Methodenartikel

Ein menschliches Blut-Hirn-Schnittstellenmodell Barriere Kreuzungen durch Krankheitserreger oder Medikamente und ihre Wechselwirkungen mit dem Gehirn zu studieren

DOI:

10.3791/59220

⸱

9. April 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut Pasteur, CNRS UMR 3569, Unité de Neuroimmunologie Virale, 2Institut Pasteur, Unité d’Epidémiologie et de Pathophysiologie des Virus Oncogènes, Université Sorbonne Paris Cité/Paris Diderot, 3Institut Pasteur, PFIA, DTPS

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier stellen wir Ihnen ein Protokoll beschreibt die Einstellung einer in Cellulo BBB (Blut-Hirn-Schranke)-Minibrain aus Polyester poröse Membran Kultur einfügen System um den Transport von Biomolekülen oder infektiöse Erreger über eine menschliche BBB zu bewerten und ihre physiologische Wirkung auf die benachbarten Gehirnzellen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die frühen screening Nervensystem Medikamente auf eine sachdienliche und zuverlässig in Cellulo BBB Modell für ihre Verbreitung und ihre Wechselwirkung mit der Barriere und die Anwesenheit von besteht noch ein ungedeckter Bedarf. Um diese Lücke zu füllen, entwarfen wir ein 2D in Cellulo Modell, die BBB-Minibrain, durch die Kombination einer Polyesters poröse Membran Kultur einfügen BBB Menschmodell mit einer Minibrain von einer Tri-Kultur der menschlichen Gehirnzellen (Neuronen, Astrozyten und Mikroglia-Zellen) gebildet. Die BBB-Minibrain erlaubt uns, testen Sie den Transport von eine neuroprotektive Arzneimittelkandidat (z. B. Neurovita), durch die BBB, bestimmen die spezifische Ausrichtung dieses Moleküls zu Neuronen und zu zeigen, dass die neuroprotektive Eigenschaft des Medikaments nach erhalten blieb das Medikament hatte die BBB überschritten. Wir haben auch gezeigt, dass BBB-Minibrain ein interessantes Modell stellt, im Laufe der Viruspartikel durch die Endothelzellen Schranke zu erkennen und die Infektion der Minibrain durch Neuroinvasive Viruspartikel zu überwachen. Die BBB-Minibrain ist ein zuverlässiges System, einfach zu handhaben für Forscher ausgebildet in Zellkulturtechnik und prädiktiv für die Gehirn-Zellen-Phänotypen nach Behandlung oder Beleidigung. Das Interesse eines solchen Cellulo testen wäre zweierlei: Einführung von Konzentrationsrisiken Schritte schon früh in der Entwicklung von Medikamenten auf der einen Seite und Verringerung des Einsatzes von Tierversuchen auf der anderen Seite.

Einleitung

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Das Gehirn wird von den Körperkreislauf durch eine nicht-durchlässigen Struktur getrennt, die den Austausch zwischen der Anwesenheit und das Blut, die Blut - Hirn-Schranke (BBB) genannt einschränkt. Meist bestehend aus zerebralen Endothelzellen, interagiert die BBB dynamisch mit perivaskuläre Mikroglia, Astrozyten und Neuronen in Anwesenheit von den benachbarten. Die drei Hauptfunktionen der BBB sind die Erstellung und Pflege der Ionischen Homöostase für neuronale Funktionen, Versorgung des Gehirns mit Nährstoffen und Schutz vor toxischen Verletzungen oder Eintrag von Krankheitserregern1,2, die dazu beitragen die Aufrechterhaltung der Homöostase des Gehirns und seiner Funktionen3. Diese Barriere ist so effizient, dass nur wenige Medikamente die BBB4,5überqueren können. Derzeit bestehen die verfügbaren Methoden vorhersagen, ob ein Molekül die BBB passieren und in das Gehirn diffundieren von ex-Vivo-Studien auf Autopsie, Bild Materialverfolgung in das Gehirn der Probanden mittels MRT (Magnet-Resonanz-Tomographie) oder PET (Position emission Tomographie) oder Pharmakodynamik und pharmakokinetischen präklinischen Studien im Tiere6,7,-8. Diese Techniken und Modelle haben einige Einschränkungen, z. B. der begrenzten Auflösung der PET und die geringe Sensitivität der MRT6,8, die Schwierigkeit zu Molekülen (z. B. basierend Antikörpermoleküle zum Beispiel) so schlecht quantifizieren dringen Sie die Gehirn-7, und für die präklinische Studien Sie, ihre hohen Kosten und Resort von Tierversuchen.

Der letzte Punkt ist wichtig, weil nach der 3R Regeln, (Ersatz, Reduktion und Verfeinerung von Tierversuchen) die regulatorischen Behörden gebeten haben, entwickeln die Forscher dringend wissenschaftlich präzise Alternative zum Tier Experiment9,10,11,12,13,14,15.

In den letzten Jahrzehnten mehrere in-vitro-Modelle von BBB vorgeschlagen wurden16,17,18 durch den Anbau auf Filter Membran fügt Endothelzellen aus verschiedenen Arten wie Maus, Ratte, Rind und Schwein. Der menschlichen Spezies angeht, die knappe und schwere Verfügbarkeit von Primärzellen aufgefordert die Forscher menschliche Modelle basierend auf verewigt Gehirn endothelial Zellen oder menschliche Stammzellen19,20zu entwickeln, 21. Diese Barrieren sind richtige in-vitro-Surrogate von BBB, vorausgesetzt, dass sie Endothelzellen Marker, engen Kreuzung Marker, Efflux-Transporter, Solute Carrier, Rezeptoren ausdrücken, und reagieren auf die endotheliale Reize 20. Ein paar BBB-Modelle mit Membran Filtereinsätze beschichtet mit Endothelzellen und anderen Zelltypen (z.B. Astrozyten, Neuronen oder Perizyten22,23,24) wurden untersucht. Das Ziel dieser Co Kulturen war die BBB physikalischen Eigenschaften zu erhöhen, indem unter Ausnutzung der Sekretion der lösliche Faktoren von Astrozyten/Neuronen oder Perizyten.

Dennoch enthält keines dieser Modelle in Anwesenheit von zu studieren und das Schicksal der ein Arzneimittelkandidat vorherzusagen, sobald es die Barriere bestanden hat. Daher unser Ziel bestand darin, eine in Cellulo bauen Blut/Hirn-Schnittstelle, die BBB-Minibrain, durch die Kombination ein BBB-Modell und eine Kultur der gemischten Gehirnzellen in einem einzigen Kit. Die BBB-Minibrain verwendet ein Kultursystem bestehend aus einem porösen Filter in einen Brunnen von einem multiwell Zellplatte Kultur eingefügt. Der Filter ist mit hCMEC/D3 Zellen eines menschlichen Gehirns Endothelzellen Linie beschichtet, die hochzuverlässige für BBB Drogentests25,26,27, bilden die BBB nachgewiesen worden ist. Die Minibrain ist ein Co differenzierte Kultur der menschlichen Neuronen und Astrozyten, abgeleitet vom NTera/Cl2.D1 Zelle Zeile28,29 gemischt zusammen mit der menschlichen Mikroglia-Zell-Linie CHME/Cl530 im Verhältnis entspricht der Mikroglia vs. Neuron-Astrozyten Verhältnisse der Gehirn-31ist in der Unterseite der Platte gut kultiviert.

Neben dem Studium Durchgang von Drogen über die BBB und ihr Schicksal in das Parenchym, könnte die Blut-Hirn-Schnittstelle in Cellulo Modell ein mächtiges Werkzeug, um den Eintrag von Krankheitserregern in das Gehirn (Neuroinvasiveness), die Dispersion ins Gehirn (Neurotropism) Adresse und die Toxizität (Neurovirulence), die sie auf Gehirn Parenchymzellen ausüben können. Neurovirulence und Neuroinvasiveness Studien würde profitieren von der Entwicklung eines effizienten Cellulo Modell und vorteilhaft sein, Tiermodellen zu ersetzen. Mit der BBB-Minibrain Kit32, wir bewiesen Neuroinvasive Phänotyp selten viral Mutanten, die angesammelt in French Neurotropic Virus-Stamm des Gelbfieber-Virus (z.B. FNV-YFV33,34) zur Vorbereitung einer Lebendimpfstoff YFV und den Durchgang von einem neurogenerative und neuroprotektive Biomolekül genannt Neurovita (bezeichnet als NV fortan im Manuskript)35eingestellt. Da NV weder kreuzt natürlich die Zellmembran noch die BBB, NV wurde eine einzelne Kette Antikörpers von Lamas, die Kreuze der biologischen Membranen, einschließlich der BBB und fungiert als eine Zelle eindringen Molekül (CPM)36mit der Variable Teil (LHKW) verschmolzen. Die CPM-Eigenschaft des FHKW scheint der isoelektrischen Punkt und die Länge der LHKW37abhängen.

In diesem Cellulo Test sollen es ermöglichen, die Moleküle zu sortieren, die potenziell die BBB vor Durchführung der pharmakokinetischen und Pharmakodynamik Analyse bei Tieren, und im Idealfall in der gleichen Zeit in der Lage sein, ihr Verhalten in der nervösen vorherzusagen kreuzen könnte Parenchym. Dieses System ist biologisch relevante und einfach einrichten und verarbeiten von Fachleuten gut ausgebildet in Zelle Kultur26,29,30,38. Das Interesse eines solchen Cellulo testen wäre zweifach: Reduzierung der Kosten der präklinischen Tests auf der einen Seite und Verringerung des Einsatzes von Tierversuchen auf der anderen Seite.

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Protokoll

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(1) Zelle Kultur Arbeit der Ntera/CL2. D1 zur Vorbereitung einer Kokultur Post-mitotische hNeurons und hAstrocytes (NT2-n/a)

Hinweis: Dies ist die Komponente des Minibrain (Abbildung 1).

  1. Kultivierung der Ntera/Cl2.D1
    1. Entfernen Sie ein Fläschchen mit gefrorenen Zellen aus flüssigem Stickstoff-Tank. Halten Sie auf dem Eis.
    2. Auftauen der Zellen schnell in einem 37 ° C-Wasserbad.
    3. Die Zellen in einer 15 mL Tube mit 10 mL der kompletten DMEM-F12 Medium zu übertragen (Dulbeccos geändert Eagle Medium: Nährstoff-Mischung f-12 Medium) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 2 mM Glutamin, 100 IE Penicillin und 100 µg Streptomycin ergänzt (d.h., vollständig DMEM-F12-Medium).
    4. Zentrifugieren Sie bei 200 X g für 5 min bei Raumtemperatur (RT). Das Pellet in 2 mL des kompletten DMEM-F12 Medium zu distanzieren.
    5. In einem T75 Gewebekultur Kolben aus Polystyrol mit spezifischen Behandlung für sensible adhärente Zellen übertragen (T75Cell+), enthält 13 mL des kompletten DMEM-F12 Medium.
    6. Kulturzellen im Brutschrank bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit bis 90 % Zusammenfluss beibehalten (d. h. ca. 5 Tage). Verändern Sie alle 2-3 Tage Medium.
  2. Subkultivieren Ntera/Cl2.D1 und Verstärkung
    1. Entfernen Sie das Medium aus der Flasche.
    2. Spülen Sie die Zelle monomolekularen Film mit 10 mL von Phosphat Puffer Kochsalzlösung (PBS) mit Ca2 + und Mg2 +ergänzt.
    3. Spülen Sie die Zelle monomolekularen Film mit 10 mL EDTA-Lösung (bei RT gehalten).
    4. 3 mL Trypsin-EDTA-Lösung (0,05 % Trypsin, 0,02 % EDTA) zugeben und 2 min bei RT inkubieren
    5. Schütteln Sie die Flasche und stellen Sie sicher, dass die Zellen von der Kunststoffoberfläche getrennt sind.
    6. Fügen Sie 10 mL des kompletten DMEM-F12 Medium inaktivieren die Trypsin, transfer in einem 15 mL-Tube und Zentrifuge für 5 min bei 200 X g bei RT
    7. Distanzieren Sie das Pellet mit 10 mL der kompletten Medium und verwenden Sie 1 mL zu, um jede neue Flasche mit 14 mL des kompletten DMEM-F12 Medium zu impfen.
      Hinweis: Dreißig T75 Zelle+ -Flaschen sind für jede Differenzierung erforderlich.
    8. Inkubieren Sie die Fläschchen bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit bis 90 % Zusammenfluss.
  3. Differenzierung von NTera/Cl2.D1 in menschlichen Neuron-Astrozyten Kokultur
    Hinweis: Dies ist die wichtigste Komponente der Minibrain.
    1. Am Tag 0 Zellen mit Trypsin-EDTA, wie unter Punkt 1.2 beschrieben distanzieren und die Zelle Pellet von jedem Kolben mit 2 mL des kompletten DMEM-F12 Medium zu distanzieren.
    2. Fügen Sie 1 mL Zellsuspension (entspricht 5 x 106 Zellen) in 60 Kunststoff Petrischalen mit 85 mm Durchmesser, enthält 11 mL des kompletten DMEM-F12 Medium.
      Hinweis: Die Zellen werden der Kunststoff nicht befestigen und werden zu aggregieren, Form-Pseudo-Neurosphären (siehe Foto im unteren Bereich der Abbildung 1). Eines Tages inkubieren Sie der 60 Petrischalen bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit.
    3. Am 1. Tag fügen Sie 1 mL der kompletten DMEM-F12 Medium ergänzt mit 130 µM von All-Trans-Retinsäure (ATRA) pro Petrischale (Endkonzentration ATRA 10 µM) und die Gerichte bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit für 24 h zurück.
    4. Am Tag2 übertragen Sie sehr sorgfältig Zelle Sphären der einzelnen Petri Dish in einer 50 mL-Tube und Zentrifuge für 10 min bei 50 X g und RT. LG Lose Pellets mit 13 mL des kompletten DMEM-F12 Medium ergänzt mit 10 µM ATRA sorgfältig-haltigem Medium geben Sie und th e 13 mL in einen neuen 85 mm Durchmesser Petrischale.
      Hinweis: Über die verschiedenen Passagen ist es extrem wichtig, die Kugeln Dichte so hoch wie die Dichte am Tag2 (d. h. um eine Dichte von 70 %) erhalten. Die Dichte der Kugel zu senken ist, verringert sich die Gesamtzahl der Petrischalen nach der Anzahl der Zellen.
    5. Wiederholen Sie das oben beschriebene Verfahren (Schritt 1.3.4) Tage, 4, 6 und 8.
    6. Am 10. Tag wiederholen Sie das oben beschriebene Verfahren aber T75 Zelle+ Flaschen statt Petrischalen fügen Sie die Kugeln hinzu. Die Zellen in einem T75 Zelle+ Kolben aus einer Petrischale hinzufügen.
    7. Tage 11, 13, 15 und 17, ändern Sie das eingesetzte Medium mit 14 mL komplette DMEM-F12 mit 10 µM ATRA ergänzt.
    8. Am Tag 19 verändern Sie Medium mit kompletten DMEM-F12-Medium ohne ATRA pro Flasche 14 mL.
    9. Am Tag 20 distanzieren Sie die Zellen mit Trypsin/EDTA sanft wie folgt.
      1. Spülen Sie für jede T75 Zelle+ -Kolben die Zellen mit 10 mL PBS mit Ca2 + und Mg2 +ergänzt; inkubieren Sie die Zellen mit 4 mL EDTA für 5 min bei RT
      2. Entfernen Sie vorsichtig die EDTA und fügen Sie 2 mL Trypsin-EDTA und inkubieren Sie 7 min bei RT. Shake sehr vorsichtig die Flasche und sorgfältig 8 mL komplette DMEM-F12 Medium.
      3. Zentrifuge 10 min bei 160 x g und RT distanzieren die Zelle Pellet in 13 mL komplette DMEM-F12 Medium und Transfer in ein Auffanggefäß T75 Zelle+ .
        Hinweis: Die sehr sanfte Spaltung mit Trypsin-EDTA ermöglicht Wiederherstellung der ATRA differenzierten Zellen aus den ursprünglichen Teratocarcinoma Zellen, die stark an die Kunststoff-Ware angebracht werden.
    10. Am Tag 21 entfernen Sie das Medium und die abgestorbenen Zellen. Fügen Sie 14 mL des kompletten DMEM-F12 Medium ergänzt mit 5 % FBS, 2 mM Glutamin, 100 IE Penicillin, 100 µg Streptomycin und 0,5 µM von AraC (Cytosin β-D-Arabinofuranoside) (komplette 5 % FBS DMEM-F12-AraC).
    11. Bei Tage 23, 25 und 28, verwendet ersetzen Medium mit 14 mL 5 % FBS DMEM-F12-AraC.
    12. Am Tage 29 bis 49 (alle zwei Tage), verwendet ersetzen Medium mit 14 mL des kompletten DMEM-F12-Medium mit 5 % fötalen Rinderserum, 2 mM Glutamin, 100 IE Penicillin, 100 µg Streptomycin, 5 µM von FudR (5-Fluoro-2' Deoxyuridine) und 10 µM ergänzt Urd (Uridin) (5 % abgeschlossen FBS DMEM F12-FudR-Urd).
    13. Am Tag 50, ersetzen verwendet Medium mit 14 mL des kompletten DMEM-F12-Medium mit 5 % FBS, 2 mM Glutamin, 100 IE Penicillin, ergänzt 100 µg Streptomycin und 10 µM Urd (komplette 5 % FBS DMEM-F12-Urd).
    14. Am Tage 51 bis zu 95 (zweimal wöchentlich), verwendet ersetzen Medium mit 14 mL komplett 5 % FBS DMEM-F12-Urd.
      Hinweis: Zellen können von 51. Tag für Experimente verwendet aber nicht später als Tag 95 sein. Die Verwendung von seriellen Behandlungen mit Mitose Inhibitoren ermöglicht Rückgewinnung reinen Bevölkerung von Kokulturen von Post-mitotische hNeuron und hAstrocytes (NT2-n/a).
    15. Um die Zellen zu Saatgut, mit sanften Trypsinization wie für Tag 20 beschrieben vorgehen.

(2) Zelle Kultur Arbeit der menschlichen Microglial Zellen CHME/Cl5

Hinweis: Dies ist der Mikroglia Bestandteil der Minibrain (Abbildung 1).

  1. Kultivierung der menschlichen Microglial Zellen CHME/Cl5
    1. Entfernen Sie ein Fläschchen mit gefrorenen Zellen aus dem flüssigen Stickstoff-Tank. Halten Sie auf dem Eis.
    2. Tauen Sie schnell im Wasserbad 37 ° C auf.
    3. Übertragen Sie die Zellen in einer 15 mL Tube mit 10 mL der kompletten DMEM-F12-Medium mit 5 % fötalen Rinderserum, 2 mM Glutamin, 100 IE Penicillin und 100 µg Streptomycin (d.h. komplette 5 % FBS DMEM-F12 Medium) ergänzt.
    4. Zentrifugieren Sie bei 200 X g für 5 min bei RT. LG das Pellet mit 2 mL des kompletten 5 % FBS DMEM-F12 Medium.
    5. In einem T75 Zelle+ -Kolben mit 13 mL komplett 5 % FBS DMEM-F12 Medium übertragen.
    6. Zellkulturen bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit bis 90 % Zusammenfluss. Verändern Sie alle 2-3 Tage Medium.
  2. Subkultivieren der menschlichen Mikroglia-Zellen CHME/Cl5
    1. Medium aus der Flasche zu entfernen.
    2. Spülen Sie die Zelle monomolekularen Film mit 10 mL PBS mit Ca2 + und Mg2 +ergänzt.
    3. Spülen Sie die Zelle monomolekularen Film mit 10 mL EDTA-Lösung (bei RT gehalten).
    4. 3 mL Trypsin-EDTA-Lösung zugeben und 2 min bei RT inkubieren
    5. Schütteln Sie die Flasche und stellen Sie sicher, dass die Zellen von der Kunststoffoberfläche getrennt sind.
    6. Fügen Sie 10 mL der kompletten 5 % FBS DMEM-F12 Medium inaktivieren die Trypsin, transfer in einem 15 mL-Tube und Zentrifuge für 5 min bei 200 x g und RT.
    7. Distanzieren Sie das Pellet mit 10 mL der kompletten Medium und verwenden Sie 1 mL zu, um jede neue Flasche mit 14 mL komplett 5 % FBS DMEM-F12 Medium zu impfen.
    8. Inkubieren Sie die Fläschchen bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit bis 90 % Zusammenfluss.

3. Kultur-Arbeit mit der hCMEC/D3 Mantel porös Einsätze und BBB vorbereiten

  1. Kultivierung der menschlichen Endothelzellen hCMEC/D3 (Abbildung 2)
    1. Verdünnen Sie den Typ ich Ratte Kollagen um 01:30 mit reinen sterilem Wasser (Zelle Kultur Klasse).
    2. 10 mL in einem T75 Zelle+ Kolben übertragen und 2 h bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit Inkubator inkubieren.
    3. Entfernen Sie die Kollagen-Lösung und ersetzen Sie es mit 15 mL Endothelzellen Medium mit 10 mM HEPES (bezeichnet als komplette Endothelzellen Medium) ergänzt.
    4. Ein Kryo-Fläschchen mit Zellen aus dem flüssigen Stickstoff-Tank zu entfernen. Halten Sie auf dem Eis.
      Hinweis: Die Zellen wurden angebaut, und viel Samen gemacht wurde, wie vom Hersteller beschrieben. Die Zell-Linie wird durch eine biologische Werkstoffübergang Vereinbarung abgedeckt. Die Zellen werden Passage Hausnummer 25 gewonnen und sollte nicht weiter als Durchgang 35 verwendet werden.
    5. Tauen Sie schnell im Wasserbad 37 ° C auf.
    6. Die Zellen in der Zelle T75+ Kolben übertragen und den Kolben bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit für 2 bis 4 h zurück.
    7. Entfernen Sie vorsichtig das Medium ohne zu verlieren oder Zellen entfernt. Spülen Sie die Zellen einmal mit 10 mL der komplette Endothelzellen Medium.
    8. 15 mL komplette Endothelzellen Medium hinzugeben.
    9. Zellkulturen bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit bis 100 % Zusammenfluss (nicht weniger als 4 Tage) ohne Ändern des Mediums.
  2. Subkultivieren hCMEC/D3 um den Einsatz der BBB vorzubereiten
    1. Einen neuen T75 Zelle+ Kolben Beschichten oder fügt mit dem Typ ich Ratte Kollagen wie beschrieben (Schritt 3.1).
    2. Entfernen Sie das Medium aus der Flasche. Spülen Sie die Zelle monomolekularen Film mit 10 mL PBS mit Ca2 + und Mg2 +ergänzt.
    3. 2 mL Trypsin-EDTA-Lösung zugeben und 5 min bei 37 ° c inkubieren
    4. Schütteln Sie die Flasche und stellen Sie sicher, dass die Zellen vollständig losgelöst von der Kunststoffoberfläche.
    5. Fügen Sie 4 mL komplette Endothelzellen Medium, die Trypsin zu inaktivieren.
    6. Mit einer 5 mL-Kunststoff-Pipette mechanisch distanzieren Sie die Zellen durch Absaugen und spülen die Zellsuspension gleichzeitig 5-mL-Pipette auf den Boden der Flasche mindestens 5 Mal.
    7. Zählen der Zellen und Verwendung 5 x 104 Zellen/Insert für eine 12 gut Polyester Membran Kultur fügt einfügen und 2 x 106 Zellen für eine Flasche T75 Zelle+ . Auch drei Filter ohne Zellen für die PELy (d. h. Endothelzellen Durchlässigkeit für Luzifer gelb siehe unten Absatz 4.2) Experimente mit Polyester Membran Kultur Einsätze vorzubereiten.
    8. Inkubieren Sie das Fläschchen oder Einsätze bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit bis 100 % Zusammenfluss.
    9. Ändern Sie das Medium für T75 Zelle+ Kolben nicht bis eine neue Passage. Im Gegenteil bei BBB auf Polyester Membran Kultur fügt: Medium am Tag 2 und 4 zu ändern, verwenden Sie die BBB für Experimente am Tag 6.

(4) Konstruktion und Qualitätskontrolle von der BBB-Minibrain (Abbildung 2)

  1. Einrichten einer BBB-Minibrain Polyester Membran Kultur einfügen Gerät (Abb. 2 b)
    1. Wachsen die hCMEC/D3 Zellen auf 12 gut Polyester Membran Kultur legen Sie Filter für 6 Tage auf Endothelzellen Medium vor der Verwendung für das Experiment.
    2. Bestreichen Sie eine 12-well-Platte mit Poly-D-Lysin (1 mL/Brunnen, 10 µg/mL, 4 h bei RT) und dann Laminin (1 mL/Brunnen, 1 µg/mL, über Nacht bei RT).
    3. Laminin zu entfernen und fügen Sie 1 mL der Endothelzellen Medium ergänzt mit 5 % FBS (5 % Endothelzellen Medium).
    4. Inkubation für 1 h bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit.
    5. Sanft trypsinize NT2-n/a (wie in Schritt 1.3.9 beschrieben) und CHME/Cl5 (wie in Schritt 2.2 beschrieben) und die Zelle Pellets mit kompletten Endothelzellen Medium zu distanzieren.
    6. Zählen der Zellen, Mix 3,6 x 105 NT2-n/a und 0,4 x 105 CHME/Cl5 Zellen/gut und Samen der 12-well-Platte.
    7. Bei T = 24 h (24 h nach Aussaat): ändern Sie das eingesetzte Medium mit frischen komplette Endothelzellen Medium (Minibrain Zellen und Endothelzellen) und hCMEC/D3 Polyester Kultur einfügen Membranfilter auf der Oberseite der Minibrain Zellen zu übertragen. Inkubieren Sie die BBB-Minibrain bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit.
      Hinweis: Der BBB-Minibrain wird dann aus einer Schicht von menschlichen Endothelzellen hCMEC/D3 auf Filter der luminalen Fach (oder "Blut" Fach) zu isolieren und eine Mischkultur aus menschlichen Zellen hNT2-n/a und hCHME/Cl5 (Minibrain) am unteren Rand der gut definierenden bestehen. der abluminalen Fach (oder "Gehirn" Fach) (Abb. 2 b).
  2. Validierung der endothelialen Durchlässigkeit des BBB-Minibrain (Qualitätskontrolle) (Abbildung 2)
    1. Bereiten Sie den Transportpuffer (TB), der HBSS (Hanks' Balanced Salzlösung) Puffer mit Ca2 + und Mg2 + mit 10 mM HEPES und 1 mM Natrium Pyruvat ergänzt ist.
    2. 12-well-Platten mit 1,5 mL Transportpuffer pro Bohrloch vorzubereiten.
    3. Bei T = 0, frisch machen Transportpuffer ergänzt mit 50 µM Luzifer gelb (LY-TB).
    4. Umzukehren Sie jeder Filter Kopf, um das Medium sorgfältig entfernen, ohne die Endothelzellen Barriere.
    5. Setzen Sie den Filter auf die gefüllten 12-well-Platte und 0,5 mL LY-TB.
    6. Inkubieren Sie die Platten in einem Inkubator bei 37° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit.
    7. Bei T = 10 min Transfer Filter auf neue TB gefüllt 12-well-Platten und halten das abluminalen Fach der ersten Platte für OD lesen.
    8. Wiederholen Sie bei T = 25 min den Schritt 4.2.7.
    9. T = 45 min, Halt den Transport durch die Filter von den Platten zu entfernen. Halten Sie abluminalen und luminalen Fächer für OD Maßnahmen.
    10. Transfer in eine dunkle 96 Platten auch die Proben: 10 µL mit 190 µL TB für die LY-TB und der luminalen Fächer 200 µL der Probe für die abluminalen Fächer.
    11. Messung die Fluoreszenz von LY-TB vorhanden in den verschiedenen Proben bei λ428 nm λ535 nm (Anregung und Emission Länge bzw. Wellen).
    12. Die endotheliale Durchlässigkeit (Pe) in Richtung LY-TB (PeLY) nach Siflinger-Birnboim, A Et Al. (1987)39 und Da Costa, A Et Al. (2018)34 mithilfe der Formel zu berechnen:
      1/PSe = (1/PSt) – (1/PSf) und PeLY= PSe/S.
      Hinweis: PSf ist die Durchlässigkeit des Filters ohne Zellen, PST-Datei ist die Durchlässigkeit des Filters mit Zellen, PSe ist die Durchlässigkeit der endothelialen Monolage Zeit die Oberfläche der Monolage, S die Oberfläche der Monolayer ist (für einen 12 gut Filter = 1,12 cm2 ), PeLY drückt sich in cm/min. Für hCMEC/D3 PeLY zwischen 0,7 und 1,2 x 10 sein sollte verwendet-3 cm/min abhängig vor allem von der FBS in den Experimenten. Wichtig: eine PE-DateiLY höher als 1,2 bedeutet, dass die BBB nicht fest genug ist und einige Leckage beobachtet werden kann. Entsorgen Sie diese Barrieren.

5. Nutzung der BBB-Minibrain, markieren Sie das Vorhandensein von Neuro-invasive Viruspartikel in einer Gelbfieber-Virus-Impfstoff Probe, das French Neurotropic Virus YFV FNV 34 (Abbildung 3)

  1. BBB-Kreuzung und Vermehrung von Gelbfieber-Viren in der Minibrain
    1. Verwenden Sie die BBB-Minibrain wie in Schritt 4.1.7 24 h vor der Zugabe des Virus beschrieben; ersetzen Sie das Medium durch 2 % FBS Endothelzellen Medium.
      Hinweis: Es ist äußerst wichtig, zu vermeiden, ändern des Mediums nur vor dem Hinzufügen des Virus. Ändern des Mediums der menschlichen Endothelzellen aktivieren und vorübergehend öffnen die Schranke, die den Durchgang des Virus ermöglichen wird. Hier wird das Medium 24 h vor Beginn des Experiments geändert.
    2. Fügen Sie bei T = 0 3500 Plaque Forming Units (PFU) von YFV FNV in 50 µL 2 % FBS Endothelzellen Medium sehr sorgfältig auf die Oberseite der luminalen fach verdünnt. Das Steuerelement BBB-Minibrain ist mit 50 µL 2 % FBS Endothelzellen Medium ohne Virus geimpft. PeLY auch auf Begleiter zu bestimmen.
    3. Inkubieren Sie die BBB-Minibrain in einem Inkubator bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit.
    4. Entfernen Sie nach 24 h Polyester Membran Kultur fügt Filter Gerät und bestimmen Sie PeLY, Probe 1 mL aus dem Fach abluminalen und titrieren Sie Virus von A. da Costa Et Al. (2018)34beschrieben. Ersetzen Sie das Medium mit frischen 2 % FBS Endothelzellen Medium.
    5. Inkubieren Sie die BBB-Minibrain bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit.
    6. Probieren Sie nach 72 h das Medium aus dem Fach abluminalen und titrieren das Virus bzw. Extrahieren der RNS aus den Minibrain Zellen für gen Expressionsanalyse wie von A. da Costa Et Al. (2018)34beschrieben.
  2. Verstärkung der neurotropic Varianten der YFV FNV auf Minibrain Zellen durch serielle Passagen
    1. Verwendung Minibrain Zellen beschichtet 12-well-Platten (d. h., Schritte 4.1.6 und 4.1.7).
    2. 0 h, Punkt hinzufügen 3.500 Plaque bilden Einheiten von YFV-FNV in 50 µL 2 % FBS Endothelzellen Medium sehr sorgfältig auf die Oberseite der Zellen (luminalen Fach) verdünnt.
    3. Entfernen Sie nach 1 h das Medium mit der Virus-Inokulum und ersetzen Sie mit frischen 2 % FBS Endothelzellen Medium.
    4. Nach 48 h 500 µL des Kulturmediums probieren und frische Minibrain Zellen infizieren
    5. Probieren Sie nach 120 h 500 µL des Kulturmediums und infizieren Sie frische Minibrain Zellen.
    6. Nach 192 h Kulturmedium (= Virus bestand bereichert) speichern und Extrahieren der RNS aus den Minibrain Zellen für gen Expressionsanalyse wie von A. da Costa Et Al. (2018)34beschrieben.

6. Nutzung der BBB-Minibrain BBB kreuzen und Gehirn Zelle gezielt ein Biomolekül studieren

  1. Transport über die BBB eines Neurons targeting Biomolekül
    1. Verwenden Sie die Minibrain-BBB als beschriebenen Schritt 4.1.7 vorbereitet.
    2. Zum Zeitpunkt 0 h, fügen Sie das Biomolekül (im Beispiel vorausgesetzt, im Abschnitt Ergebnis kamen 58.75 ng/BBB der Zelle permeationsfähigen NeuroTag-NV Moleküle pro BBB-Minibrain einfügen.
    3. Inkubieren Sie die BBB-Minibrain bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit.
    4. Nach 24 h Polyester Membran Kultur fügt Filter Gerät entfernen und bestimmen PeLY, dann färben die Minibrain Zellen für hNeurons Neurofilament Nf200 und das Vorhandensein von das Biomolekül in der Minibrain (In dem Beispiel im Ergebnis Abschnitt, NeuroTag-NV wurde erkannt, dass mit einem Antikörper gegen Strep-Tag gerichtet, es enthält35,40).
  2. Transport über die BBB neurogenerative Biomolekül und anschließende neuroprotektive Assay in der Minibrain, nachdem das Biomolekül die BBB überquert hat
    1. Verwenden Sie die Minibrain-BBB wie in Schritt 4.1.7 beschrieben.
      Hinweis: Für Moleküle gezielt nur Neuronen, können Minibrain Zellen durch die Neuronen-Zellen (NT2-N) nur38ersetzt werden.
    2. Fügen Sie zum Zeitpunkt 0 h 58.75 ng/BBB-Minibrain gut der Zelle permeationsfähigen NV Moleküle (Wirkform CPM-NeuroTag-NV, inaktive Form CPM-NeuroTag-NVΔ) von C. Prehaud Et Al. (2014)35beschrieben.
    3. Inkubieren Sie die BBB-Minibrain in einem Inkubator bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit.
    4. Nach 4 h, stellen einzelne Wunden mit einer Injektionsnadel (26GX1/2 ", 12-4.5, Terumo, Belgien) auf die Minibrain Zellen. Mindestens 10 Kratzer gut auf jeden einzelnen Menschen zu machen. PeLY gut auf der Begleiter zu bestimmen.
    5. Inkubieren Sie die BBB-Minibrain in einem Inkubator bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit.
    6. Ersetzen Sie nach 8 h das Medium in der abluminalen Fach durch frische komplette Endothelzellen Medium.
      Hinweis: Es ist wichtig, das Medium bei diesem Schritt zu ersetzen, da die Verwundung der Minibrain Zellen zu Zelltod und dann die Freisetzung von zytotoxischen Verbindungen führen kann.
    7. Inkubieren Sie die BBB-Minibrain in einem Inkubator bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit.
    8. Nach 48 h gefärbten Zellen für Axon Regeneration von hNeurons wie von C. Prehaud Et Al. (2013)40beschrieben.

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Ergebnisse

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Die BBB-Minibrain ist ein in Cellulo experimentellen Modell der Blut-Hirn-Schnittstelle.

Die BBB-Minibrain ist das Polyester Membran Kultur einfügen System eingerichtet, ein Blut-Fach auf der oberen Ebene und ein Gehirn-Fach auf der unteren Ebene der Blut-Hirn-Schnittstelle (Abb. 2AB) zu imitieren. Es besteht aus einem luminalen Fach mit hCMEC/D3 Endothelzellen auf ...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In diesem Artikel wir gezeigt, wie man eine in Cellulo bauen Blut/Hirn-Schnittstelle, die BBB-Minibrain, durch die Kombination einer BBB-Modell und eine Kultur des Gehirn zerebrale Zellen (Minibrain) in einem einzigen Kit gemischt. Dieses System ist biologisch relevante, einfach einzurichten und für Experimentatoren, die gut ausgebildet in der Zellkultur zu behandeln.

Wie für jedes andere in-vitro-Modell von BBB würde zuverlässige Ergebnisse erzielt werden, wenn drastische Kontrolle der Dichti...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das geistige Eigentum des Systems war die Patente in 32, 35 und 38verwiesen wird.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie wurde unterstützt durch interne Zuschüsse vom Institut Pasteur, darunter einen förderlich Grant (PTR-435) und durch einen Zuschuss "Contrat de Soutien à la Recherche" zur Verfügung gestellt von Sanofi Pasteur, Institut Pasteur. A. da Costa wurde unterstützt von der Sanofi-Pasteur Grant und Florian Bakoa ist Empfänger von einem Promotionsstipendium zur Verfügung gestellt von ANRT (Association Nationale De La Recherche et De La Technologie). Wir sind verpflichtet, Pr Pierre-Olivier Couraud und Dr Florence Miller für hilfreiche Diskussionen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
12-Well-PlattenCorning3336
5-Fluoro-2' DesoxyuridinMerck-Sigma AldrichF0503
85mm PetrischaleSarstedt83-3902-500
Anti-Nf200Merck-Sigma AldrichN4142
β-mercapto-ethanolMerck-Sigma AldrichM3148
CHME/Cl5Unité de Neuroimmunologie ViraleAuf Anfrage an Dr. Lafon
CMCCalbiochem217274
Cytosin β-D-ArabinofuranosidMerck-Sigma AldrichC1768
Dunkle 96-Well-PlattenCorning3915
DMEM F12Thermofisher Scientific31330-038
DMSOMerck-Sigma AldrichD2650
Endogro IVMilliporeSCME004Endothelzellmedium
EthanolCarlo Erba529121
FBSHycloneSV30015-04
FormaldehydMerck-Sigma Aldrich252549
GIEMSARAL Diagnostic320310
Ziegen-Anti MausJackson Immuno Research115-545-003
Ziegen-Anti KaninchenThermofisher ScientificR37117
HBSS mit Ca2+-Mg2+Thermofisher Scientific14025-100
hCMEC/D3CedarlaneCLU512
Hepes 1MThermofisher Scientific15630-070
Hoescht 33342Merck-Sigma Aldrich33263
LaminineMerck-Sigma AldrichL6274
L-GlutaminThermofisher Scientific25030-024
Luzifer GelbMerck-Sigma AldrichL0259
MEM 10XThermofisher Scientific21430
MEM 1XThermofisher Scientific42360
Ntera/Cl2D.1ATCCCRL-1973
ParaformaldehydElektronenmikroskopie Wissenschaft15714
PBS ohne Ca2+-Mg2+Thermofisher Scientific14190
PBS-Ca2+-MG2+Thermofisher Scientific14040-091
Stift/StrepEurobioCXXPES00-07
Poly-D-LysinMerck-Sigma AldrichP1149
Prolong GoldThermofisher ScientificP36930
QiashredderQIAGEN79656
Rattenkollagen ICultrex3443-100-01
Retinsäure All-TransMerck-Sigma AldrichR2625
RNA-AufreinigungskitQIAGEN74104
SDSMerck-Sigma AldrichL4509
Natriumbicarbonat 5,6%EurobioCXXBIC00-07
NatriumpyruvatThermofisherScientific 11360
T75 Cell+ FlascheSarstedt83-1813-302Gewebekultur-Polystyrolflasche mit spezifischer Oberflächenbehandlung (Cell+) für empfindliche adhärente Zellen
TranswellCorning3460Polyester poröse Membrankultureinsätze
Trypsin-EDTAMerck-Sigma AldrichT3924
ReinstwasserThermofisher Scientific10977-035
UridinMerck-Sigma AldrichU3750
VerseneThermofisher Scientific15040-033EDTA
YFV-FNVIP DakarImpfstofffläschchen

Referenzen

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