Methodenartikel

Ein menschliches Blut-Hirn-Schnittstellenmodell Barriere Kreuzungen durch Krankheitserreger oder Medikamente und ihre Wechselwirkungen mit dem Gehirn zu studieren

DOI:

10.3791/59220

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9. April 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut Pasteur, CNRS UMR 3569, Unité de Neuroimmunologie Virale, 2Institut Pasteur, Unité d’Epidémiologie et de Pathophysiologie des Virus Oncogènes, Université Sorbonne Paris Cité/Paris Diderot, 3Institut Pasteur, PFIA, DTPS

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier stellen wir Ihnen ein Protokoll beschreibt die Einstellung einer in Cellulo BBB (Blut-Hirn-Schranke)-Minibrain aus Polyester poröse Membran Kultur einfügen System um den Transport von Biomolekülen oder infektiöse Erreger über eine menschliche BBB zu bewerten und ihre physiologische Wirkung auf die benachbarten Gehirnzellen.

Zusammenfassung

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Die frühen screening Nervensystem Medikamente auf eine sachdienliche und zuverlässig in Cellulo BBB Modell für ihre Verbreitung und ihre Wechselwirkung mit der Barriere und die Anwesenheit von besteht noch ein ungedeckter Bedarf. Um diese Lücke zu füllen, entwarfen wir ein 2D in Cellulo Modell, die BBB-Minibrain, durch die Kombination einer Polyesters poröse Membran Kultur einfügen BBB Menschmodell mit einer Minibrain von einer Tri-Kultur der menschlichen Gehirnzellen (Neuronen, Astrozyten und Mikroglia-Zellen) gebildet. Die BBB-Minibrain erlaubt uns, testen Sie den Transport von eine neuroprotektive Arzneimittelkandidat (z. B. Neurovita), durch die BBB, bestimmen die spezifische Ausrichtung dieses Moleküls zu Neuronen und zu zeigen, dass die neuroprotektive Eigenschaft des Medikaments nach erhalten blieb das Medikament hatte die BBB überschritten. Wir haben auch gezeigt, dass BBB-Minibrain ein interessantes Modell stellt, im Laufe der Viruspartikel durch die Endothelzellen Schranke zu erkennen und die Infektion der Minibrain durch Neuroinvasive Viruspartikel zu überwachen. Die BBB-Minibrain ist ein zuverlässiges System, einfach zu handhaben für Forscher ausgebildet in Zellkulturtechnik und prädiktiv für die Gehirn-Zellen-Phänotypen nach Behandlung oder Beleidigung. Das Interesse eines solchen Cellulo testen wäre zweierlei: Einführung von Konzentrationsrisiken Schritte schon früh in der Entwicklung von Medikamenten auf der einen Seite und Verringerung des Einsatzes von Tierversuchen auf der anderen Seite.

Einleitung

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Das Gehirn wird von den Körperkreislauf durch eine nicht-durchlässigen Struktur getrennt, die den Austausch zwischen der Anwesenheit und das Blut, die Blut - Hirn-Schranke (BBB) genannt einschränkt. Meist bestehend aus zerebralen Endothelzellen, interagiert die BBB dynamisch mit perivaskuläre Mikroglia, Astrozyten und Neuronen in Anwesenheit von den benachbarten. Die drei Hauptfunktionen der BBB sind die Erstellung und Pflege der Ionischen Homöostase für neuronale Funktionen, Versorgung des Gehirns mit Nährstoffen und Schutz vor toxischen Verletzungen oder Eintrag von Krankheitserregern1,2, die dazu beitragen ....

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Protokoll

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(1) Zelle Kultur Arbeit der Ntera/CL2. D1 zur Vorbereitung einer Kokultur Post-mitotische hNeurons und hAstrocytes (NT2-n/a)

Hinweis: Dies ist die Komponente des Minibrain (Abbildung 1).

  1. Kultivierung der Ntera/Cl2.D1
    1. Entfernen Sie ein Fläschchen mit gefrorenen Zellen aus flüssigem Stickstoff-Tank. Halten Sie auf dem Eis.
    2. Auftauen der Zellen schnell in einem 37 ° C-Wasserbad.
    3. Die Zellen in einer 15 mL Tube mit 10 mL der kompletten DMEM-F12 Medium zu übertragen (Dulbeccos geändert Eagle Medium: Nährstoff-Mischung f-12 Medium) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 2 mM Glutam....

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Ergebnisse

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Die BBB-Minibrain ist ein in Cellulo experimentellen Modell der Blut-Hirn-Schnittstelle.

Die BBB-Minibrain ist das Polyester Membran Kultur einfügen System eingerichtet, ein Blut-Fach auf der oberen Ebene und ein Gehirn-Fach auf der unteren Ebene der Blut-Hirn-Schnittstelle (Abb. 2AB) zu imitieren. Es besteht aus einem luminalen Fach mit hCMEC/D3 Endothelzellen auf .......

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Diskussion

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In diesem Artikel wir gezeigt, wie man eine in Cellulo bauen Blut/Hirn-Schnittstelle, die BBB-Minibrain, durch die Kombination einer BBB-Modell und eine Kultur des Gehirn zerebrale Zellen (Minibrain) in einem einzigen Kit gemischt. Dieses System ist biologisch relevante, einfach einzurichten und für Experimentatoren, die gut ausgebildet in der Zellkultur zu behandeln.

Wie für jedes andere in-vitro-Modell von BBB würde zuverlässige Ergebnisse erzielt werden, wenn drastische Kontrolle der Dichti.......

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Offenlegungen

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Das geistige Eigentum des Systems war die Patente in 32, 35 und 38verwiesen wird.

Danksagungen

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Diese Studie wurde unterstützt durch interne Zuschüsse vom Institut Pasteur, darunter einen förderlich Grant (PTR-435) und durch einen Zuschuss "Contrat de Soutien à la Recherche" zur Verfügung gestellt von Sanofi Pasteur, Institut Pasteur. A. da Costa wurde unterstützt von der Sanofi-Pasteur Grant und Florian Bakoa ist Empfänger von einem Promotionsstipendium zur Verfügung gestellt von ANRT (Association Nationale De La Recherche et De La Technologie). Wir sind verpflichtet, Pr Pierre-Olivier Couraud und Dr Florence Miller für hilfreiche Diskussionen.

....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
12-Well-PlattenCorning3336
5-Fluoro-2' DesoxyuridinMerck-Sigma AldrichF0503
85mm PetrischaleSarstedt83-3902-500
Anti-Nf200Merck-Sigma AldrichN4142
β-mercapto-ethanolMerck-Sigma AldrichM3148
CHME/Cl5Unité de Neuroimmunologie ViraleAuf Anfrage an Dr. Lafon
CMCCalbiochem217274
Cytosin β-D-ArabinofuranosidMerck-Sigma AldrichC1768
Dunkle 96-Well-PlattenCorning3915
DMEM F12Thermofisher Scientific31330-038
DMSOMerck-Sigma AldrichD2650
Endogro IVMilliporeSCME004Endothelzellmedium
EthanolCarlo Erba529121
FBSHycloneSV30015-04
FormaldehydMerck-Sigma Aldrich252549
GIEMSARAL Diagnostic320310
Ziegen-Anti MausJackson Immuno Research115-545-003
Ziegen-Anti KaninchenThermofisher ScientificR37117
HBSS mit Ca2+-Mg2+Thermofisher Scientific14025-100
hCMEC/D3CedarlaneCLU512
Hepes 1MThermofisher Scientific15630-070
Hoescht 33342Merck-Sigma Aldrich33263
LaminineMerck-Sigma AldrichL6274
L-GlutaminThermofisher Scientific25030-024
Luzifer GelbMerck-Sigma AldrichL0259
MEM 10XThermofisher Scientific21430
MEM 1XThermofisher Scientific42360
Ntera/Cl2D.1ATCCCRL-1973
ParaformaldehydElektronenmikroskopie Wissenschaft15714
PBS ohne Ca2+-Mg2+Thermofisher Scientific14190
PBS-Ca2+-MG2+Thermofisher Scientific14040-091
Stift/StrepEurobioCXXPES00-07
Poly-D-LysinMerck-Sigma AldrichP1149
Prolong GoldThermofisher ScientificP36930
QiashredderQIAGEN79656
Rattenkollagen ICultrex3443-100-01
Retinsäure All-TransMerck-Sigma AldrichR2625
RNA-AufreinigungskitQIAGEN74104
SDSMerck-Sigma AldrichL4509
Natriumbicarbonat 5,6%EurobioCXXBIC00-07
NatriumpyruvatThermofisherScientific 11360
T75 Cell+ FlascheSarstedt83-1813-302Gewebekultur-Polystyrolflasche mit spezifischer Oberflächenbehandlung (Cell+) für empfindliche adhärente Zellen
TranswellCorning3460Polyester poröse Membrankultureinsätze
Trypsin-EDTAMerck-Sigma AldrichT3924
ReinstwasserThermofisher Scientific10977-035
UridinMerck-Sigma AldrichU3750
VerseneThermofisher Scientific15040-033EDTA
YFV-FNVIP DakarImpfstofffläschchen

Referenzen

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  1. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  2. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.

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Schlagwörter

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