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Dissektion der lokalen Ca2 + Signale in kultivierten Zellen durch die Membran-gezielte Ca2 + Indikatoren

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DOI:

10.3791/59246

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22. März 2019

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1Japan Science and Technology Agency, PRESTO, 2Laboratory for Developmental Neurobiology, RIKEN Center for Brain Science, 3École Normale Supèrieure, Institut de Biologie de l'ENS (IBENS), Institut national de la santè et de la recherche mèdicale (INSERM), Centre national de la recherche scientifique (CNRS), École Normale Supèrieure, PSL Research University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll für Ca2 + Bildgebung in Neuronen und Gliazellen, die das Sezieren von Ca2 + Signale in subzellulären Auflösung ermöglicht. Dieser Prozess gilt für alle Zelltypen, die die Expression von genetisch codierte Ca2 + Indikatoren zu ermöglichen.

Zusammenfassung

Calcium-Ion (Ca2 +) ist eine universelle intrazelluläre Messenger-Molekül, das mehrere Signalwege, führt zu vielfältigen biologischen Ausgänge treibt. Die Koordination der beiden Ca2 + Signalquellen – "Ca2 + Zustrom" von außerhalb der Zelle und "Ca2 + Release" von der intrazellulären Ca2 + speichern endoplasmatische Retikulum (ER) – gilt die vielfältigen räumlich-zeitliche Muster von Ca zugrunde liegen 2 + Signale, die mehrere biologische Funktionen in Zellen verursachen. Dieses Protokoll soll ein Ca2 + bildgebendes Verfahren zu beschreiben, das ermöglicht die Überwachung der Augenblick der "Ca2 + Zustrom" und "Ca2 + release". OER-GCaMP6f ist ein genetisch codierte Ca2 + Indikator (GECI) bestehend aus GCaMP6f, die auf der äußeren Membran ER ausgerichtet ist. OER-GCaMP6f kann Ca2 + Version auf eine höhere zeitliche Auflösung als herkömmliche GCaMP6f überwachen. In Kombination mit der Plasmamembran ausgerichtete GECIs, kann die räumlich-zeitliche Ca2 + Signalmuster mit einer subzellulären Auflösung beschrieben werden. Die subzelluläre gezielt Ca2 + Indikatoren hier beschrieben sind, im Prinzip für alle Zelltypen, auch für die in-vivo von Caenorhabditis Elegans Neuronen imaging. In diesem Protokoll wir Ca2 + Bildgebung in Zellen von Zelllinien, Neuronen und Gliazellen bei dissoziierten Primärkulturen einzuführen, und die Vorbereitung der gefrorenen Bestand an Ratte kortikale Neuronen beschreiben.

Einleitung

Ca2 + Signale stellen die Höhe der intrazellulären Ca2 + Konzentration. Ca2 + ist die universelle zweiten Messenger für eukaryotische Zellen. Mit Ca2 +, Zellen funktionieren über verschiedene intrazelluläre Signalwege und verschiedenen biologischen Ausgänge zu induzieren. Z. B. in Neuronen, synaptischen Vesikel Release am präsynaptischen Terminal Genexpression in den Zellkern und Induktion der synaptischen Plastizität an der Postsynapse unterstehen verschiedene Ca2 + Signale, die genau den entsprechenden aktivieren nachgeschalteter Enzyme an den richtigen Standorten und mit präzisem Timing1.

Spezifischen räumlich-zeitliche Muster Ca2 + Signale aktivieren die spezifischen nachgeschalteter Enzyme. Ca2 + -Signale werden generiert, indem die Koordination zwischen zwei verschiedenen Ca2 + Quellen: Ca2 + Zustrom aus dem Extrazellulärraum und Ca2 + Entlassung aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER), dient als eine intrazelluläre Ca2 + speichern. Die sinnvolle raumzeitliche Ca2 + Signalisierung Muster induzieren eine bestimmte Zelle-Funktion wird auch durch Nanodomains von 10-100 µM Ca2 + erzeugt in der Nähe von Ca2 + -Kanäle in der Plasmamembran oder ER-Membran-2unterstützt. Wichtig ist, ist die Quelle von Ca2 + Signale eines der wichtigsten Faktoren, die die nachgeschaltete biologischen Ausgabe. In Neuronen haben Ca2 + Zustrom und Ca2 + Release entgegengesetzte Effekte auf das clustering von Gamma - Aminobuttersäure (GABA)A -Rezeptoren (GABA-AR) an den GABAergen Synapsen, der verantwortlich für die Hemmung der neuronale Erregbarkeit3. Ca2 + Zustrom begleitet von massiven neuronale Erregung induziert die Streuung der synaptischen GABAAR Cluster, während anhaltende Ca2 + Entlassung aus der Notaufnahme fördert das clustering von synaptischer GABA-A-Rs. Andere Gruppen haben auch berichtet, dass Tune Richtung Wachstum Kegel Ca2 + Signalquelle kritisch abhängig ist: Ca2 + Zustrom induziert Abstoßung, während Ca2 + Release die Attraktion für das neuronale Wachstum führt Kegel4. Daher, um die Ca2 + Signalwege zugrunde liegenden spezifischen zellulären Ausgänge zu verstehen, ist es wichtig zur Identifizierung der Quelle von Ca2 + Signale von Ca2 + Signale in der subzellulären Auflösung zu beschreiben.

In diesem Protokoll beschreiben wir eine Ca2 + bildgebende Methode um Ca2 + Signale in der subzellulären Auflösung ermöglicht die Abschätzung der Ca2 + Signalquellen (Abbildung 1) zu melden. Ca2 + Microdomains unterhalb der Plasmamembran werden erfolgreich von genetisch codierte Ca2 + Indikatoren (GECIs) gezielt an die Plasmamembran über die Befestigung der Plasmamembran-Lokalisierung Signal Lck in Src überwacht. Kinase N-Termini GECIs5. Um das Ca2 + Signalmuster in der Nähe der ER auf eine bessere räumliche und zeitliche Auflösung erkennen, entwickelten wir vor kurzem OER-GCaMP6f, welche GCaMP6f6 Ziele der ER äußere Membran, mit der ER transmembranen Protein. OER-GCaMP6f kann sensibel Ca2 + Entlassung aus der Notaufnahme mit einer besser räumlich-zeitliche Auflösung als herkömmliche nontargeted GCaMP6f COS-7 Zellen7 und HEK293 Zellen8, durch die Vermeidung der Verbreitung von Ca2 + und GECIs melden. . Wir auch bestätigt, dass die spontane Ca2 + Erhebung im kultivierten hippocampal Astrozyten berichtet von OER-GCaMP6f ein anderes räumlich-zeitliche Muster zeigte im Vergleich zu jener von Plasmamembran ausgerichtete GCaMP6f überwacht (Lck-GCaMP6f)7 ,9, darauf hinweist, dass Ca2 + Bildgebung mit OER-GCaMP6f in Kombination mit Lck-GCaMP6f, das Sezieren von Ca2 + Signale in der subzellulären Auflösung trägt, ihre Quellen zu identifizieren.

Derzeit zeigen wir das Protokoll für die Ca2 + Signal Dissektion im HeLa-Zellen und Neuron-Astrozyten Mischkulturen auf Glasdeckgläser überzogen. Die Ca2 + bildgebende Verfahren mit GECIs angegeben hier Lck-GCaMP6f, Plasma-Membran-bezogenen RCaMP210 (Lck-RCaMP2) und OER-GCaMP6f (Abbildung 1) gelten für alle Zellen, in denen diese GECIs ausgedrückt werden können.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Experimente wurden von RIKEN Sicherheitsausschuss und Tierversuch Ausschuss gemäß der Richtlinie ausgestellt vom japanischen Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie genehmigt.

1. Vorbereitung der Zellen

  1. Vorbereitung von Poly (Ethylenimin)-beschichtet Deckgläsern
    Hinweis: Poly(ethyleneimine) (PEI) Beschichtung ist für Glasapparaturen, empfohlen, da dadurch Neuronen und Astrozyten der Deckgläsern fest zuordnen, ohne ihre Entwicklung zu verhindern. Jedoch anderen Beschichtungsverfahren (z.B. Poly-Ornithin, L-Lysin, Laminin Beschichtung Poly) zur Verfügung stehen, falls erforderlich, für Glasboden Gerichte.
    1. Legen Sie einen Durchmesser von 18 mm Glas Deckglas in jede Vertiefung eine 12-Well-Platte. Ansetzen Sie 0,04 % PEI Lösung (12,5 mL/12-Well-Platte) mit sterilisierten Wasser.
    2. Fügen Sie 1 mL 0,04 % PEI Lösung in jede Vertiefung. Sicherzustellen Sie, dass es keine Luftblasen unter der Deckgläsern.
    3. Inkubieren Sie die Platten in einem CO2 Inkubator über Nacht bei 37 ° c
    4. Am nächsten Tag Waschen der beschichteten Deckgläsern 3 X mit 1 mL Wasser sterilisiert. Entfernen Sie die PEI-Lösung mit einer Absauganlage, fügen Sie 1 mL sterilisierten Wasser in jede Vertiefung und schütteln Sie 12-Well-Platte zu, so dass die PEI-Lösung zwischen dem Deckglas und der Platte gründlich ausgewaschen werden. Wie die übrigen PEI giftig für Zellen ist, sicherstellen Sie, dass das Wasser nach das letzten Waschen komplett abgesaugt wird.
    5. Trocknen und Sterilisieren der Deckgläsern im Inneren der Haube mit Ultraviolett (UV) Licht für mindestens 15 Minuten. Die PEI-beschichtete Schale kann bis zu 2 Monate bei 4 ° C aufbewahrt werden. Beleuchten Sie die Gerichte mit UV-Licht für 15 min kurz vor Gebrauch.
    6. Fügen Sie 5 mL sterilem destilliertem Wasser in den Raum zwischen den Brunnen um Verdunstung des Kulturmediums zu verhindern.
  2. Beschichtung-Zell-Linien
    Hinweis: Dieses Protokoll ist nur ein Beispiel für Transfektion in Zellen von Säugetieren Zelllinien, wie HeLa-Zellen und COS-7 Zellen. Benutzer können andere Transfektion Protokolle anwenden, die für ihre Experimente optimiert sind. In diesem Abschnitt beschreiben wir die HeLa-Zelle-Kultur-Protokoll, das auch auf COS-7 Zellen anwendbar ist.
    1. Am Vortag die Transfektion Kultur der Zellen in der Kulturschale von 10 cm bis sie Zusammenfluss von 70 – 90 % erreichen.
    2. Prewarm das Kulturmedium (siehe Tabelle der Materialien) auf 37 ° C.
    3. Waschen Sie die Zellen 2 X mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung ohne Ca2 + und Mg2 + (PBS [-]).
    4. Aspirieren Sie die PBS(-), fügen Sie 1 mL 0,5 % Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) Lösung und inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C für 90 s bis sie eine Runde Form erreichen.
    5. Fügen Sie 9 mL vorgewärmte Kulturmedium, die Trypsinization zu stoppen. Verdünnen Sie die Zellen mit Nährmedium in einem Verhältnis von 1:6.
    6. Samen 1 mL der verdünnten Zellen auf PEI-beschichtete Deckgläsern in der 12-Well-Platten.
  3. Vorbereitung der hippocampal Neuronen-Astrozyten gemischte Kultur von Ratten oder Mäusen
    Hinweis: Abschnitte 1.3 und 1.4 müssen zuerst überprüft werden, und durch eine institutionelle Tier Pflege und verwenden Ausschuss genehmigt und müssen behördlich genehmigten Verfahren für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Das Flussdiagramm des neuronalen Kultur Protokolls ist in Abbildung 2dargestellt.
    1. Bereiten Sie alle Reagenzien unter der Laminar-Flow-Haube. Ort Dulbecco modifizierte Eagle Medium (DMEM) in zwei 100 mm Kultur Gerichte (ca. 20 mL/Gericht), die in ein Eisschrank.
    2. 50 mL des Mediums Dissektion bestehend aus DMEM und 20 mM 4--(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic-Säure (HEPES) vorbereiten (siehe Tabelle der Materialien) und verzichten Sie das Medium in drei 60 mm Kultur Gerichte (ca. 7 mL/Gericht) und acht 35 mm Kultur-Gerichte (ca. 2 mL/Gericht). Legen Sie die Gerichte in einer anderen Kühlbox.
    3. Bereiten Sie die Inkubation Kochsalzlösung, bestehend aus Hanks ausgeglichene Salzlösung ergänzt mit 20 mM HEPES (siehe Tabelle der Materialien), 50 mL und legen Sie 8 mL Saline in einem 15 mL konische Röhrchen auf Eis.
    4. Bereiten Sie die Beschichtung Medium mit minimalen wesentliche Medium (MEM) ergänzt mit B-27, Glutamin und Penicillin-Streptomycin (siehe Tabelle der Materialien). Pflegen Sie dieses Medium bei Raumtemperatur (20 – 28 ° C).
    5. Die chirurgischen Instrumente mit 70 % Ethanol zu sterilisieren.
    6. Platzieren Sie ein Papiertuch in einem Glas mit Deckel und 1 mL Isofluran. Die Isofluran für 1 min verdunsten zu lassen.
    7. Eine schwangere Ratte oder Maus in das Glas nach Schritt 1.3.6 zubereitet und das Tier in das Glas halten, bis es tief narkotisiert ist (ca. 30 s, 1 min).
    8. Narkotisierten Tier aus dem Glas nehmen und das Tier und die Dissektion Ausrüstung durch Besprühen mit 70 % igem Ethanol zu desinfizieren. Schneiden der ventralen Mittellinie mit standard sezierenden Scheren und Pinzetten und die Gebärmutter aus dem schwangere Ratte oder Maus zu extrahieren.
    9. Extrahieren von E18 – 19 Embryonen aus der Gebärmutter eines weiblichen narkotisierten Ratte oder Maus, mit zarten sezierenden Schere, und legen Sie die extrahierten Embryonen mit einem Ring-Zangen in eiskalten DMEM in einer 10 cm Petrischale für kalte Anästhesie.
    10. Enthaupten Sie den Embryo mit einer Schere fein Dissektion und legen Sie den Kopf in eiskalten DMEM in einer 10 cm Petrischale.
    11. Extrahieren Sie das Gehirn von jedem Embryo mit einem 13 cm gebogen Semken Zangen und Pinzetten mit feinen Spitzen. Halten Sie das Gehirn im eiskalten Dissektion Medium in einer 60 mm Schale.
    12. Entfernen Sie der Hippocampi, mit zwei Pinzetten mit feinen Spitzen, im eiskalten Dissektion Medium in 35 mm Schalen und pflegen Sie das isolierte Gewebe in der Inkubation Kochsalzlösung in einem 15 mL konische Röhrchen auf Eis gelegt.
    13. Die Hippocampi mit Inkubation Kochsalzlösung waschen und mit Trypsin (1,25 mg/mL) und DNase ich (0,25 mg/mL) in den Salinen Inkubation für 5 min bei 37 ° c inkubieren Das empfohlene Inkubation Volumen beträgt 2,7 mL die Inkubation Kochsalzlösung, 150 µL 20 x Lager Trypsin und 150 µL 20 X Lager DNase (siehe Tabelle der Materialien).
    14. Waschen Sie die Hippocampi 3 X mit eiskalten Inkubation Kochsalzlösung.
    15. Aspirieren Sie die Inkubation Kochsalzlösung und 1 mL des Mediums Beschichtung mit DNase ich (10 µL der Stammlösung; siehe Tabelle of Materials). Aussetzen Sie des Gewebes durch Pipettieren nicht mehr als 20 X und Messen Sie die Dichte der lebensfähigen Zellen, mit einer Zelle Zähler und Trypan blau-Assay.
    16. Verdünnen der hippocampalen Zellen zu einer Dichte von 1,4 x 105 lebensfähige Zellen/mL für Ratten und 2,5 x 105 lebensfähige Zellen/mL für Mäuse. Samen Sie 1 mL der verdünnten Zellsuspensionen auf den PEI-beschichtete Deckgläsern in Kultur 12-Well-Platten.
    17. Pflegen Sie die Zellen bei 37 ° C in einem CO2-Inkubator für 2 – 3 Tage.
    18. Die Beschichtung Medium zu entfernen. Lassen Sie sich nicht die Zellen austrocknen. Sanft und schnell hinzufügen das vorgewärmte Wartung Medium (siehe Tabelle der Materialien).
  4. Vorbereitung der Ratte kortikale Neuronen-Astrozyten gemischte Kultur und gefrorene Zellen und die Wiederbelebung der gefrorenen Kulturen
    Hinweis: Es war eine Kryokonservierung Methode für kortikale Zellen beschrieben previously11. Hier ist ein modifiziertes Protokoll in der kortikale Zellen bei-80 ° C für mindestens 3 Monate gelagert werden können zur Verfügung gestellt. Das Flussdiagramm für dieses Protokoll ist in Abbildung 2dargestellt.
    1. Bereiten Sie vor, DMEM, Präparation, Inkubation Kochsalzlösung, und Beschichtung Medium gemäß Schritte 1.3.1–1.3.4, und die Tabelle der Materialien.
    2. Bereiten Sie das Waschen Medium konstituiert DMEM, Hitze-inaktivierten fötalen Rinderserum und Penicillin-Streptomycin (siehe Tabelle der Materialien), falls erforderlich.
    3. Extrahieren Sie E18-19 Embryonen aus der Gebärmutter eines weiblichen narkotisierten Ratte oder Maus, mit zarten Dissektion Schere, und verwenden Sie Ring Zange, um jede extrahierte Embryo in eiskalten DMEM für kalte Anästhesie zu platzieren.
    4. Entfernen Sie die Gehirne von Embryonen und im eiskalten Dissektion Medium aufbewahren. Entfernen Sie die Cortexes und pflegen sie in der Inkubation Kochsalzlösung in einem 15 mL konische Röhrchen auf Eis gelegt.
    5. Waschen Sie die Cortexes mit Inkubation Kochsalzlösung und inkubieren Sie Cortexes mit Trypsin (1,25 mg/mL) und DNase I (0,25 mg/mL) Inkubation Kochsalzlösung für 5 min bei 37 ° C. Die empfohlene Inkubation für 12 Cortexes beträgt 5,4 mL Kochsalzlösung Inkubation, 300 µL 20 x Lager Trypsin und 300 µL 20 X Lager DNase ich.
    6. Waschen Sie die Cortexes 3 X mit eiskalten Inkubation Kochsalzlösung.
    7. Entfernen Sie den Überstand zu und fügen Sie 2 mL Beschichtung Medium ergänzt mit 150 µL DNase Lager. Distanzieren Sie die Zellen von weniger als 20 Schlägen pipettieren, und Filtern Sie die Zellen mit einer Zelle Sieb mit einer Porengröße von 70 µm.
    8. Waschen Sie die Zelle Sieb mit 20 mL des Mediums Beschichtung für Beschichtung. Für die Zubereitung von gefrorenen Zellen bestand, waschen Sie die Zellen mit 20 mL des Mediums zu waschen (siehe Tabelle der Materialien)
    9. Die Dichte der lebensfähigen Zellen, mit einer Zelle-Theke und die Trypan blau-Methode zu messen.
    10. Verdünnen Sie die kortikalen Zellen zu einer Dichte von 1,4 x 105 lebensfähige Zellen/mL mit dem Überzug-Medium und PEI-beschichtete Deckgläsern in die Kultur 12-Well-Platten fügen Sie 1 mL verdünnter Zellsuspension hinzu.
    11. Halten Sie die Zellen bei 37 ° C in einem CO-2 -Inkubator für 2 – 3 Tage und ändern Sie das Kulturmedium in Wartung-Medium.
    12. Bereiten Sie nach Schritt 1.4.9 den gefrorenen kortikalen Zelle bestand durch Zentrifugieren der Zellen bei 187 X g für 3 min mit einem Swing-Rotor.
    13. Den Überstand abgesaugt und fügen Sie die Kryokonservierung Medium (siehe Tabelle der Materialien) bei 4 ° C gehalten, um eine Zelldichte von 1 x 107 Zellen/mL zu erhalten. Aliquoten 1 mL Zellsuspension in Kryo Röhrchen.
    14. Platzieren Sie die Rohre in einer Zelle Einfrieren Behälter mit einer einfrierende Rate von-1 ° C/min, bis eine Temperatur von-80 ° C erreicht ist, und übertragen Sie den eiskalten Container auf-80 ° C Gefrierschrank. Die Zellen können für mindestens 3 Monate bei-80 ° c gelagert
    15. Um die gefrorenen Zellen wieder zu beleben, prewarm der Wäsche (ca. 13 mL für jedes Kryo Röhrchen) und Wartung Medium für gefrorene kortikalen Zellen (siehe Tabelle der Materialien).
    16. Tauen Sie die gefrorenen Zellen schnell bei 37 ° C in einem Wasserbad.
    17. Verdünnen Sie die aufgetauten Zellen sanft mit vorgewärmte waschen Medium. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 187 X g für 3 min mit einem Swing-Rotor.
    18. Auszusetzen Sie das Pellet in 1 mL Medium Wash und Messen Sie die tragfähige Zelldichte.
    19. Verdünnen Sie die Zellen mit dem Pflege-Medium für gefrorene kortikalen Zellen eine Zelldichte von 3,0 x 105 lebensfähige Zellen/mL und 1 mL Zellsuspension in PEI-beschichtete 12-Well Platten Samen liefern.

(2) Ausdruck der Membran-gezielte GECIs

  1. Transfektion von Zellen
    1. Fügen Sie 250 ng des Plasmids GECI (d. h. Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 oder OER-GCaMP6f mit CMV-Promoter)7,8,9 , 100 µL des Mediums reduzierte Serum (siehe Tabelle der Materialien) pro Bohrloch. Für die Cotransfection von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f, Einsatz 250 ng jeder Plasmids in 100 µL reduzierte Serum Medium in jede Vertiefung.
    2. Hinzufügen von 0,5 µL Transfection Reagens (siehe Tabelle der Materialien) pro Bohrloch in das Plasmid-reduzierte Serum mittlere Mischung. Fügen Sie für die Cotransfection von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f 0,5 µL Transfection Reagens pro Bohrloch.
    3. Inkubieren Sie die Mischung für 30 min bei Raumtemperatur (20 – 28 ° C).
    4. Jede Deckglas 100 µL der Mischung in einer drop-wise Art und Weise hinzufügen.
    5. Inkubieren Sie die Zellen für 48-72 h in einem CO2 Inkubator bei 37 ° C erlauben den Ausdruck der GECIs.
  2. Transfektion und Adeno-assoziierten Virus-Infektion des Hippokampus oder kortikale Neuronen
    Hinweis: Transfektion für 3 – 5 Tage in vitro (DIV) führt zu einer höheren Rate der Transfektion für Neuronen. Transfektion auf 6 – 8 DIV wird bevorzugt für den optimalen Ausdruck von GECIs in Astrozyten. Für den Ausdruck von GECIs in dissoziierten Kultur Neuronen nach 9 DIV stellt die Infektion der Adeno-assoziierte Virus (AAV) Vektoren eine bessere Wirksamkeit der Ausdruck. AAV-Vektoren für den Ausdruck von Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f unter der EF1a Promotoren vorbereitet wurden, wie zuvor beschrieben, mit HEK293 Zellen12 (siehe Tabelle der Materialien).
    1. Zur Transfektion 3 – 8 Tage nach der Beschichtung Label zwei Röhren, eine für Plasmid-DNA und die andere für Transfection Reagens.
    2. 50 µL reduzierte Serum Medium hinzufügen (siehe Tabelle der Materialien) pro Bohrloch um jedes Rohr.
    3. Fügen Sie 0,5 µg Plasmid DNA pro Deckglas und 1 µL Ergänzung begleitet von Transfection Reagens für Neuronen (siehe Tabelle der Materialien hinzu) pro Bohrloch der Plasmid-DNA-Röhre. Für die Cotransfection von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f werden 0,5 µg jedes Plasmid und 1 µL Ergänzung in 50 µL reduzierte Serum Medium pro Bohrloch gemischt.
    4. Fügen Sie 1 µL Transfection Reagens (siehe Tabelle der Materialien) pro Bohrloch im Transfection Reagens Rohr. Die gleiche Menge an Transfection Reagens wird für Cotransfection verwendet.
    5. Vortex beide Röhren für 1 – 2 s.
    6. Fügen Sie die Transfektion Reagenz Mischung (aus Schritt 2.2.4), das DNA-Gemisch (aus Schritt 2.2.3). Durch Pipettieren vorsichtig mischen und die Mischung (100 µL pro Deckglas) für 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    7. Laden Sie diese Mischung auf die Zellen in einer drop-wise Weise.
    8. 2 – 3 Tage, bis der Marker-Proteine exprimiert werden inkubieren Sie die Zellen in einem CO2 Inkubator.
    9. Fügen Sie 3 µL AAV pro Bohrloch AAV-Infektion hinzu die gemischte Neuron-Astrozyten Kultur. Mischen Sie durch Schaukeln die Schüssel vorsichtig. Für die doppelte Infektion von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f wird jedes AAV 3 µL pro Bohrloch eingeführt. Für den Fall, dass die Anzahl der Zellen mit dem Ausdruck GECIs nicht ausreichen, sollte die optimale Menge der AAV für Infektion bestimmt werden.
    10. Pflegen Sie die Kultur, für 1 – 2 Wochen, bis die GECIs ausgedrückt werden.

(3) Ca2 + Imaging

  1. Gleichzeitige Darstellung von Zellen mit dem Ausdruck Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f
    Hinweis: Sind gleichzeitig aufzeichnen die Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f Signale, Bild-splitting Optik erforderlich. Die Optik ermöglichen die Trennung von RCaMP2 und GCaMP6f und ihre Projektion auf die gleichen fotografischen Rahmen der Kamera (Abb. 3A). Simultane Bildgebung auch erfordert (1) Lichtquellen, die gleichzeitig Anregungslicht in blau (450-490 nm emittieren können) und grün (500-560 nm) Spektren, (2) Doppel-Band Filter und dichroitischen Spiegel setzt im Mikroskop und (3) Emission Filter für RCaMP2 und GCaMP6f. Einzelheiten finden Sie auf die Tabelle der Materialien.
    1. Aktivieren Sie die imaging-Geräte und Computer mindestens 30 min vor der Aufnahme. Prewarm das Mikroskop Heizung Kammer auf 37 ° C. Richten Sie die Bild-splitting Gerät, Filter und Lichtquelle. Richten Sie die Bild-splitting Optik so aus, dass die gleiche Sichtfeld auf der Kamera angezeigt wird. Wählen Sie das entsprechende Objektiv (siehe Tabelle der Materialien).
    2. Mount das Deckglas, enthalten die Zellen mit Lck-RCaMP2 transfiziert und OER-GCaMP6f in der Aufnahme-Kammer, fügen Sie die entsprechenden bildgebendes Medium oder Puffer (400 µL für 18 mm Deckgläsern) in der Kammer, und legen Sie es auf den Mikroskoptisch. Deckel auf die Aufnahme-Kammer, die Verdunstung des Mediums zu vermeiden.
    3. Suchen Sie die Zellen mit dem Ausdruck Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f durch Fluoreszenz-Bildgebung. Minimieren Sie die Erregung Lichtintensität um Immunofluoreszenz und Phototoxizität zu verhindern.
    4. Entfernen Sie den Deckel und starten Sie eine Zeitrafferaufnahme bei 10 Hz. Während dieser Aufnahme fügen Sie Agonisten an die Kammer, Ca2 + Antworten (z. B. Histamin für HeLa-Zellen, ATP für COS-7 Zellen) zu erwähnen hinzu.
    5. Die Zeitraffer-Daten in der Festplatte (HDD) speichern.
    6. Analysieren Sie die Daten mithilfe von Bildanalyse-Software.
  2. Spontane Aufnahmetätigkeit der Astrozyten Ausdruck Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f
    Hinweis: Ohne Bild-splitting Optik können die Ca2 + Signale an die Plasmamembran und Mitmenschen die ER in derselben Zelle überwacht werden. Hier ist die sequentielle Erfassung von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f in der gleichen Astrozyten beschrieben. Ein Öl-Immersion-Ziel mit einer numerischen Apertur größer als 1,3 ist empfehlenswert für spontane Ca2 + Aktivität.
    1. Schalten Sie das Mikroskop, Kamera, Lichtquelle und das Mikroskop Heizung Kammer mindestens 30 min vor der Aufnahme.
    2. Montieren Sie das Deckglas der Zellen mit Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f in der Aufnahme Kammer transfiziert und fügen Sie 400 µL des Mediums imaging hinzu. Legen Sie einen Deckel auf die Kammer.
    3. Wählen Sie den Filter set für GCaMP6f und der Lichtquelle (blaue Anregungslicht, z. B. 470– 490 nm; siehe Tabelle of Materials). Suchen Sie die Astrozyten OER-GCaMP6f zum Ausdruck zu bringen.
    4. Wählen Sie einen Filter-Set und die Lichtquelle für RCaMP2 (grüne Anregungslicht, z. B. 510 – 560 nm; siehe Tabelle of Materials) und bestätigen, ob Lck-RCaMP2 in der gleichen Astrozyten ausgedrückt wird. Vermeiden Sie lange die Lichtquelle, Immunofluoreszenz zu verhindern.
    5. Zeitraffer-Aufnahmen von Lck-RCaMP2 bei 2 Hz für 2 min. Speichern der Bilddaten auf der Festplatte.
    6. Ändern Sie den Filter stellen Sie für GCaMP6f. Zeitraffer-Aufnahmen von OER-GCaMP6f in der gleichen Sichtfeld bei 2 Hz für 2 min. sichern Sie die Daten auf der Festplatte.
    7. Analysieren Sie die Daten mit Hilfe der Bildanalyse-Software.
  3. Aufzeichnung von spontanen neuronalen Aktivität und induzierte Ca2 + Höhe in Neuronen
    Hinweis: Das Mikroskop-Setup für neuronale Bildgebung ist die gleiche wie die in Abschnitt 3.2 beschrieben. Hier ist die Darstellung der spontanen Ca2 + Höhe durch Lck-GCaMP6f und Ca2 + Höhe induziert durch mGluR-Aktivierung durch OER-GCaMP6f beschrieben.
    1. Um spontane neuronaler Aktivität aufzuzeichnen, montieren Sie das Deckglas, enthalten die Zellen mit dem Ausdruck Lck-GCaMP6f in der Aufnahme-Kammer zu und fügen Sie 400 µL von imaging-Medium. Legen Sie einen Deckel auf die Kammer.
    2. Soll der Filter und der Lichtquelle (blaue Erregung, z. B. 470 – 790 nm; siehe Tabelle of Materials) für GCaMP6f. Finden Sie die Neuronen mit dem Ausdruck Lck-GCaMP6f und spontane Aktivität zeigen.
    3. Bilder mit 2 Hz oder schneller zu erwerben. Speichern Sie die Daten auf der Festplatte.
    4. Analysieren Sie die Daten mit Hilfe der Bildanalyse-Software.
    5. Zum Aufzeichnen von induzierten Ca2 + Höhe montieren die Deckgläsern, enthalten die Zellen mit dem Ausdruck OER-GCaMP6f mit 400 µL Medium imaging. Legen Sie einen Deckel auf die Kammer.
    6. Mit dem Filter set für GCaMP6f, die Neuronen, die mit dem Ausdruck OER-GCaMP6f zu finden.
    7. Den Deckel abnehmen. Starten Sie die Zeitraffer-Aufnahme mit 2 Hz oder schneller. Während der Aufnahme hinzufügen die Agonisten für ein Gq-Protein-gekoppelten Rezeptoren (z. B. mGluR5 Agonist [RS] - 3,5 - Dihydroxyphenylglycine [DHPG]), eine Ca2 + Befreiung von der Notaufnahme zu erwähnen.
    8. Die Zeitraffer-Bilder auf der Festplatte speichern und analysieren der Daten.

Ergebnisse

LCK-RCaMP2 und OER-GCaMP6f wurden in HeLa-Zellen ausgedrückt, und beide Signale gleichzeitig mit Bild-splitting Optik, 24 h nach Transfektion (Abb. 3A und Video 1) aufgezeichnet wurden. Die Bilder wurden bei 10 Hz. Histamin (seiner 1 µM), die induziert Ca2 + Entlassung aus der Notaufnahme, wurde hinzugefügt, während der Aufnahme erworben. Auf Antrag seiner erhöht die Signalintensität von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f, dargestellt durch die Pseudofarben Anzeige von ΔF/F0, die die Änderung von der ursprünglichen Fluoreszenzintensität (Abb. 3 b) darstellt. Die Zeit-Kurse von Ca2 + Höhe (ΔF/F0) berichtet von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f wurden in der gleichen Region of Interest (ROI) (Abbildung 3) verglichen. Die ΔF/F0-Werte wurden auf ihre Spitzenwerte der Zeit Kurs Vergleich zwischen die zwei verschiedenen GECIs ermöglichen die verschiedenen Ausdruck Niveaus und Distributionen haben normalisiert. Beide Sensoren berichtet eine Schwingung wie Ca2 + Höhe. LCK-RCaMP2 und OER-GCaMP6f zeigte den gleichen zeitlichen Verlauf für Ca2 + Höhe in zwei Zellen unter den fünf Zelle Arten untersucht (Abbildung 3, ROI 1 und 3). Ca2 + Erhebungen gezeigt von Lck-RCaMP2 blieb jedoch auf einer höheren Ebene im Vergleich dazu von OER-GCaMP6f (Abb. 3 C, ROI, 2, 4 und 5) gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Ca2 + Höhe in der Nähe der Plasmamembran verlängert wird, während es früher um das ER gekündigt wird, welches ist die Quelle dieses Ca2 + Signal induziert durch seine Stimulation.

Spontane Ca2 + -Signale von Astrozyten in der Neuron-Astrozyten gemischte Kultur von Ratte Hippokampi (Abbildung 4A) und Cortexes (Abbildung 4 b) zeigten sich von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f (Abbildung 4, Video 2, Video 3 , 4 Videound Video 5). Kortikale Kulturen wurden aus dem gefrorenen bestand wieder belebt, die vorbereitet wurde, wie in diesem Protokoll beschrieben. LCK-RCaMP2 und OER-GCaMP6f Signale wurden nacheinander bei 2 Hz aus den gleichen Zellen aufgenommen. Drei ROIs in der Gegend, die Ca2 + Höhe zeigte von jedem GECI ausgewählt wurden, und der zeitlichen Verlauf der ΔF/FBasis (d. h. der Fluoreszenzintensität) geändert von der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität während der gesamten Aufzeichnungsdauer (FBasis ). Wenn die Basislinie Fluoreszenz stabil ist und Ca2 + Höhen seltener sind, wird FBasis eine nützliche Grundlage für Ca2 + Höhe-Ereignisse zu erkennen. Spontane Ca2 + Höhen waren sichtbar, nur bei den astrocytic Process, nicht an den Zellkörper. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit der früheren Berichten über astrocytic spontan Ca2 + Signale von anderen GECIs visualisierte in-vitro-13 und in-vivo-14. Im Hippokampus und kortikalen Astrozyten waren Ca2 + Erhebungen gezeigt von Lck-RCaMP2 (oben) häufiger als diejenigen von OER-GCaMP6f gezeigt. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit unserer früheren Demonstration, dass Ca2 + Erhebungen in Astrozyten durch Lck-GCaMP6f häufiger als die durch OER-GCaMP6f7 erkannt wurden und legt nahe, dass dieser Begriff auch auf die einzellige Ebene.

Spontane Ca2 + Höhen von Lck-GCaMP6f in unreifen Ratte hippocampal Neuronen (10 DIV) wurden bei 2 Hz (Abb. 5A und Video 6) gesehen. Die Zeit-Kurse von ΔF/F0 in fünf verschiedenen ROIs legen nahe, dass diese Ca2 + Erhebungen vor Ort auf der subzellulären Domänen beschränkt sind. Abbildung 5 b (Video 7) zeigt die Ca2 + Antworten in reife Maus hippocampal Neuronen (30 DIV) mit OER-GCaMP6f-Ausdruck AAV-Vektoren infiziert. Neuronen wurden mit 100 µM DHPG, stimuliert die Agonisten für metabotropen Glutamatrezeptoren, induzierende Ca2 + Release ist. DHPG-induzierte Ca2 + Freigabe durch OER-GCaMP6f wurde erkannt.

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Abbildung 1: Diagramm mit Membran-gezielte GECIs. Schematische Darstellung der Plasmamembran ausgerichtete GECIs (Lck-GCaMP6f und Lck-RCaMP2) und äußeren ER Membran-bezogenen GCaMP6f (OER-GCaMP6f).

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Abbildung 2: Flussdiagramm für hippocampal und kortikalen Zelle Vorbereitung, Plasmid Transfektion und AAV Infektion. Die mikroskopischen Aufnahmen sind repräsentativ, frisch vergoldeten DIV-6 kortikale Zellen (links) und Zellen aus dem gefrorenen bestand (rechts) wiederbelebt. Maßstabsleiste = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Abbildung 3: Beispiel für die gleichzeitige Darstellung von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f in HeLa-Zellen. (A) schematische Darstellung der Signaltrennung mit Bild-splitting-Optik. Die gleiche Sichtfeld für Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f wird gleichzeitig an der Kamera projiziert. Eine repräsentative Aufnahme erworben bei 10 Hz mit einer CMOS-Kamera finden Sie in Video 1, und ein Bild von dieser Aufnahme ist in zentrale A (rechts) angezeigt. (B) Pseudo-farbige Bilder von ΔF/F0 für Lck-GCaMP2 (oben) und OER-GCaMP6f (unten). Histamin (seiner, 1 µM) wurde am 0 S. (C) Vertreter normalisierten ΔF/F0 zeitlichen Verlauf der Lck-GCaMP2 (Magenta) und OER-GCaMP6f (grün) hinzugefügt. Daten wurden auf den maximalen ΔF/F0-Wert für jedes Grundstück normalisiert. Der graue Balken zeigt den Zeitpunkt seines Antrags. Daten wurden mit einer maßgeschneiderten Software TI Workbench15analysiert. Maßstabsleiste = 50 µm (mikroskopische Bild).  Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Abbildung 4: Spontane Ca2 + Höhe in Astrozyten überwacht Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f. (A) Vertreter hippocampal und (B) kortikale Astrozyten transfiziert mit Lck-RCaMP2 (oben) und OER-GCaMP6f (unten). Kortikale Zellen wurden aus gefrorenen Stammkulturen wiederbelebt. LCK-RCaMP2 und OER-GCaMP6f Bilder wurden nacheinander in derselben Zelle, bei 2 Hz mit einer EM-CCD Kamera erworben. Die Grundstücke auf dem linken erscheinen die Zeit Kurse von ΔF/Nutzun ROIs gemessen in das mikroskopische Bild angegeben. Daten wurden mit TI-Workbench analysiert. Aktuelle Filme werden in Video 2, Video 3 Video 4und 5 Videobereitgestellt. Die Maßstabsleiste = 20 µm (mikroskopische Bild). Die Baseline Drift schlägt die Änderungen in der globalen Ca2 + Ebene in der Zelle.  Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Abbildung 5: Beispiele für Ca2 + Bildgebung in Neuronen mit Lck-GCaMP6f und OER-GCaMP6f. (A) repräsentative Ratte hippocampal Neuronen Lck-GCaMP6f DIV 10 (links) und Grundstücke zeigt die Zeit, die Kurse von ΔF/F0 gemessen in ROIs (gelbe Kreise) angegeben worden im Bild (rechts) zum Ausdruck zu bringen. Die Zahlen in den zeitlichen Verlauf entsprechen die ROI-Zahlen im Bild. Beachten Sie, dass das zeitliche Muster der Ca2 + Höhe unterschiedlich zwischen den verschiedenen Regionen von Interesse ist. Die Baseline Drift schlägt die Erhöhung der globalen Ca2 + Ebene in diesem Neuron. (B) ein Beispiel für reife Maus hippocampal Neuronen (DIV 30) infiziert mit OER-GCaMP6f Ausdruck AAV Vektoren (links). Die Zeit, die Kurs-Plot von ΔF/F0 gemessen Ca2 + Antwort bis 100 µM zeigt angewendet (RS) - 3,5 - Dihydroxyphenylglycine (DHPG) auf das Timing durch die graue Leiste angezeigt. Gelbe Kreise zeigen die Position des ROIs, der zeitlichen Verlauf ermittelt wurden. Die Bilder wurden bei 2 Hz mit einer gekühlten CCD Kamera (zentrale A) oder einer EM-CCD-Kamera (Gruppe B) erworben und mit TI-Workbench analysiert. Maßstabsleiste = 20 µm (mikroskopische Bild). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Video 1: Beispiel für gleichzeitige Darstellung von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f in HeLa-Zellen. Repräsentative Aufnahme bei 10 Hz erworben und in Abbildung 3dargestellt. Maßstabsleiste = 50 µm.  Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.

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Video 2: Spontane Ca2 + Transient in Lck-RCaMP2 im Hippokampus Astrozyten beobachtet. Repräsentative Aufnahme erworben bei 2 Hz (Abb. 4A), aufgenommen im gleichen Sichtfeld als Video 3. Maßstabsleiste = 20 µm. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.

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Video 3: Spontane Ca2 + Transient in OER-GCaMP6f im Hippokampus Astrozyten beobachtet. Repräsentative Aufnahme bei 2 Hz (Abb. 4A), im gleichen Sichtfeld als Video 2erworben. Maßstabsleiste = 20 µm. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.

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Video 4: Spontane Ca2 + Transient in Lck-RCaMP2 in einer kortikalen Astrozyten beobachtet repräsentative Aufnahme erworben bei 2 Hz (Abbildung 4 b), aufgenommen im gleichen Sichtfeld als Video 5. Maßstabsleiste = 20 µm. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.

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Video 5: Spontane Ca2 + Transient beobachtet in OER-GCaMP6f in einer kortikalen Astrozyten. Repräsentative Aufnahme bei 2 Hz (Abbildung 4 b), im gleichen Sichtfeld als Video 4erworben. Die Maßstabsleiste = 20 µm. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.

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Video 6: Beispiel für Ca2 + Bildgebung in einem hippocampal Ratte Neuron (DIV 10) von Lck-GCaMP6f. Beispiel für neuronale Ca2 + -Signale aufgezeichnet bei 2 Hz (Abb. 5A). Maßstabsleiste = 20 µm. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.

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Video 7: Ca2 + Release in einem Maus hippocampal Neuron (DIV 30) mit dem Ausdruck OER-GCaMP6f. Beispiel für neuronale Ca2 + Signale aufgezeichnet in einem Maus hippocampal Neuron mit OER-GCaMP6f Ausdruck AAV Vektoren (Abb. 5 b) infiziert. Das Neuron wurde angeregt, mit 100 µM Dihydroxyphenylglycine (DHPG) angewendet um 30 s, Ca2 + Entlassung aus der Notaufnahme zu erwähnen. Maßstabsleiste = 20 µm. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.

Diskussion

Vielfältigen biologischen Ausgänge werden von Ca2 + Signale eingeleitet. Ca2 + ist ein vielseitiger intrazellulären Signal Bote. Decodierung Ca2 + Signale an bestimmte Ausgänge evozieren wurde eine grundlegende biologische Frage, und Ca2 + bildgebende Verfahren zu beschreiben, die Vielfalt der Ca2 + Signale sind erforderlich. Die derzeit ausführliche Protokoll ermöglicht die Erkennung von unterschiedlichen Ca2 + Signale an die Plasmamembran und ER (Abbildung 3 und Abbildung 4) und lokalen Ca2 + Microdomains innerhalb einer Zelle (Abbildung 4 und Abbildung 5). Dies trägt zu beschreiben die Vielfalt der intrazellulären Ca2 + Signale. Die zeitliche Auflösung von Ca2 + signalisiert wurde auch verbessert, durch gezielte GECIs in der Plasmamembran und ER, weil es kann die Wirkung von einer dreidimensionalen Diffusion von Ca2 + und GECIs selbst vermeiden, und es das Potenzial hat zu erkennen, die Augenblick der Ca2 + Zustrom oder Ca2 + Release, das auf der Membran auftritt.

Das Protokoll hat einige Einschränkungen. Benutzer sollten beachte bitte, dass die detektierten Signale die Summierung von "the Moment of Ca2 + Zustrom oder Release sind" und "Ca2 + verbreitet heraus aus der Originalquelle ca.2 +" , vor allem für große Ca2 + Signale. Zum Beispiel obwohl seine Anregung in HeLa-Zellen Ca evoziert befreien2 + die ER, seine daraus resultierende Ca2 + Signale, nicht nur indem ER gezielt OER-GCaMP6f, sondern auch durch Plasma-Membran-gezielte Lck-RCaMP2 (Abbildung 3 erkannt werden). Eine weitere Einschränkung ist, dass die räumlich-zeitliche Muster Ca2 + Signale möglicherweise nicht der einzige bestimmende Faktor der Leistung von Ca2 + Signale. Die Verteilung der nachgeschaltete Effektor-Proteine (z. B. Ca2 +-abhängigen Kinasen und Phosphatasen) kann auch ein bestimmender Faktor2. Um die intrazellulären Ca2 + Signale vollständig zu entschlüsseln, ist Analyse der nachgeschalteten Enzym Verhalten, die in diesem Protokoll nicht abgedeckt ist, absolut notwendig.

Einer der kritischsten Aspekte für erfolgreiche Ca2 + Imaging ist der bildgebenden Setup und Bild Erwerb Bedingungen, ebenso wie bei anderen live-Imaging-Studien. Bisher zeigten wir, dass Ca2 + Reaktionen in der Zelle auf die Dauer und Intensität der Erregung und Bild Erwerb Bedingungen, einschließlich Belichtung Zeit und Übernahme Frequenz16sehr angewiesen sind. Erregerleistung Beleuchtung ist der kritischste Faktor, da es leichte Toxizität und Immunofluoreszenz GECIs verursachen kann. Die Aufnahmebedingungen der Exposition Zeiterfassung, Frequenz, Anregung Intensität und Dauer der Aufnahme sollte nach dem Zweck des Experiments optimiert werden. Es wird empfohlen, die Belichtungszeit und die Erregung Lichtintensität Immunofluoreszenz und Phototoxizität zur Zelle zu vermeiden so weit wie möglich reduzieren. Die Aufnahmefrequenz und die Dauer der Aufnahme sollte ausreichen, um die Ca2 + Höhe Ereignisse von Interesse, aber sollte zur Vermeidung von Immunofluoreszenz und Phototoxizität auch möglichst gering gehalten werden. Wir empfehlen bestimmen zunächst die Aufnahmefrequenz und die Dauer und der Lichtintensität und der Belichtungszeit zu optimieren, so dass die Immunofluoreszenz die GECIs minimiert wird. Ein weiterer wichtiger Faktor ist der Ausdruck der GECIs. GECIs haben Ca2 +-Pufferung Wirkung sind Ca2 +-bindende Proteine. Daher führt die Überexpression von GECIs in die Pufferung von Ca2 +, die physiologisch notwendig ist für die Zellen. Die Höhe der GECI Ausdruck sollte zur Vermeidung von bildgebenden Zellen mit dem Ausdruck hoher Mengen an GECIs minimiert werden.
 
Zusammenfassend ist das Sezieren von Ca2 + Signale mit einer subzellulären Auflösung einer der wichtigsten Schritte für die Decodierung der intrazellulären Ca2 + Signale, die die Ausgabe biologisches Phänomen zu bestimmen. Dieses Protokoll bietet eine neue Methode für das Sezieren von Ca2 + Signale, die Vielfalt dieser Signale zu beschreiben. Derzeit beschränkt sich diese Technik für in-vitro-Experimente. Jedoch Lck-GCaMP6f dient bereits zur in-vivo Ca2 + Bildgebung bei Mäusen17und OER-GCaMP6f bestätigt wurde, um Ca2 + überwachen in vivo im VD motorischen Neuronen in C. Elegans7 signalisiert. Targeting GECIs subzelluläre Fach hat daher das Potenzial, erweitert werden, um in-vivo Bildgebung in der Zukunft so förderlichen Ca2 + Dissektion in-vivo.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wird unterstützt durch die folgende Zuschüsse: Japan Science and Technology Agency (JST) / Precursory Research für embryonale Wissenschaft und Technologie (PRESTO) (JPMJPR15F8, Japan); der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) / Stipendien an Hilfe für die wissenschaftliche Forschung (KAKENHI) (JP18H05414, JP17H05710, JP16K07316), Takeda Foundation. Die Autoren danken Haruhiko Bito (Universität Tokio) für die Bereitstellung von RCaMP2 und Arthur J.Y. Huang und Thomas McHugh (RIKEN CBS) für die AAV-Vektoren und Anweisungen bezüglich AAV Vorbereitung. Die Autoren möchten auch Editoren danken im Journal of visualisiert Experiments für ihre Hilfe mit video Dreh und Schnitt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
(RS)-3,5-Dihydroxyphenylglycin (DHPG)Tocris#0342
0,5% DNase I StammlösungSigma-Aldrich#112849320010,5% DNase I (w/v) in Hanks' Balanced Salt Solution herstellen  ergänzt mit 120 mM MgSO4. Vorbereiten 160 & Mikro; L aliquotiert und bei -30 °C lagern.
0,5% Trypsin-EDTA-LösungThermo Fisher Scientific#25300054
100 mM L-Glutamin (&mal; 100 Stock)Thermo Fisher Scientific#25030081Erstellung kleiner Aliquots von 250-750 & Mikro; L und bei -30 °C lagern.
100 mM Natriumpyruvat (&mal; 100 Lagerbestand)Thermo Fisher Scientific#11360070Aliquots (10 mL) können bei -20 °C gelagert werden. Nach dem Auftauen kann die Lösung bei 4 & Grad gehalten werden; C für 2 Monate.
12-Well-Multiwell-Kulturplatten mit Deckel mit geringer VerdunstungFalcon#353043Deckel mit geringer Verdunstung ist entscheidend für die Kultivierung von Neuronen-Glia-Mischkulturen. Für Zellen der Zelllinie können alternative Kulturschalen verwendet werden.
Runddeckgläser mit 18 mm DurchmesserKarl Hecht "Assistent"#41001118Stärke 1, 18 mm Durchmesser kreisförmige Deckgläser; es können auch andere Deckgläser verwendet werden.
1 M HEPESThermo Fisher Scientific#15630080pH 7,2-7,6
2,5% Trypsin-Stammlösung (&mal; 20 Lager)Sigma-Aldrich#T4674Prepare 150 µ L aliquotieren und bei -30 °C lagern.
50%ige Poly(ethylenimin) (PEI)-Lösung Sigma-Aldrich#P3143Bereiten Sie eine 2%ige (V/V) PEI-Stammlösung vor (& mal ; 50) mit destilliertem Wasser, das durch Filtration sterilisiert wird. Lagerlösung bei -30 & Grad; C nach der Herstellung kleiner Aliquots von 250-750 μl. 0,04%ige PEI-Lösung mit destilliertem Wasser am Tag der Deckglasbeschichtung herstellen.
70% EthanolIn einer Sprühflasche aufbewahrt, um zur Oberflächendesinfektion verwendet zu werden.
Adeno-assoziierte Viren (AAV) für die Lck-GCaMP6f-, Lck-RCaMP2- und OER-RCaMP2-Expression unter der Leitung des EF1a-PromotorsAAV können unter Verwendung des AAV Helper Free System (Agilent Technologies) und HEK293-Zellen oder alternativer Methoden hergestellt werden. pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2 und  pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f sind auf Anfrage erhältlich.
B-27 Zuschlag (× 50 Lager)Thermo Fisher Scientific#17504044Diese kann durch B-27 plus Supplement (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) oder MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland; #130-093-566) ersetzt werden.
B57BL/6Japan SLC, Inc.
Kamera für mikroskopische BildaufnahmeFolgende Kameras standen zur Verfügung: gekühlte CCD-Kamera (z.B. Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD-Kamera (z.B. Hamamatsu Photonics,  ImagEM; Andor, iXon) oder  CMOS-Kamera (z.B. Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)
Behälter zum Einfrieren von ZellenSarstedt K.K.#95.64.253Alternativer Zellen-Gefrierbehälter kann verwendet werden.
ZellsiebFalcon#352350
CO2 InkubatorBei 37 > halten C, 5 % CO2.
KryorohrCorning#430661Alternative Kryoröhrchen können verwendet werden.
KryokonservierungsmediumZenoaq"CELLBANKER1"
Kulturmedium (für HeLa-Zellen)von Dulbecco, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum und Penicillin-Streptomycin-Lösung (Endkonzentration: Penicillin 100 U/ml und Streptomycin 100 & Mikro; g/mL)
Präpariermedium Ein Milliliter 1 M HEPES (Endkonzentration 20 mM) auf 49 mL DMEM 
DMEMNacalai#08456-65Alternatives DMEM kann verwendet werden.
DMEMNacalai#08456-65mit niedrigem Glukosegehalt
Sigma-Aldrich#6366244001"X-tremegene HP DNA-Transfektionsreagenz"
Alternative Transfektionsreagenzien können verwendet werden.
Glas mit Deckel500 ml Glas (für Maus) oder 1.500 ml Glas (für Ratte) zur Betäubung des Tieres 
HBSSThermo Fisher Scientific#14170161HBSS frei von Calcium und Magnesium
Hitzeinaktiviertes RinderserumThermo Fisher Scientific#10100147 HeLa-Zellen
RIKEN BioResource Center#RCB0007
HistaminSigma-Aldrich#H7125
Bildanalyse-SoftwareWie Metamorph (Molecular Devices), ImageJ (NIH) und TI Workbench14 (Custom Made) 
BildteileroptikHamamatsu Photonics#A12801-01W-view GEMINI
Bildteileroptik dichroitischer SpiegelSemrock#FF560-FDi01-25&mal; 36Zur Trennung von grün fluoreszierendem Protein/rot fluoreszierendem Protein  (GFP/RFP) Signal
Bildaufteilungsoptik EmissionsfilterSemrock#FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25Für die Emission des GFP/RFP-Signals
Abbildungsmedium und PufferVerwenden Sie das optimale Medium oder den optimalen Puffer für das Experiment. Bei der Verwendung von Medium ist ein Medium ohne Phenolrot wünschenswert, um die Hintergrundfluoreszenz zu reduzieren. Fügen Sie 20 mM HEPES hinzu, um den pH-Wert außerhalb des CO2-Inkubators aufrechtzuerhalten.
Inkubationssalzlösung Fügen Sie 1 ml 1 M HEPES (20 mM) zu einem 49 mL HBSS
Inversen Fluoreszenzmikroskophinzu, z. B. IX73 (Olympus) oder  Eclipse TI (Nikon Instech)
IsofluranPfizerWird für die Anästhesie
verwendet Erhaltungsmedium (für 4 & 12 Well-Schalen)48,5 mL Neurobasal-A Medium ergänzt mit 1 mL B-27, 500 µ L L-Glutamin-Bestand und 25 & micro; L Penicillin-Streptomycin-Lösung.
Erhaltungsmedium für gefrorene kortikale Zellen (für 1- & 12-Well-Schalen) 12,2 mL Neurobasal plus Medium, ergänzt mit 250 & Mikro; L B-27, 125 µ L L-Glutamin-Bestand und 6,2 µ L Penicillin-Streptomycin-Lösung.
MEM (Minimum Essential Medium)Thermo Fisher Scientific#11090-081
Mikroskop-Filterset für GCaMP6f-BildgebungGeeigneter Filter für GFP (Anregung, 480 ± 10 nm; Emission, 530 ± 20 nm)
Mikroskop-Filterset für RCaMP2-BildgebungGeeigneter Filter für RFP (Anregung, 535 ± 50 nm; Emission, 590 nm Langpass)
Mikroskop-Filtersets für die Doppelabbildung von RCaMP2 und GCaMP6fSemrock#FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25&fach; 36, #FF01-512/630-25Dualer Anregungsfilter, Dualer dichroitischer Spiegel und Emissionsfilter für GFP/RFP-Bildgebung.
Mikroskop-HeizsystemEin Heizsystem, um die Zellen bei 37 ° C zu halten. C während der Bildgebung. Um Drift durch Wärmeausdehnung zu vermeiden, werden Heizsysteme empfohlen, die das gesamte Mikroskop selbst abdecken (z. B. Tokai Hit, Thermobox).
Mikroskop-Lichtquelle zur AnregungQuecksilberlampe (100 W), Xenonlampe (75 W), Leuchtdiode (LED) Beleuchtungssystem (z. B. CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4-Wellenlängen-LED-Quelle; Lumencor, SPECTRA X Light Engine). Im Falle von Quecksilberklumpen und Xenonlampen verwenden Sie einen ND-Filter, um die Anregungsintensität zu reduzieren.
DasPlan-Apochromat Öl-Immersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von mehr als 1,3 wird dringend für die Aufzeichnung der spontanen Ca2+-Aktivität in Neuronen und Astrozyten empfohlen.
Neurobasal plus mediumThermo Fisher Scientific#A3582901
Neurobasal-A mediumThermo Fisher Scientific#10888022Neurobasal plus medium (Thermo Fisher, A3582901) kann anstelle von Neurobasal-A Medium verwendet werden.
PBS(-): Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, frei von Ca2+ und Mg2+ Fujifilm Wako Pure Chemical Cooperation#164-23551Das Fehlen von Ca2+ und Mg2+ ist entscheidend, um die Trypsinaktivität nicht zu hemmen. Eine Alternative zu PBS(-) kann verwendet werden.
PC- und Bilderfassungssoftwarewie Metamorph (Molecular Devices); Mikromanager; TI Workbench14.
Penicillin-Streptomycin-LösungThermo Fisher Scientific#15140122Penicillin 10.000 U/ml und Streptomycin 10.000 & Mikro; g/mL 
Plasmid für die Expression von Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 und OER-RCaMP2 unter dem Cytomegalievirus-Promotor 7-9Auf Anfrage erhältlich
)48 mL MEM, ergänzt mit 1 mL B-27 Supplement, 500 µ L L-Glutamin Bestand (Endkonzentration: 2 mM), 500 µ L Natriumpyruvat-Stamm (1 mM) und 25 µ L Penicillin-Streptomycin-Lösung (Penicillin 5 U/ml, Streptomycin 5 & Mikro; g/mL). Diese Konzentration von Penicillin-Streptomycin, die 1/20 von  Die vom Hersteller empfohlene Konzentration ist entscheidend für das Überleben der Neuronen.
AufnahmekammerElveflowLudin-KammerDiese Aufnahmekammer ist für runde Deckgläser mit einem Durchmesser von 18 mm.
Reduziertes SerummediumThermo Fisher#11058021Opti-MEM
StereomikroskopWird zum Präparieren von Hippocampus verwendet. Olympus SZ60 oder gleichwertige Stereomikroskope sind erhältlich.
Chirurgische InstrumenteStandard-Präparierschere zum Schneiden des Bauches einer Maus oder Ratte, Pinzette zum Einklemmen der Gebärmutter, feine Präparierschere zum Durchtrennen der Gebärmutter und des Kopfes des Embryos, Ringzange zum Einklemmen der Embryonen, 13 cm gebogene Semken-Zange (Fine Science Tools #11009-13) zur Entnahme von Gehirnen  3 Pinzetten mit feinen Spitzen  (Dumont Inox #5)
Transfektionsreagenz für NeuronenThermo Fisher Scientific#L3000008"Lipofectamine 3000" Reagenz.
Es besteht aus dem "Supplement (P3000)", das in Schritt 2.2.3 mit Plasmid-DNA gemischt werden sollte, und dem "Transfektionsreagenz (Lipofectamine 3000)", das in Schritt 2.2.4 verwendet wird.
Trypanblau (0,4%)Thermo Fisher Scientific#15250061
Waschmedium für gefrorene kortikale Zellen 25 mL DMEM, ergänzt mit 250 & micro; L hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum + 12,5 µ L Penicillin Streptomycin.
Wistar RattenJapan SLC, IncTrächtige Ratten (E18)
Das modifizierte Eagle-Medium (DMEM) DNA-Transfektionsreagenz Plattierungsmedium (für 4- & 12-Well-Gerichte

Referenzen

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Calcium Imaginggenetisch kodierte IndikatorenOER GCaMP6fLck RCaMP2berwachung des Calcium InfluxesDetektion der Calcium FreisetzungImaging mit subzellul rer Aufl sungZellkultur TransfektionZeitraffer Mikroskopie

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