Dieses Protokoll beschreibt die Schritte erforderlich, um ein Modellsystem, in dem die Transkription des endogenen Gens von Interesse bedingt gesteuert werden kann, in lebenden Tieren oder Zellen mit verstärkten Lac Repressor und/oder Tet Aktivator Systeme generieren.
Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Implementierung des REMOTE-Control Systems (Rereversiblen MAnipulation of TRanscription an ENdogenous Loci), reversibel und abstimmbaren Ausdruck Kontrolle ermöglicht eine endogenen gen des Interesses an lebenden Modellsysteme. Die Fernsteueranlage beschäftigt erweiterte Lac Repression und Tet Aktivierung Systeme, Down- oder Hochregulation des Zielgens innerhalb eines biologischen Systems zu erreichen. Engen Unterdrückung erreicht werden, von Repressor Bindungsstellen flexibel befindet sich weit hinter der eine Transkription Startsite durch Hemmung der Transkription Dehnung. Robuste Hochregulation kann erreicht werden, durch die Stärkung der Transkription des endogenen Gens durch gezielte Tet transcriptional Aktivatoren für den cognate Projektträger. Diese reversible und abstimmbaren Expressions kann angewendet und in Organismen immer wieder zurückgezogen. Die Potenz und die Vielseitigkeit des Systems, wie für endogene Dnmt1 hier ermöglicht präzisere in-vivo Funktionsanalysen durch Untersuchung der Genfunktion auf verschiedenen Ebenen der Ausdruck aktivieren und testen die Reversibilität der eine Phänotyp.
Genetischen Ko oder transgene Ansätze wurden wirksame Mittel Genfunktion in Tiermodellen zu studieren. Jedoch Ausdruck Regulierung durch diese Ansätze ist dichotom (ein/aus), nichtzeitlichen, und so ist nicht in der Lage das komplette Funktionsspektrum eines Gens zu enthüllen. Bedingte Cre/LOxP Technologien haben räumlich-zeitliche Inaktivierung oder Aktivierung der Genfunktion zugelassen, aber ihre dichotomen Natur weiterhin Einschränkungen, z. B. Zelle Letalität und Irreversibilität1,2 , 3. um diese Lücke zu füllen, bedingte Knockdown Ansätze wurden entwickelt mit Tet-ShRNA oder MiRNA4geregelt. Ein Anliegen für RNAi5 bleiben jedoch Ziel Effekte und haben eine Herausforderung wurde, Steuern in-vivo. Vor kurzem haben CRISPR/Cas-vermittelten transkriptionellen-Steuerungstechnik führte einen vielseitigeren Ansatz zur Erreichung sowohl up- und Downregulation der endogenen Genexpression und demonstriert ihre Dienstprogramme6,7 . CRISPR/Cas-vermittelten transkriptionellen Kontrolle ist noch unklar, in Vivo und die Reversibilität der KRAB-basierte Unterdrückung bleibt jedoch zu gesehen, wie starke Unterdrückung durch KRAB und seine interagierenden Proteins KAP1 hat gezeigt, dass induzieren permanente Gen-silencing-8,9.
Um diese Einschränkungen zu beheben, haben wir ein neuartiges transkriptionelle regulatorische System in der Lage bedingt kontrollieren endogene Genexpression in eine Reversible und abstimmbaren Weise bei Mäusen mit engineered transkriptionelle prokaryotische Binär Regulierungssysteme10. Prokaryotische binäre transkriptionelle Regelungssysteme mit regulatorischen Liganden wie Lac und Tet, konnten solche reversibel und abstimmbaren Ausdruck Steuern11,12,13, 14. jedoch die unzureichende Unterdrückung Potenz des aktuellen binären Systemen hat ihre breite Akzeptanz für die Steuerung der endogenen Genexpression bei Säugetieren behindert. Wir eine verbesserte Lac Unterdrückung System ausreichend potenten für die Unterdrückung der endogenen Genen entwickelt und verwendet eine neuartige Strategie des Zielens Tet transcriptional Aktivatoren direkt an den cognate Promotor des endogenen Gens zu erreichen robuste Hochregulation (Abbildung 1)10. Mit dieser Technologie haben wir fast zwei Größenordnungen Expressions des endogenen Dnmt1 Gens in einer einstellbaren, induzierbaren und reversible Weise10erreicht. Hier bieten wir schrittweise Anleitungen für die in-vivo Anwendung auf andere Gene und Organismen mit Hilfe von Mäusen als Modell Spezies.
Abbildung 1 : Überblick über die Fernsteueranlage. Die Transkription des Zielgens eine endogene kann mit veränderter Lac Repressor und Tet Aktivator Systeme reguliert werden. Das Ziel gen Promoter oder Intron wurde entwickelt, um Operatoren für die feste Bindung LacIGY Repressor und/oder rtenthalten TA-M2-Aktivator. R steht für Repron (RepSitzung Intrauf), plus eine partielle Kaninchen Beta-Globin Intron enthält 12 symmetrische Lac Operatoren (S). T zeigt Tet Operator. Der Repressor und/oder Aktivator ist/sind von gewebespezifischen Promoter ausgedrückt. Der Ausdruck des Zielgens kann dann reversibel die gewünschte Expression durch Gabe von IPTG (Isopropyl-β-D-1-Thiogalactopyranoside, ein Antagonist von der LacIGY-Repressor) oder Doxycyclin (Dox) abgestimmt werden. Diese Zahl wurde von Lee Et Al.10geändertKlicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Überprüfen Sie vor Beginn dieses Protokolls, Tabelle 1 , um die entsprechenden Schritte für die gewünschte Kontrolle der Genexpression zu identifizieren. Z. B. um eine Maus Ingenieur, die reversible Herabregulation der “Gen X” ermöglicht, abschließen, Abschnitte 1, 3 und 4 von den unter Protokoll. Tabelle 1 fasst auch die benötigten Komponenten der Fernsteueranlage.
Gewünschten Ausdruck ändern | Repression nur | Aktivierung nur | Repression und Aktivierung |
Jeweiligen Abschnitten des Protokolls | 1, 3 und 4 | 2-4 | 1-4 |
Fernbedienung Sequenz in Zielgen benötigt | Repron (“Repression Intron”; 12 symmetrische Lac Operatoren plus eine partielle Kaninchen Beta-Globin Intron) | Tet Ortbestimmung | Repron und Tet Ortbestimmung |
Fernbedienung Sequenz Lage | Intron | Veranstalter | Intron & Promoter |
Aktivator/Repressor für gewünschte Steuerelement benötigt | LacIGY Repressor | RtTA-M2-Aktivator | LacIGY Repressor und RtTA-M2-Aktivator |
Regulatorischen Liganden | IPTG | Doxycyclin | IPTG und/oder Doxycyclin |
Tabelle 1: Überblick über REMOTE-Control-Komponenten.
Ein wichtiger Schritt und mögliche Einschränkung des REMOTE-Control-Systems ist die Herausforderung, verbunden mit dem Einführen der Repressor bzw. Aktivator Bindungsstellen ohne Ziel Genexpression. Unsere ursprüngliche Unterdrückung Ansatz involviert, da auf das Dnmt1 gen angewendet Einfügen von Lac Repressor Bindungsstellen innerhalb transcriptionally kritischen Regionen eines Promotors. Zur Verringerung des Risikos des Projektträgers Funktion beeinträchtigen und damit zu verbessern die allgemeine Anwendbarkeit der REMOTE-Steuerung, entwickelten wir einen Unterdrückung Intron-basierten Ansatz. Die Wirkstärke von unserem erweiterten Lac -System erlaubt uns, fest die Transkription der starke Promotoren unterdrücken wir bei Betreibern befindet sich getestet hundert bis zu mehreren Kilobases flussabwärts der Transkription beginnen Websites (Abbildung 3A – C) 10. wichtig ist, das Niveau der Unterdrückung wurden unabhängig von transkriptionellen Stärken der Promotoren (Abbildung 3A – C)10. Dies deutet darauf hin, dass die Repression Kapazität unseres Repression Intron-basierten Systems die transkriptionelle Stärke der getesteten Promotoren übersteigt. In diesem Intron-basierten Ansatz ist es wahrscheinlich, dass die Unterdrückung durch körperliche Störungen zwischen zwei Komponenten, die Dehnung Transkriptionsmaschinerie und Lac Repressoren57vermittelt wird. Dieser einfache Unterdrückung Mechanismus und die nachgewiesene Robustheit der Intron-basierte Methode können dieser Ansatz generell für verschiedene Gene, Geweben und Organismen machen.
Die Hochregulation von der REMOTE-Steuerung erfordert die Transaktivator Bindung Sequenzen in der Nähe der Ziel-gen-Veranstalter, die eine Gefahr der Projektträger Funktion beeinträchtigen. Allerdings haben wir festgestellt, dass die Position der verbindlichen Sequenzen außerhalb der transcriptionally kritische Region sein kann. Dnmt1 und EF1α Projektträger waren robust hochreguliert Tet Postbetreibern befindet sich ein paar hundert Basen stromaufwärts der Transkription Start Seiten10. Diese entspannte Einschränkung reduziert die Chance der Projektträger Funktion des Zielgens in Ermangelung der Transaktivator beeinträchtigen. Erhöhung der Zahl der Bindung-Sequenzen und/oder Verwendung von stärkeren Transactivators könnte helfen, weiter zu reduzieren das Risiko durch Hochregulation von Websites weiter entfernt von der Transkription Startsite aktivieren.
Unser REMOTE-Control-System bietet elegante Kontrolle über die Höhe, Zeitpunkt und Ort der endogenen Genexpression, so dass für die Prüfung der Reversibilität des Phänotyps und die Folgen eines anderen Ausdruck Niveaus, die nicht ohne weiteres erreichbar sind aktuelle in-vivo-Expressions Gentechnologien. Es ist wichtig zu beachten, dass in den meisten Genexpressionsanalysen, einschließlich der unsrigen, Ausdruckswerte im Durchschnitt von einer Bevölkerung der Zellen repräsentieren unter denen erhebliche Unterschiede gefunden werden kann. Diese Heterogenität beeinflussen zellulären Entscheidungsprozesse, wie Differenzierung oder Apoptose58. Wenn die Genauigkeit der gen-Expressions durch zusätzliche genetische Schaltung engineering59wahrscheinlich weiter verbessert werden könnte, ermöglicht die beobachteten Wirksamkeit von unserem derzeitigen System nützliche Untersuchung der Genfunktion in vielen biologischen zusammenhängen. Darüber hinaus wird ein hohes Maß an Ziel-Spezifität aufgrund der Komplexität der die Operator-Sequenzen sowie der großen evolutionären Abstand zwischen Säugetieren und die ursprünglichen Arten der regulatorische Komponenten60erwartet. Darüber hinaus können transgene Mauslinien Repressors und Aktivatoren entwickelt und für jedes endogenen gen eingesetzt werden. Zum Beispiel können bestehende Tet Transaktivator Mausmodellen um Hochregulation von Zielgen in den gewünschten Maus Geweben zu erreichen angepasst werden. Kürzlich entwickelten wir eine transgene Linie, die robuste gewebespezifischen Ausdruck unserer verstärkten Lac Repressor in mehrere Gewebetypen durch die Einführung des LacIGY -Gens in der Hipp11 Locus48 in Kombination mit bestehenden Cre-Linien fahren kann unter der Kontrolle eines Lox-STOP-Lox-Elements (unveröffentlicht). Dieser Linie würde die gewebespezifischen Anwendung von REMOTE-Control-System erheblich erleichtern.
Gen Hochregulation von der REMOTE-Steuerung bietet mehrere Vorteile im Vergleich zu aktuellen induzierbaren transgene Ansätze. Es erfordert keine Generation von mehrere transgene Linien für Positionseffekte der Insertion, zu testen, wie es die endogenen Locus nutzt. Darüber hinaus eignet sich dieser Ansatz für Hochregulierung von Genen mit starken Grundlinie Ausdruck weil es Ausdruck von einem bereits stabile Promoter verbessert während herkömmliche transgene Modelle auf minimale virale Promotoren verlassen. Zu guter Letzt das Gewebe Spezifität, Zellzyklus Kontrolle und Spleißen Varianten eines Ziel-Gens können beibehalten werden auf Hochregulation von unserem Ansatz, wie es Elemente der natürlichen Regulierung wie angeborene GUSbewahrt-regulatorischen Elementen. Das Aufkommen der CRISPR/Cas-mediated Gene-targeting-Technologie wird die Anwendung dieser Technologie in verschiedenen Modellsysteme erheblich erleichtern.
The authors have nothing to disclose.
Wir bedanken uns bei den späten Dr. Heidi Scrable für ihre großzügige Gabe von den Säugetieren LacI Genkonstrukt (Mayo Clinic, Rochester, MN), Dr. Daniel Louvard (Institut Curie, Paris, Frankreich) für die Bereitstellung der Villin-Promoter und Dr. Laurie Jackson-Grusby (Kinderklinik, Boston, MA) für ihre Verdienste um den frühen Stadien der Technologieentwicklung. Wir sind dankbar für Dr. Nancy Wu und Dr. Robert Maxson für ihre Unterstützung bei der Erzeugung transgenen und Knockout-Mäusen. Wir bedanken uns bei die Mitgliedern des Laird Labors für hilfreiche Gespräche und unterstützen. Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health [R01 CA75090, R01 DA030325 R01-CA157918 und R01 CA212374, P.W.L. und 1F31CA213897-01A1, N.A.V.S] unterstützt.
B6C3F1/J | The Jackson Laboratory | 100010 | https://www.jax.org/strain/100010 |
Cas9 Protein | PNA Bio | CP04 | http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE |
CRISPOR | Haeussler et al. 2016 | http://crispor.tefor.net/ | |
Doxycycline-Containing Mouse Diet | Envigo | Varies by concentration | https://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/ |
ENCODE Database | Stanford University | https://www.encodeproject.org/ | |
iCre mRNA synthesis plasmid (pBBI) | Addgene | 65795 | https://www.addgene.org/65795/ |
IPTG | GoldBio | I2481C | https://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&q=iptg |
pGL3-Basic | Promega | E1751 | https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751 |
SVM-BPfinder | Regulatory Genomics, Pompeu Fabra University | http://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/ | |
TiProD: Tissue specific promoter Database | Department of Bioinformatics, UMG, University of Göttingen | http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de | |
UCSC Genome Browser | University of California Santa Cruz | https://genome.ucsc.edu/ |