Studium der RNA Interaktoren des RNA während der Säugetier-Zelle Zyklus aktiviert Proteinkinase

Proteinkinase RNA aktiviert (PKR), auch bekannt als eukaryotic Initiation Faktor 2-Alpha Kinase 2 (EIF2AK2), ist ein gut charakterisierten Proteinkinase, die Informationen von RNAs überträgt. Es gehört zu den eukaryotic Übersetzung Einleitung 2 Untereinheit Alpha (eIF2α) Kinase Familie und phosphorylates eIF2α bei Serin 51 in Reaktion auf eine Infektion, globale Übersetzung¹zu unterdrücken. In diesem Zusammenhang ist PKR durch virale doppelsträngige RNA (DsRNAs), aktiviert, die eine Plattform für PKR Dimerisierung und Autophosphorylation²zur Verfügung zu stellen. Neben eIF2α kann PKR auch c-Jun N-Terminal Kinase (JNK), Tätigkeit von zahlreichen Signal Transduction Bahnen^{3,4,5, Regeln, p53, Insulin-Rezeptor Substrat 1 und Inhibitor κB phosphorylieren 6}.

PKR wurde ursprünglich als eine Kinase identifiziert, die eIF2α während der Poliovirus-Infektion phosphoryliert, durch das Poliovirus' DsRNAs^7,8erkennen. PKR findet sich zunehmend vielfältigen Rollen über Immunantwort zu spielen und seine aberrante Aktivierung oder Störung wird in zahlreichen menschlichen Krankheiten impliziert. Aktiviert/Phosphorylated PKR (pPKR) ist häufig zu beobachten während der Apoptose und ist ein gemeinsames Merkmal von Patienten mit degenerativer Erkrankungen, vor allem neurodegenerativer Erkrankungen wie der Chorea Huntington, Parkinson und Alzheimer-Krankheit^{9 ,10,11,12,13}. Darüber hinaus ist PKR unter verschiedenen Stressbedingungen wie metabolischer Stress und Hitze Schock^14,15,16,17aktiviert. Auf der anderen Seite führt Hemmung der PKR erhöhten Zellproliferation und sogar maligne Transformation^18,19. PKR-Funktion ist auch wichtig in der normalen Gehirnfunktion und während des Zellzyklus als das Niveau der pPKR ist während der M Phase^20,21,22erhöht. In diesem Zusammenhang pPKR globale Übersetzung unterdrückt und bietet Hinweise zu wichtigen mitotischen Signalsysteme, die für die ordnungsgemäße Zellteilung²⁰erforderlich sind. Darüber hinaus führte anhaltende Aktivierung von PKR G2/M-Phase Zellzyklus Festnahme in Chinese Hamster Eierstock²³Zellen. Infolgedessen ist der Negative Feedback-Schleife zu gewährleisten schnelle Deaktivierung während M/G1 Übergang²¹PKR Phosphorylierung geregelt.

Trotz der breiten Palette von PKR-Funktion beschränkt sich unser Verständnis von PKR Aktivierung aufgrund des Fehlens eines standardisierten Hochdurchsatz-experimentellen Ansatzes zu erfassen und identifizieren von DsRNAs, die PKR aktivieren können. Frühere Studien haben gezeigt, dass PKR interagieren kann, mit DsRNAs gebildet durch zwei invertierten Alu Wiederholungen (IRAlus)^20,24, sondern die Möglichkeit der Existenz von weiteren zellulären DsRNAs, die PKR während des Zellzyklus oder unter aktivieren können Stressbedingungen in menschlichen Zellen war unerforscht. Der konventionelle Ansatz bei der Identifizierung von RNA-Interaktoren des ein RNA-bindendes Protein (RBP) verwendet UV-Licht auf Crosslink RNA-RBP-komplexe^25,26,27. Eine aktuelle Studie dieser UV-Vernetzung-Ansatz in einem Maus-System angewendet und festgestellt, dass die kleinen Nukleolus RNAs PKR Aktivierung während metabolischer Stress¹⁶regulieren können. Durch die Verwendung von hohen Vernetzungseffizienz von Formaldehyd, präsentierten wir eine andere Methode zum PKR-Interaktion RNAs während des Zellzyklus in HeLa Zellen²⁸zu identifizieren. Ein ähnlicher Ansatz wurde angewandt, um andere DsRBPs wie Staufen und Drosha^29,30,31zu studieren. Wir fanden, dass PKR mit verschiedenen Arten von nichtcodierender RNA interagieren kann, wie z. B. kurzes eingestreuten nuklearen Element (Sinus), lange nuklearen Element (Linie), Element endogene Retroviren (ERV) und sogar Alpha-Satelliten-RNAs durchsetzt. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass PKR welche Form intermolekulare DsRNAs durch ergänzende Zusammenspiel der Heavy-Strang und das Licht RNAs²⁸Strang mit mitochondrialen RNAs (MtRNAs), interagieren kann. Eine kürzlich erschienenen Publikation unterstützt weiter unsere Daten, dass einige MtRNAs gibt es in einer duplex Formulars und DsRNA Sensoren wie Melanom Differenzierung-assoziierten Protein 5 induzieren Interferone³²aktivieren können. Noch wichtiger ist, sind Ausdruck und subzelluläre Lokalisation der MtRNAs moduliert während des Zellzyklus und durch verschiedene Stressoren, die möglicherweise wichtig in ihrer Fähigkeit, PKR Aktivierung²⁸zu regulieren.

In diesem Artikel präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für eine neu entwickelte Formaldehyd Vernetzung und Immunopräzipitation (fCLIP) Methode zum erfassen und analysieren von PKR-Interaktion RNAs während des Zellzyklus. Wir zeigen die Methode zum Zellzyklus Festnahme Proben mit Thymidin und Nocodazole vorzubereiten. Dann präsentieren wir Ihnen den fCLIP Prozess um PKR-gebundenen RNAs und eine Methode zur Vorbereitung von Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliothek, um diese RNAs zu identifizieren zu isolieren. Darüber hinaus beschreiben wir detaillierte Verfahren zur PKR-gebundenen RNA mittels qRT-PCR Analyse. Insbesondere stellen wir ein Strang-spezifische reversen Transkription Verfahren um die Strandedness des MtRNAs zu analysieren. Das beschriebene Protokoll für HeLa-Zellen und PKR optimiert ist, aber wichtige Schritte wie die Vorbereitung des Zellzyklus Probe, fCLIP und Strang-spezifische qRT-PCR-Analyse können einfach geändert werden, um zelluläre DsRNAs studieren oder RNA Interaktoren des anderen DsRBPs identifizieren.

1. Lösung und Handy Vorbereitung

1. Vorbereitung der Lösung
   1. Das Zellkulturmedium Vorbereitung Medium für HeLa Zellkultur durch Zugabe von 50 mL der fetalen bovine Serum (FBS), 500 mL von Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM).
      Hinweis: Antibiotika können das Zellkulturmedium hinzugefügt werden, aber wir verwenden keine Antibiotika.
   2. Die 0,1 % Paraformaldehyd, lösen sich in 4 % (w/V) Paraformaldehyd in 1 x Phosphate-Buffered Kochsalzlösung (PBS) mit Heizung auf einer heißen Platte und verdünnte, 30 mL 0,1 % (V/V) Paraformaldehyd durch Zugabe von 1 X PBS zu machen.
      Achtung: Führen Sie alle Schritte in einer Dampfhaube und achten Sie darauf, die Paraformaldehyd Lösung zu kochen. Die 0,1 % ige Lösung vor Licht schützen und Lagerung bei 4 ° C. Verwenden Sie die Lösung innerhalb eines Monats.
      Hinweis: Der pH-Wert der 0,1 % (V/V) Paraformaldehyd Endlösung sollte rund 7.
   3. FCLIP Lyse Puffer vorzubereiten: 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 15 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,5 % (V/V) Nonidet-p40 (NP-40), 0,1 % (V/V) Triton x-100, 0,1 % (V/V) Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) und 0,1 % (w/V) Natrium Deoxycholate. 40 mL dreifach destilliertes Wasser (TDW) hinzufügen. Shop bei 4 ° C.
   4. FCLIP Waschpuffer vorbereiten: 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,1 % (V/V) NP-40, 0,1 % (V/V) Triton x-100, 0,1 % (V/V) SDS und 0,1 % (w/V) Natrium Deoxycholate. 40 mL TDW hinzufügen. Shop bei 4 ° C.
   5. 4 x PK Puffer vorzubereiten: 400 mM Tris-HCl (pH 7,5), 200 mM NaCl, 40 mM EDTA und 4 % (V/V) SDS. 40 mL TDW hinzufügen. Bei Raumtemperatur lagern.
   6. Bereiten Sie fCLIP Elution Buffer: 20 mL 4 x PK Puffer, 21 g Harnstoff und 8,5 mL tdw. Frisch zubereiten.
   7. Bereiten Sie RNA Elution Buffer: 0,3 M NaOAc und 2 % (w/V) SDS. Bei Raumtemperatur lagern.
   8. 2 x RNA laden Farbstoff vorbereiten: 0,025 % (w/V) Bromophenol Blue, 0,025 % (w/V) Xylol Cyanol 5 mM EDTA, 0,05 % (w/V) SDS und 95 % (V/V) Formamid. Shop bei-20 ° C.
   9. Bereiten Sie 1 X TBE Puffer: 0.089 M Tris-Borat und 0,002 M EDTA. 500 mL TBE Puffer vorzubereiten.
2. Vorbereitung von S oder M-Phase verhaftet Zellen
   1. Samen ~ 750.000 oder ~ 1.000.000 Zellen HeLa für S oder M Phase verhaftet Proben, beziehungsweise. Wachsen Sie Zellen bei 37 ° C und 5 % CO₂ für 24 h.
   2. Behandeln Sie die Zellen mit 2 mM Thymidin und 18 h bei 37 ° c inkubieren
   3. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Hinzufügen von neuen Medien und 9 h bei 37 ° c inkubieren
   4. Für S-Phase-verhaftet-Zellen Zellen mit 2 mM Thymidin zu behandeln. Für M-Phase-verhaftet-Zellen Zellen mit 100 ng/mL Nocodazole zu behandeln. 15 h bei 37 ° C und Ernte Zellen inkubieren.
      Hinweis: Die Homogenität der Zellzyklus Proben kann mit FACS geprüft werden.

(2) Formaldehyd Vernetzung und Immunopräzipitation

1. Zellernte
   1. Für ein S-Phase-Probe sammeln Sie Zellen mit einer Zelle Schaber und Transfer in ein 15 mL konische Röhrchen. Ein M-Phase-Probe Tippen Sie auf der Seite der Zelle Kulturschale M Phase verhaftet Zellen lösen und in eine 15 mL konische Röhrchen überführen.
      Hinweis: Um die Homogenität der M-Phase-verhaftet-Zellen zu erhöhen, verwenden Sie keinen Zelle Schaber.
   2. Zentrifugieren der Zellen bei 380 X g bei Raumtemperatur für 3 min. Entfernen des Überstands und mit 1 mL kaltem PBS und Überführung in ein 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch wieder auszusetzen.
   3. Zentrifugieren Sie den Zellen bei 10.000 X g bei 4 ° C für 30 S. Entfernen des Überstands vollständig.
2. Formaldehyd-Vernetzung
   1. Fügen Sie 750 μl von 0,1 % Paraformaldehyd für 10 min bei Raumtemperatur, die Zellen zu beheben.
   2. Fügen Sie 250 μL 1 M Glycin und inkubieren Sie eine zusätzliche 10 min bei Raumtemperatur um die Reaktion zu stillen. Zentrifugieren Sie den Zellen bei 10.000 X g bei 4 ° C für 30 S. Entfernen des Überstands vollständig.
   3. Wieder mit 1 mL PBS aussetzen. Zentrifugieren Sie die Zellen an 10.000 x g bei 4 ° C für 30 s und Entfernen der Überstand.
   4. Neu mit 400 μl der fCLIP Lyse Puffer ergänzt mit 0,2 % (V/V)-Protease-Inhibitor und 2 % (V/V) RNase-Inhibitor aussetzen. Für 10 min auf Eis brüten und beschallen mit einer Ultrasonicator.
   5. Fügen Sie 11 μl 5 M NaCl, NaCl-Konzentration auf ~ 150 mM einzustellen. Vortex kurz und Zentrifuge bei 21.130 X g bei 4 ° C für 15 min. übertragen Überstands auf ein vorgekühlt 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
      Hinweis: Behalten Sie 40 μl des Überstandes in einem neuen Zentrifugenröhrchen als das Eingabesample. Das Eingabesample bei 4 ° c lagern
3. Immunopräzipitation
   1. Fügen Sie 20 μl Protein A Perlen zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
   2. Waschen Sie die Perlen mit 400 μl der fCLIP Lyse Puffer. Zentrifugieren Sie den Perlen bei 1.000 X g bei 4 ° C für 1 min. Entfernen des Überstands und fügen Sie 400 μl fCLIP Lyse Puffers sorgfältig hinzu. Vorsichtig wieder unterbrechen die Perlen durch invertieren 3 ~ 4mal.
   3. Wiederholen Sie der Waschschritt dreimal. Nach dem letzten Waschen ist den Überstand vollständig zu entfernen.
   4. Wieder aussetzen Sie, die Perlen in 300 μl der fCLIP Lyse Puffer. Fügen Sie 8,3 μL 5 M NaCl, NaCl-Konzentration auf ~ 150 mM einzustellen. Fügen Sie 10 μL der PKR Antikörper und 3 h auf ein Rotator bei 4 ° c inkubieren
   5. Zentrifugieren Sie den Perlen bei 1.000 X g bei 4 ° C für 1 min. Entfernen des Überstands und fügen Sie 400 μl Waschpuffer fCLIP hinzu. Vorsichtig wieder unterbrechen die Perlen durch invertieren 3 ~ 4mal.
   6. Wiederholen Sie der Waschschritt zwei Mal. Nach dem letzten Waschen ist den Überstand vollständig zu entfernen.
      Hinweis: Verwenden Sie niemals einen Vortex-Mixer. Invertieren Sie das Rohr vorsichtig mit den Händen.
   7. Fügen Sie 300 μL der lysate und 3 h bei 4 ° C auf ein Rotator inkubieren.
      Hinweis: Längere Inkubationszeit kann erhöhte Hintergrund Bindung führen.
   8. Zentrifugieren Sie den Perlen bei 1.000 X g bei 4 ° C für 1 min. Entfernen des Überstands und fügen Sie 400 μl Waschpuffer fCLIP hinzu. Vorsichtig wieder unterbrechen die Perlen durch invertieren 3 ~ 4mal.
   9. Wiederholen Sie der Waschschritt dreimal. Nach dem letzten Waschen ist den Überstand vollständig zu entfernen.
   10. Fügen Sie 300 μL fCLIP Elution Puffer. Brüten Sie in einem Thermomixer für 3 h bei 25 ° C eluieren PKR aus Perlen.
       Hinweis: Die fCLIP Elution Buffer frisch zubereiten.
   11. Zentrifugieren bei 1.000 X g bei Raumtemperatur und den Überstand in ein sauberes Röhrchen silikonisierte zu übertragen.
       Hinweis: Ein Microcentrifuge Schlauch ist auch ok, aber silikonisierte Rohr wird bevorzugt, um die Verdunstung während der de-Vernetzung Schritt (Schritt 2.3.12) zu verhindern.
   12. Fügen Sie 300 μL Proteinase K (20 mg/mL) und über Nacht bei 65 ° c inkubieren
       Hinweis: Verwenden Sie einen Thermomixer mit beheizten Abdeckung um Verdunstung zu vermeiden.
4. RNA-Extraktion
   1. Fügen Sie 580 μL der Säure-Phenol-Chloroform und Vortex für 30 S. Inkubation bei 37 ° C für 1 h.
   2. Vortex für 30 s und Zentrifuge bei 12.000 X g bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
   3. Übertragen Sie die oberste Schicht in einem sauberen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Fügen Sie 1/10 Volumen von 3 M NaOAc 0,5 μL des Coprecipitant (z.B. Glycoblue) und ein gleiches Volumen von Isopropanol. Inkubation über Nacht bei-20 ° C.
   4. Überstürzen Sie Pellets durch Zentrifugieren bei maximaler Geschwindigkeit bei 4 ° C für 1 h.
      Hinweis: RNA/DNA-Pellets nicht beachtet wurden, fügen Sie eine zusätzliche 0,5 μL Coprecipitant und Zentrifuge für eine zusätzliche 1 h weiter diesen Schritt, bis RNA/DNA-Pellets eingehalten werden.
   5. Entfernen Sie den Überstand zu und fügen Sie 1 mL 75 % Äthylalkohol. Zentrifuge bei 12.000 X g bei 4 ° C für 5 min. Wiederholen der Waschschritt noch einmal. Den Überstand vollständig entfernen und das Pellet bei Zimmertemperatur trocknen.
   6. Fügen Sie 42 μL TDW, 5 μL der DNase I-Puffer, 1 μl RNase-Inhibitor und 2 μL der DNase I. Inkubation bei 37 ° C für 1 h.
   7. Fügen Sie 150 μL tdw und 200 μL der Säure-Phenol-Chloroform. Vortex für 30 S. Zentrifuge bei 12.000 X g bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
   8. Übertragen Sie die oberste Schicht in einem sauberen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Fügen Sie 20 μl 3 M NaOAc, 0,5 μL Coprecipitant und 1 mL 100 % Äthylalkohol. Inkubation über Nacht bei-80 ° C.
   9. Überstürzen sich Pellets und waschen mit 75 % Ethylalkohol wie 2.4.4 zu 2.4.5 beschrieben.
   10. Neu in die entsprechende Menge an TDW auszusetzen.

3. Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung

1. rRNA entfernen
   1. Wieder aussetzen der RNA-Pellets aus Schritt 2.4.10 mit 28 μL tdw.
      Hinweis: Die maximale Größe des Gesamt-RNS sollte weniger als 5 μg.
   2. Folgen Sie den Anweisungen zur Verfügung gestellt von der rRNA Entfernung Kit Referenzhandbuch, rRNA zu entfernen.
   3. Aufräumen rRNA erschöpft RNAs durch Hinzufügen von 160 μl des magnetischen Beads.
      1. Durch Pipettieren ~ 15 Mal mischen und bei Raumtemperatur 15 min inkubieren.
      2. Das Rohr auf einer magnetischen Leiste befestigen und Entfernen des Überstands.
      3. Fügen Sie 300 μL von 80 % Ethylalkohol, während die Perlen noch auf der magnetischen Leiste befestigt sind und inkubieren Sie für 30 s.
      4. Ethylalkohol mit einer frischen 300 μl Lösung zu ersetzen. Die Perlen auf der magnetischen Leiste für 12 min. bei Raumtemperatur lufttrocknen.
      5. Wieder aussetzen Sie, die Perlen in 12 μL der TDW und Mix durch Pipettieren 15mal.
      6. Befestigen Sie die Perlen auf der magnetischen Bar und verschieben Sie den Überstand in ein sauberes PCR-Röhrchen.
   4. Zum Abbau der fragmentierten ribosomalen RNAs (rRNAs) nach dem Verfahren von rRNA Erschöpfung Kit zur Verfügung gestellt.
   5. Die RNAs durch Hinzufügen von 110 μL der magnetischen Beads und sich wiederholende Schritte 3.1.3.1 zu 3.1.3.6 bereinigen.
2. RNA-Kennzeichnung und Adapter-Ligatur
   1. Fügen Sie auf rRNA-abgereicherte RNAs 2 μL der 10 X CIAP Puffer, 1 μl RNase-Inhibitor und 2 μL des antarktischen alkalische Phosphatase. Inkubation bei 37 ° C für 1 h und dann bei 65 ° C für 5 min, die Phosphatase zu inaktivieren.
   2. Fügen Sie 3 μL der 10 X PNK Puffer, 1,5 μl RNase-Inhibitor, 1,5 μl T4 PNK-Enzyms, 0,8 μl des R-ATP und 1,7 μL tdw. Bei 37 ° C für 50 min inkubieren.
   3. Fügen Sie 1,5 μl 10 mm ATP und bei 37 ° C für weitere 40 min inkubieren.
   4. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 170 μL des Puffers RNA Elution.
   5. Fügen Sie 200 μL der Säure-Phenol-Chloroform und Vortex für 30 S. Zentrifuge bei 12.000 X g bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
   6. Übertragen Sie die oberste Schicht in einem sauberen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Fügen Sie 20 μl 3 M NaOAc, 0,5 μL Coprecipitant und 1 mL 100 % Äthylalkohol. Inkubation über Nacht bei-80 ° C.
   7. RNA Pellets auszufällen und waschen mit 75 % Ethylalkohol wie 2.4.4 zu 2.4.5 beschrieben. Neu in 4,5 μl tdw und fügen Sie 9 μl 2 x RNA laden Farbstoff hinzu.
   8. Erhitzen der Probe bei 95 ° C für 5 min und Last auf einem 10 % Harnstoff-PAGE-Gel.
   9. Laufen Sie das Gel bei 370 V 40 min.
      Hinweis: Pre-ausführen das Gel bei 370 V 90 min vor dem Einlegen der Probenmaterials.
   10. Das Gel auf die ~ 100 – 500-Nukleotid-Region und brechen Sie das Gel.
   11. Fügen Sie 700 μl 0,3 M NaCl und Inkubation über Nacht bei 4 ° C auf ein Rotator.
   12. Übertragen Sie die Lösung auf eine Spalte und Zentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit bei Raumtemperatur für 5 min.
   13. Übertragen Sie das Eluat in einem sauberen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Fügen Sie 1/10 Volumen von 3 M NaOAc, 0,5 μL des Coprecipitant und ein gleiches Volumen von Isopropanol. Inkubation über Nacht bei-20 ° C.
3. 3' Adapter Ligatur
   1. RNA Pellets auszufällen und waschen mit 75 % Ethylalkohol wie 2.4.4 zu 2.4.5 beschrieben.
   2. Re die RNA-Pellets in 6,5 μL tdw und fügen Sie 1 μl 10 μm 3' Adapter hinzu.
   3. Die Lösung zu einem PCR-Schlauch zu übertragen und bei 70 ° C für 2 min inkubieren.
   4. 1 μl 10 X Ligatur Puffer, 0,5 μl RNase-Inhibitor und 1 μl T4 RNA Ligase 2 hinzufügen. Inkubation bei 28 ° C für 1 h, 6 h 25 ° C und 22 ° C 6 h.
   5. Fügen Sie 12 μL 2 x RNA laden Farbstoff und Wärme bei 95 ° C für 5 min.
   6. Gel zu reinigen 3' Adapter ligiert RNAs wie in 3.2.9 auf 3.2.13 beschrieben.
4. 5' Adapter Ligatur
   1. RNA Pellets auszufällen und waschen mit 75 % Ethylalkohol wie 2.4.4 zu 2.4.5 beschrieben.
   2. Re die RNA-Pellets in 4.2 μL tdw und fügen Sie 1 μl 5 μM 5' Adapter hinzu.
   3. Die Lösung zu einem PCR-Schlauch zu übertragen und bei 70 ° C für 2 min inkubieren.
   4. 0,8 μl 10 X Ligase Puffer, 0.4 μl RNase-Inhibitor, 0,8 μl 10 mm ATP, 0,8 μl T4 RNA Ligase 1 hinzufügen. Inkubation bei 28 ° C für 1 h, 6 h 25 ° C und 22 ° C 6 h.
5. Reversen Transkription und PCR Verstärkung
   1. Fügen Sie auf 5' Adapter aufgespaltenen RNAs 1 μl 4 μM reversen Transkription Grundierung. Bei 70 ° C für 2 min inkubieren und sofort auf 4 ° c abkühlen lassen
   2. Fügen Sie 4 μl 5 X FS Puffer, 4 μL von 2,5 mM dNTP, 1 μl 0.1 M DVB-t, 1 μl RNase-Inhibitor und 1 μl Reverse Transkriptase. Bei 50 ° C für 1 h und 70 ° C für 15 min inkubieren.
   3. Bereiten Sie PCR Verstärkung
      1. Mix 1 μl RT-Produkt, 1 μl 25 μM RPI Grundierung 1 μl 25 μM RP1 Grundierung, 10 μl 5 x HF Puffer, 4 μL von 2,5 mM dNTP, 32.5 μl tdw und 0,5 μL der High Fidelity Polymerase.
      2. PCR-Programm für 11 ~ 13 Zyklen.
         Hinweis: Das Programm für die PCR ist: 98 ° C für 30 s für eine hot-Start, 98 ° C für 10 s, 60 ° C für 30 s und 72 ° C für 45 s zur Verstärkung und 72 ° C für 5 Minuten. Die Verstärkung Schritt ist für 11-13 Zyklen wiederholt.
   4. Bereinigen Sie die PCR-Produkte mit 40 μL der magnetischen Beads und folgende Schritte 3.1.3.1 zu 3.1.3.6, aber mit 10 μL tdw, um die DNA zu eluieren.
   5. Fügen Sie 2 μl 10 X DNA Loading Dye. Laden Sie die Probe auf einem 6 % Acrylamid-Gel und bei 200 V für 30 min laufen.
   6. Färben Sie mit Sybr Gold (0,01 % (V/V) in 1 X TBE-Puffer) für 5 min bei Raumtemperatur.
   7. De-Fleck in 1 X TBE Puffer für 5 min bei Raumtemperatur.
   8. Das Gel auf die ~ 200 – 700-Nukleotid-Region und brechen Sie das Gel.
   9. Fügen Sie 700 μl 0,3 M NaCl und Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur, die DNA zu eluieren.
   10. Laden Sie alles auf einer Spalte und Zentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit bei Raumtemperatur für 5 min.
   11. Übertragen Sie das Eluat in einem sauberen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Fügen Sie 1/10 Volumen von 3 M NaOAc, 0,5 μL des Coprecipitant und ein gleiches Volumen von Isopropanol. Inkubation über Nacht bei-20 ° C.
   12. Überstürzen sich DNA-Pellets und waschen mit 75 % Ethylalkohol wie 2.4.4 zu 2.4.5 beschrieben. Neu in 20 μL tdw auszusetzen.
   13. Analysieren Sie die Probe mit einem Sequenzer.

4. Analyse der PKR-Interaktion RNAs mittels qRT-PCR

1. Methode 1: Random Hexamer reversen Transkription
   1. Auszusetzen Sie RNA-Pellets aus Schritt 2.4.10 mit 8,5 μL tdw wieder und übertragen Sie die Lösung zu einem PCR-Schlauch.
   2. Fügen Sie 0,5 μL von 100 μM zufällige Hexamers und 4 μl 2,5 mM dNTP-Mix.
   3. Hitze der Lösung bei 65 ° C für 5 min und sofort inkubieren Sie für mindestens 1 min auf Eis.
   4. Machen die Reaktion mischen: 4 μL der 5 X SSIV-Puffer, 1 μL von 100 mM DVB-t, 1 μl RNase-Inhibitor und 1 μl Reverse Transkriptase (200 U/μl). Die RNA-Lösung die Reaktion-Mischung hinzufügen.
   5. Die Mischung bei 23 ° C für 10 min, 50 ° C für 10 min inkubieren und 80 ° C für 10 Minuten.
   6. Analysieren Sie die cDNA mit einer Echtzeit-PCR-System.
      Hinweis: Das Programm für die Real-Time PCR ist: 95 ° C für 3 min für hot-Start, 95 ° C für 5 s und 60 ° C für 10 s zur Verstärkung und 95 ° C für 30 s, 65 ° C für 30 s und 95 ° C für 30 s für die Schmelze. Die Verstärkung Schritt wird für 40 Zyklen wiederholt.
2. Methode 2: Strand-spezifische reversen Transkription
   1. Bereiten Sie einen master-Mix von reverse Primer: Mix gleiche Mengen von Gen spezifische reversen Transkription Primer mit CMV Promotorsequenz von ~ 20 Nukleotide von spezifischen Gensequenzen gefolgt.
      Hinweis: Die kombinierte Konzentration von allen gen spezifische RT Primer ist 4 μM.
   2. Auszusetzen Sie RNA-Pellets aus Schritt 2.4.10 mit 8,5 μL tdw wieder und übertragen Sie die Lösung zu einem PCR-Schlauch.
   3. Fügen Sie 0,5 μl 4 μM-master-Mix der reversen Transkription Primer und 4 μl 2,5 mM dNTP-Mix.
   4. Hitze der Lösung bei 65 ° C für 5 min und sofort inkubieren Sie für mindestens 1 min auf Eis.
   5. Bereiten Sie die Reaktionslösung durch das Mischen von 4 μL der 5 X SSIV-Puffer, 1 μL von 100 mM DVB-t, 1 μl RNase-Inhibitor und 1 μl Reverse Transkriptase (200 U/μl). Fügen Sie die Reaktionslösung in den RNA-Primer-Mix.
   6. Inkubieren Sie die Lösung bei 50 ° C für 10 min und 80 ° C für 10 min.
   7. Analysieren Sie die cDNA mit dem Echtzeit-PCR-System.
      Hinweis: Das Programm für die Real-Time PCR ist dieselbe wie in Methode 1 beschrieben.

Ein Schaltplan für den Prozess zu verhaften, HeLa-Zellen in der S oder M-Phase des Zellzyklus ist in Abbildung 1dargestellt. Für eine M-Phase verhaftet-Probe können wir eindeutig Runde geformte Zellen unter dem Mikroskop (Abbildung 2A) visualisieren. Um die Effizienz der Zellzyklus Festnahme zu untersuchen, kann die nukleare Inhalt der Zelle mit FACS (Abb. 2 b) analysiert werden. Abbildung 3 zeigt repräsentative Daten für Immunopräzipitation Effizienz-Test, wo der D7F7 Antikörper eine überlegene Fähigkeit, Immunoprecipitate PKR. Dieser Unterschied in der Immunopräzipitation Effizienz kann die Diskrepanz in der Klasse Verteilung der Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheken bereit, mit zwei verschiedenen PKR-Antikörpern (Abbildung 4) reflektiert worden, haben. Die Spezifität des Antikörpers D7F7 ist weiter mit ganzen westlichen Fleckanalyse PKR Immunoprecipitate (Abb. 5A) und die gesamte Zelle lysate (Abb. 5 b) bestätigt. Abbildung 6 zeigt das Radioisotop-Signal vor und nach der Entfernung der rRNAs bei Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung. Abbildung 7 zeigt die Anreicherung von MtRNAs in RNAs co-Immunoprecipitated mit PKR, aber nicht in RNAs co-Immunoprecipitated mit Kaninchen IgG oder DiGeorge-Syndrom chromosomalen Region 8 (DGCR8). Abbildung 8 zeigt die repräsentative Strang spezifische qRT-PCR-Analyse der PKR-gebundenen MtRNAs in S oder M-Phase verhaftet Proben.

Abbildung 1: schematische für die Vorbereitung Zellzyklus Festnahme Proben. (A, B) Schaltpläne der Vorbereitung des S (A) oder M (B) Phase verhaftet HeLa-Zellen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: Analyse des Zellzyklus verhaftet Proben. (A) Phase kontrastreiche Bilder von S oder M Phase verhaftet Proben. Balken zeigt 250 μm. (B) FACS-Analyse zeigt den nuklearen Inhalt der Proben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: Immunopräzipitation Effizienz-Test auf Antikörper PKR. Für erfolgreiche Bereicherung der PKR-gebundenen RNAs sollte ein Antikörper mit einem definitiven Immunopräzipitation Wirkungsgrad wie der D7F7-Antikörper verwendet werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4: RNA-Klasse Verteilung der Sequenzierung Bibliotheken mit verschiedenen PKR Antikörpern vorbereitet. Mit verschiedenen PKR Antikörpern für fCLIP resultierte in einer anderen Klasse Verteilung des zugeordneten Sequenzierung lautet. Die Diskrepanz ist wahrscheinlich auf die Unterschiede in der Effizienz Immunopräzipitation. Diese Zahl wurde von Kim Et Al.28geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5: Spezifität des Antikörpers D7F7 PKR. (A, B) Die ganze westliche Fleckanalyse PKR Immunoprecipitated (A) oder total HeLa lysate (B) zeigte nur ein starkes Band, entsprechend der Größe der PKR, darauf hinweist, dass der D7F7 Antikörper hochspezifisch PKR zu erkennen ist. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 6: Radioisotop Signal für PKR-co-Immunoprecipitated-RNAs. (A) PKR co-Immunoprecipitated RNAs konnte nachgewiesen werden, indem Sie ihren 5'-enden mit R-ATP beschriften. (B) Abnahme Radioistope Signals wurde auf rRNA Abwahl beobachtet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 7: Validierung von PKR-MtRNA Interaktionen. RNAs co-Immunoprecipitated mit angegebenen Antikörper2 Falte Bereicherung des MtRNAs anmelden. Nur die PKR co-Immunoprecipitated RNS-Probe zeigte starke Anreicherung von MtRNAs. Kaninchen-IgG und DGCR8 Antikörper dienten als Negativkontrollen. Diese Zahl wurde von Kim Et Al.28geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 8: Strang-spezifische qRT-PCR-Analyse von PKR-gebundenen MtRNAs. (A, B) Strang-spezifische reversen Transkription wurde verwendet, um die Strandedness des MtRNAs zu analysieren, die co-Immunoprecipitated mit PKR S (A) oder M (B) Phase verhaftet Zellen waren. Diese Zahl wurde von Kim Et Al.28geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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