Wir präsentieren experimentelle Ansätze für Studium RNA-Interaktoren des doppelsträngige RNA-bindende Proteinkinase RNA aktiviert (PKR) während des Säugetier-Zelle Zyklus mit HeLa-Zellen. Diese Methode nutzt Formaldehyd Crosslink RNA-PKR-komplexe und Immunopräzipitation PKR-gebundenen RNAs zu bereichern. Diese RNAs können weiter durch Hochdurchsatz-Sequenzierung oder qRT-PCR analysiert werden.
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Methodenartikel
Studium der RNA Interaktoren des RNA während der Säugetier-Zelle Zyklus aktiviert Proteinkinase
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Proteinkinase RNA aktiviert (PKR) ist ein Mitglied der angeborenen Immunantwort Proteine und erkennt die doppelsträngige Sekundärstruktur des viralen RNAs. Wenn virale doppelsträngige RNA (DsRNAs) verpflichtet, PKR Dimerisierung und anschließende Autophosphorylation erfährt. Phosphorylierten PKR (pPKR) wird aktiviert und induziert Phosphorylierung von der alpha-Untereinheit eukaryotic Initiation Factor 2 (eIF2α), globale Übersetzung zu unterdrücken. Erhöhung der Beweis schlägt vor, dass PKR unter physiologischen Bedingungen wie z. B. während des Zellzyklus oder unter verschiedenen Stressbedingungen ohne Infektion aktiviert werden kann. Unser Verständnis von der RNA-Aktivatoren von PKR ist jedoch aufgrund des Fehlens einer standardisierten experimentellen Methode zu erfassen und analysieren von PKR-wechselwirkenden DsRNAs beschränkt. Hier präsentieren wir ein experimentelles Protokoll gezielt anreichern und analysieren PKR gebunden RNAs während des Zellzyklus mit HeLa-Zellen. Wir nutzen die effiziente Vernetzung Aktivität von Formaldehyd zu PKR-RNA-komplexe zu beheben und über Immunopräzipitation zu isolieren. PKR-co-Immunoprecipitated-RNAs können dann weiterverarbeitet werden, um eine Bibliothek von Hochdurchsatz-Sequenzierung zu generieren. Eine wichtige Klasse von zellulären DsRNAs PKR-Interaktion ist mitochondriale RNAs (MtRNAs), die als intermolekulare DsRNAs durch ergänzende Zusammenspiel von Heavy-Strang und die Licht-Strang-RNA bestehen können. Um die Strandedness der dieser duplex MtRNAs zu untersuchen, stellen wir Ihnen auch ein Protokoll für Strang-spezifische qRT-PCR. Unser Protokoll ist für die Analyse von PKR-gebundenen RNAs optimiert, aber es kann leicht geändert werden, um zelluläre DsRNAs oder RNA-Interaktoren des anderen DsRNA-bindende Proteine zu studieren.
Einleitung
Proteinkinase RNA aktiviert (PKR), auch bekannt als eukaryotic Initiation Faktor 2-Alpha Kinase 2 (EIF2AK2), ist ein gut charakterisierten Proteinkinase, die Informationen von RNAs überträgt. Es gehört zu den eukaryotic Übersetzung Einleitung 2 Untereinheit Alpha (eIF2α) Kinase Familie und phosphorylates eIF2α bei Serin 51 in Reaktion auf eine Infektion, globale Übersetzung1zu unterdrücken. In diesem Zusammenhang ist PKR durch virale doppelsträngige RNA (DsRNAs), aktiviert, die eine Plattform für PKR Dimerisierung und Autophosphorylation2zur Verfügung zu stellen. Neben eIF2α kann PKR auch c-Jun N-Terminal Kinase (JNK), T....
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Protokoll
1. Lösung und Handy Vorbereitung
- Vorbereitung der Lösung
- Das Zellkulturmedium Vorbereitung Medium für HeLa Zellkultur durch Zugabe von 50 mL der fetalen bovine Serum (FBS), 500 mL von Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM).
Hinweis: Antibiotika können das Zellkulturmedium hinzugefügt werden, aber wir verwenden keine Antibiotika. - Die 0,1 % Paraformaldehyd, lösen sich in 4 % (w/V) Paraformaldehyd in 1 x Phosphate-Buffered Kochsalzlösung (PBS) mit Heizung auf einer heißen Platte und verdünnte, 30 mL 0,1 % (V/V) Paraformaldehyd durch Zugabe von 1 X PBS zu machen.
Achtung: Führen Sie alle Schritte in einer Dampfhaube und achten Sie darauf....
- Das Zellkulturmedium Vorbereitung Medium für HeLa Zellkultur durch Zugabe von 50 mL der fetalen bovine Serum (FBS), 500 mL von Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM).
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Ergebnisse
Ein Schaltplan für den Prozess zu verhaften, HeLa-Zellen in der S oder M-Phase des Zellzyklus ist in Abbildung 1dargestellt. Für eine M-Phase verhaftet-Probe können wir eindeutig Runde geformte Zellen unter dem Mikroskop (Abbildung 2A) visualisieren. Um die Effizienz der Zellzyklus Festnahme zu untersuchen, kann die nukleare Inhalt der Zelle mit FACS (Abb. 2 b) analysiert werden. Abbildung 3 zeigt repräsentative Daten für.......
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Diskussion
Der Prozess, S oder M Phase verhaftet Proben vorzubereiten ist in Abbildung 1dargestellt. Um Zellen in der S-Phase zu verhaften, verwendeten wir eine Thymidin-Doppelblock-Methode wo wir behandelten Zellen mit Thymidin zweimal mit einem 9 h Release dazwischen zu hohen Verhaftung Effizienz (Abbildung 1A). Für M-Phase-Verhaftung, behandelten wir Zellen einmal mit Thymidin gefolgt von einem Release 9 h und dann Nocodazole auf Block-Zellen bei prometaphase (
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch grundlegende Wissenschaft Forschungsprogramm durch die National Research Foundation von Korea (NRF) finanziert durch die koreanische Regierung Ministerium für Wissenschaft und IKT (NRF-2016R1C1B2009886) unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,5 M EDTA, pH 8,0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| 1 M Tris, pH 7,0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1 M Tris, pH 8,0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen | Axygen | MCT-175-C | |
| 10% Nonidet-p40 (NP-40) | Biosolution | BN015 | |
| 10X DNA-Ladepuffer | TaKaRa | 9157 | |
| 15 mL konisches Röhrchen | SPL | 50015 | |
| 3' Adapter | 5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3'3 | ||
| M Natriumacetat pH 5,5 | Thermo Fisher Scientific | AM9740 | |
| 5' Adapter | 5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3' | ||
| 5 M NaCl | Thermo Fisher Scientific | AM9760G | |
| 50 mL konisches Röhrchen | SPL | 50050 | |
| Säure-Phenol-Chloroform, pH 4,5 | Thermo Fisher Scientific | AM9722 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetische Kügelchen DNA/RNA reinigen |
| die alkalische Phosphatase der Antarktis | New England Biolabs | M0289S | |
| Anti-DGCR8 | Made in house | ||
| Anti-PKR (D7F7) | Zellsignaltechnologie | 12297S | |
| Anti-PKR (Milli) | Millipore EMD | 07-151 | |
| ATP (100 mM) | GE Healthcare | GE27-2056-01 | |
| Bromphenolblau-Natriumsalz | Sigma-aldrich | B5525 | |
| alkalische Phosphatase | im KälberdarmTaKaRa | 2250A | |
| Zellschaber 25 cm 2 Positionen | Sarstedt | 83.183 | |
| CMV-Promotorsequenz | 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'Dulbecco's | ||
| modifiziertes Adlermedium | Welgene | LM001-05 | |
| dNTP-Gemisch (2,5 mM) | TaKaRa | 4030 | |
| Ethanol, Absolut, ACS-Qualität | Alfa-Aesar | A9951 | |
| Fötales Rinderserum | Merck | M-TMS-013-BKR | |
| Formamid | Merck | 104008 | |
| Glycin | Bio-basic | GB0235 | |
| GlycoBlue Copräzipitant (15 mg/ml) | Thermo Fisher Scientific | AM9516 | |
| Isopropanol | Merck | 8.18766.1000 | |
| NEBNext rRNA Depletion Kit | New England Biolabs | E6318 | rRNA-Depletionskit |
| Nocodazol | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| Kaninchen-IgG-Zellsignalisierungstechnologie | 2729S | ||
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | 6148 | |
| PCR Forward Primer (RP1) | 5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3' | ||
| PCR-Index Reverse Primer (RPI)5 | '-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3'PCR-Röhrchen | ||
| mit flacher Kappe, 0,2 mL | Axygen | PCR-02-C | |
| Phosphat-Bufered Kochsalzlösung (PBS) Tablette | TaKaRa | T9181 | |
| Phusion High-Fidelity-DNA-Polymerase | New England Biolabs | M0530 | High-Fidelity-Polymerase |
| PlateFuge Mikrozentrifuge mit Ausschwingrotor | Benchmark | c2000 | |
| Polynukleotidkinase (PNK) | TaKaRa | 2021A | |
| Proteinase K, rekombinant, PCR | Grade Sigma-Aldrich | 3115879001 | |
| qPCR Primersequenz: CO1 Heavy | Vorwärts/Rückwärts: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR-Primersequenz: CO1 Licht | Vorwärts/Rückwärts: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR-Primersequenz: CO2 Heavy | Vorwärts/Rückwärts: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR-Primersequenz: CO2 Licht | Vorwärts/Rückwärts: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR-Primersequenz: CO3 Heavy | Vorwärts/Rückwärts: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR-Primersequenz: CO3 Licht | Vorwärts/Rückwärts: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR-Primersequenz: CYTB Heavy | Vorwärts/Rückwärts: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR-Primersequenz: CYTB Light | Vorwärts/Rückwärts: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR-Primersequenz: GAPDH | Vorwärts/Rückwärts: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR-Primersequenz: ND1 Heavy | Vorwärts/Rückwärts: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR-Primersequenz: ND1 Licht | Vorwärts/Rückwärts: 5′-GTTGTGATAAGGGGGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR-Primersequenz: ND4 Heavy | Vorwärts/Rückwärts: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR-Primersequenz: ND4 Licht | Vorwärts/Rückwärts: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR-Primersequenz: ND5 Heavy | Vorwärts/Rückwärts: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR-Primersequenz: ND5 Licht | Vorwärts/Rückwärts: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR-Primersequenz: ND6 Heavy | Vorwärts/Rückwärts: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR-Primersequenz: ND6 Licht | Vorwärts/Rückwärts: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Zufälliges Hexamer | Thermo Fisher Scientific | SO142 | |
| Rekombinante Dnase I (Rnase-frei) (5 U/μ L) | TaKaRa | 2270A | |
| Rekombinanter RNASE-Inhibitor (40 U/μ L) | TaKaRa | 2313A | |
| Ribo-Zero rRNA Removal Kit | Illumina | MRZH116 | rRNA Removal Kit |
| Rotator | FINEPCR, ROTATOR AG | D1.5-32 | |
| RT Primer Sequenz: CO1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGGTGTGTGAGGTTGCGGTCTGTGTTAG-3′ | ||
| RT-Primer-Sequenz: CO1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′ | ||
| RT-Primer-Sequenz: CO2 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGGGGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′ | ||
| RT-Primer-Sequenz: CO2 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′ | ||
| RT-Primer-Sequenz: CO3 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′ | ||
| RT-Primer-Sequenz: CO3 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′ | ||
| RT-Primer-Sequenz: CYTB Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′ | ||
| RT-Primer-Sequenz: CYTB Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′ | ||
| RT-Primer-Sequenz: GAPDH | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′ | ||
| RT-Primer-Sequenz: ND1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGGGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′ | ||
| RT-Primer-Sequenz: ND1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′ | ||
| RT-Primer-Sequenz: ND4 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′ | ||
| RT-Primer-Sequenz: ND4 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′ | ||
| RT-Primer-Sequenz: ND5 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTTTGGGTGAGGTGATG-3′ | ||
| RT-Primer-Sequenz: ND5 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′ | ||
| RT-Primer-Sequenz: ND6 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGGGGTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′ | ||
| RT-Primer-Sequenz: ND6 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′ | ||
| Silikonisiertes Polypropylen 1,5 mL G-Röhrchen | Bio Plas | 4167SLS50 | |
| Natriumdedecylsulfat | Biosesang | S1010 | |
| Natriumdesoxycholat | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SUPERase In Rnase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | AM2694 | |
| SuperScript III reverse Transkriptase | Thermo Fisher Scientific | 18080093 | Reverse Transkriptase für die Bibliotheksvorbereitung |
| SuperScript IV reverse Transkriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | Reverse Transkriptase für qRT-PCR |
| SYBR Gold-Nukleinsäure gl-Färbung | Thermo Fisher Scientific | S11494 | |
| T4 Polynukleotidkinase | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 RNA-Ligase 1 (ssRNA-Ligase) | New England Biolabs | M0204 | |
| T4 RNA-Ligase 2, verkürzt KQ | New England Biolabs | M0373 | |
| Thermomixer | Eppendorf ThermoMixer C mit ThermoTop | ||
| Thymidin | Sigma-Aldrich | T9250 | |
| Tris-Borat-EDTA-Puffer (TBE) | TaKara | T9122 | |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | |
| Ultralink Protein A Sepharosekügelchen | Thermo Fisher Scientific | 22810 | Protein A Kügelchen |
| Ultraschallgerät | Bioruptor | ||
| Urea | Bio-basic | UB0148 | |
| Vortex-Mischer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Xylolcyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| γ-32P-ATP (10 μ Ci/μ L, 3,3 μ M) | PerkinElmer | BLU502A100UC |
Referenzen
- Meurs, E. F., et al. Constitutive expression of human double-stranded RNA-activated p68 kinase in murine cells mediates phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 and partial resistance to encephalomyocarditis virus growth. Journal of Virology. 66 (10), 5805-5814 (1992).
- Patel, R. C., Stanton, P., McMil....
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Nachdrucke und Genehmigungen
