenschildläuse Eier geändert werden können. Zur Vermeidung von Rückständen und Verunreinigungen Reinigen der Pipetten mit entionisiertem Wasser nach jedem Gebrauch.
  5. 10 min. warten. Besteht ein Interesse an der Embryogenese in Eiern, die älter als 1 h, lassen Sie die Eier in Bleichmittel für bis zu 15 Minuten.
    Hinweis: Für Eier, die bis zu 1 Stunde alt sind, ist 10 Minuten ausreichend.

(3) Fixierung

Hinweis: Diese Schritte sind von einer Hymenopteran Protokoll17.

  1. Das Bleichmittel (enthält die Chorion-Fragmente) mit einem Glas Pasteurpipette entfernen und entsorgen. Fügen Sie Tropfen Eisessig mit einem Glas Pasteur pipette und 3 min warten.
    Vorsicht: Gehen Sie mit diesem Schritt unter einem Abzug. Eisessig ist ätzend; Handschuhe tragen beim Umgang mit Eisessig und nicht einatmen, vor allem in Kombination mit den restlichen Bleichmittel.
  2. Eisessig mit einem Glas Pasteurpipette entfernen und Clarkes Lösung Tropfen (3:1 von absoluten Ethanol: Eisessig) mit einem Glas Pasteur pipette. Warten Sie, bis die meisten der Lösung verdampft (oder max. 10 min).
  3. Tropfen von 70 % Ethanol auf die Eier mit einem Glas Pasteurpipette und warten Sie, bis die meisten des Ethanols verdampft (oder 10 min-Max).

(4) Färbung

  1. Die Eier mit einem Glas Pasteurpipette zu den pH-Wert in der Nähe von 7.0 fügen Sie Tropfen 1 X PBS hinzu und entfernen Sie alle verbleibenden Ethanol mit einem Glas Pasteurpipette. Legen Sie den Mikroskop-Objektträger in eine feuchte Kammer, Austrocknung, z. B. in einer leeren Pipette-Tipp-Box mit einem feuchten Papiertuch innen (Abbildung 3) zu verhindern. Warten Sie mindestens 30 Minuten.
    Hinweis: Dies ist der beste Punkt, wenn eine Pause benötigt wird, solange die feuchte Kammer Austrocknung verhindern kann.
  2. 1 X PBS mit einem Glas Pasteurpipette, zu entfernen und Tropfen von 0,1 μg/mL DAPI, einen DNA-fluoreszierende Fleck, mit einem Glas Pasteur pipette. Objektträger in eine dunkle feuchte Kammer und warten Sie mindestens 15 Minuten.
    Vorsicht: DAPI ist reizend, also mit Handschuhen umgehen.

5. Waschen

  1. Entfernen Sie das DAPI mit einem Glas Pasteurpipette.
  2. 1 Tropfen X TBST (5 X Lösung aus 30 g Tris, 43,8 g NaCl und 5 mL Polysorbat 20 1,0 g NaN3 [pH 7.5] und brachte bis 1 L mit PCR Grad Wasser) auf die Eier mit einem Glas Pasteur pipette. Warten Sie 5 Minuten vor dem Entfernen der 1 X TBST mit einem Glas Pasteurpipette. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 Mal.

6. Montage

  1. Nach der letzten Wäsche pipette vorsichtig die Eier aus dem Paraffin-Film auf einem sauberen Teil des Mikroskop-Objektträger. Entfernen Sie überschüssige 1 X TBST; Fügen Sie 20 µL Montage Medien (80 % Glycerin und 20 % 1 X TBST mit 2 % n-Propyl-Gallat) und legen Sie eine saubere Abdeckung Folie auf die Eier.
  2. Für langfristige Lagerung Titeldia mit klaren Nagellack versiegeln und dann entweder die Folie im Dunkeln bei 2 ° C zu speichern oder sofort unter dem Fluoreszenz-Mikroskop anzeigen.

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Ergebnisse

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Um zu testen ob Rickettsia die Befruchtungsrate von B. Tabaci MEAM1 Weibchen beeinflusst aufgezogen wir Rickettsia-infiziert (R+) oder nicht (R–) infizierte B. Tabaci auf Cowpea Pflanzen (Vigna Unguiculata) in separate Käfige bei 27 ° C, 70 % relativer Luftfeuchtigkeit und ein 16 h Licht/8 h dunkel Photoperiode. + R und R– vierten Instar weiße Fliegen wurden sorgfältig aus den Blättern entfernt und in...

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Diskussion

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Dieses Protokoll ist die erste, die Befruchtungsrate oder primäre Geschlechterverhältnis, B. Tabacizu erfassen. Die Herausforderung dieses Protokolls ist, dass es Forscher lernen, wie man die Mottenschildläuse Eier schnell verarbeiten erfordert sicherzustellen, dass nicht mehr als 1 h vergangen, seit die Eier oviposited wurden, bis diese behoben sind. In Vorversuchen waren Eier, die bei 3 h oder mehr Postoviposition befestigt waren zu alt, um die Befruchtung zu beobachten, wie Syngamy eingetreten und mitotische ...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Diese Forschung wurde durch eine NSF Grant (DEB-1020460), M.S.H. und ein USDA AFRI-Stipendium (2010-03752), M.S.H. finanziert. Die Autoren danken Brennan Zehr für Färbung Mottenschildläuse Eier mit viel Geschick und Zen. Die Autoren danken Mike Riehle für die Verwendung von seinem fluoreszierenden Mikroskop für die Bildgebung. Die Autoren danken für die Ei-Bilder Suzanne Kelly und Marco Gebiola. Die Autoren danken für die Unterstützung in entscheidenden Momenten während der Experimente Suzanne Kelly und Jimmy Conway.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1x PBSBeliebig
1x TBSTJede5x Lösung hergestellt aus 30 g Tris, 43,8 g NaCl, 5 mL Tween-20 und 1,0 g NaN3 pH 7,5 und mit Wasser in PCR-Qualität auf 1 l gebracht
BleichmittelCloroxJedes Haushaltsbleichmittel funktioniert, solange es auf 0,83 % verdünnt werden kann Natriumhypochlorit
Klarer NagellackBeliebig
DAPI DilaktatSanta Cruz Biotechnologiesc300415
EthanolBeliebigesverdünntes auf 70% EtOH
Fluoreszierendes MikroskopNikonNikon Eclipse 50i wurde in diesem Experiment verwendet, aber jedes Fluoreszenzmikroskop mit 340/380 nm Anregungsfilter und mindestens 4-10-facher Vergrößerung kann verwendet werden
EisessigMallinckrodtUN2789
GlycerinJedes
MikroskopWildFür dieses Experiment wurde ein Wild M5A-Mikroskop verwendet, aber jedes Mikroskop, bei dem der Bediener die Eier der Weißen Fliege deutlich sehen kann, kann verwendet werden.
ObjektträgerabdeckungenAlleMethoden sind für Objektträgerabdeckungen der Größe 18 mm x 18 mm. Für größere Diaabdeckungen müssen weitere Eindeckmedien hinzugefügt werden.
ObjektträgerBeliebig
Minuten NadelstifteBioQuip1208SAMinuten Nadelstifte sind optional für die Herstellung als Sonden mit Pipettenspitzen
NaClBeliebig
NaN3beliebig
n-PropylgallatSigma/Santa Cruz BiotechnologieP3130/sc-250794
ParafilmBemis
Pasteur PipettenFisher Scientific13-678-20AFisherbrand Einweg-Pasteur-Pipetten aus Borosilikatglas 5,75 Zoll Ein Bunsenbrenner kann auch erforderlich sein, wenn der Bediener Pipetten verlängern und verengen möchte
in PCR-QualitätAlle
PipettenspitzenAllePipettenspitzen sind optional für die Herstellung als Sonden mit Minutennadelstiften
Kleiner TropfkolbenAlleMuss auf Pasteur-Pipette
passenTris Beliebig
Tween-20Beliebig
Wasser

Referenzen

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Schlagwörter

Befruchtungsrate der Wei e FliegeEidechorionierungDAPI Kernf rbungFluoreszenzmikroskopiehaplodiploider Geschlechterverh ltnisPrim rgeschlechterverh ltnisRickettsia EndosymbiontFixierungsprotokoll f r Eier

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