Methodenartikel

Visualisierung von der okulären Sulcus Superior in der Embryogenese Danio rerio

DOI:

10.3791/59259

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27. März 2019

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1Department of Biological Sciences, University of Alberta, 2Women & Children's Health Research Institute, University of Alberta, 3Division of Anatomy, Department of Surgery, University of Alberta, 4Department of Cell Biology, University of Alberta, 5Department of Medical Genetics, University of Alberta, 6Neuroscience and Mental Health Research Institute, University of Alberta

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier präsentieren wir eine standardisierte Reihe von Protokollen, die überlegene okuläre Sulcus zu beobachten eine kürzlich identifiziert, evolutionär konservierte Struktur in den Augen der Wirbeltiere. Verwendung von Zebrafischlarven zeigen wir Techniken notwendig, Faktoren zu identifizieren, die auf die Gründung und Schließung der überlegenen okuläre Sulcus beitragen.

Zusammenfassung

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Angeborene okulären Kolobom ist eine genetische Erkrankung, die in der Regel als eine Spalte in der minderwertigen Aspekt des Auges infolge unvollständiger choroid Fissur Schließung beobachtet wird. Vor kurzem genannt die Identifikation von Personen mit Kolobom in der überlegene Aspekt der Iris, Netzhaut und Linse führte zur Entdeckung einer neuen Struktur, die überlegene Fissur oder überlegene okuläre Sulcus (SOS), die vorübergehend auf die dorsale vorhanden ist Aspekt der Optik-Cup während der vertebrate Augenentwicklung. Obwohl diese Struktur über Mäuse, Küken, Fisch und Newt konserviert ist, beschränkt sich unser heutiges Verständnis des SOS. Um Faktoren aufzuklären, die zu seiner Entstehung und Schließung beitragen, ist es unerlässlich, dass man es beobachten und erkennen Anomalien, wie Verzögerung bei der Schließung der SOS. Hier wollten wir eine standardisierte Reihe Protokolle erstellen, die verwendet werden, um effizient die SOS visualisieren durch die Kombination von allgemein verfügbaren Mikroskopiertechniken mit gemeinsamen molekularbiologische Techniken wie immunofluorescent Färbung und mRNA Überexpression. Während dieser Reihe von Protokollen konzentriert sich auf die Fähigkeit, SOS Verschluss Verzögerung zu beobachten, es ist anpassbar an die Bedürfnisse der Experimentator und kann leicht geändert werden. Alles in allem hoffen wir, eine zugängliche Methode zu erstellen, durch die unser Verständnis von der SOS vorangebracht werden kann, um das aktuelle Wissen der vertebrate Augenentwicklung zu erweitern.

Einleitung

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Die Bildung des vertebrate Auges ist ein hoch konservierte Prozess in dem sorgfältig orchestrierten interzelluläre Signalwege Gewebetypen zu etablieren und regionale Identität1angeben. Störungen zu frühen Auge Morphogenese häufig2Blenden und tiefgreifende Mängel an die Architektur des Auges führen. Einer solchen Krankheit ergibt sich aus der Nichtbeachtung der Aderhaut okulären Riss in der ventralen Seite des Optik-Cup3schließen. Diese Störung, bekannt als okulären Kolobom wird voraussichtlich auftreten bei 1 von 4-5000 Lebendgeburten und Ursache 3-11 % der pädiatrischen Blindheit, gemeinhin als e....

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Protokoll

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Alle hier beschriebene Methoden wurden von der University of Alberta Animal Care and Use Committee genehmigt.

1. Protokoll 1: Visualisierung von SOS Stereomikroskopie mit differential Interferenz Kontrast (DIC) Bildgebung

  1. Embryo-Sammlung
    1. Bereiten Sie in einem Tank ungechlortem Wasser Kreuze gdf6a+ / Zebrafisch am Abend durch die Kombination einer männlichen Zebrafisch mit einem weiblichen Zebrafisch. Achten Sie darauf, das Weibchen das Männchen trennen, mithilfe einer Trennlinie um sicherzustellen, dass die Embryonen innerhalb eines kleinen Bereichs der Zeit geboren werden.
    2. Am nächsten Morge....

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Ergebnisse

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Der Zebrabärbling SOS erscheint um 20 Uhr hpf in der mutmaßlichen dorsalen Netzhaut-8. Von 23 hpf SOS Übergänge von seiner ursprünglichen engen Architektur auf einen breiten Einzug und 26 hpf-es ist nicht mehr sichtbar8. Daher, um die SOS während der normalen Zebrafisch Augenentwicklung zu untersuchen, die Embryonen zwischen 20-23 hpf einzuhalten. Während dieser Zeit ist die SOS zu beobachten, durch die sezierenden Mikroskop und mittels DIC .......

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Diskussion

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Hier präsentieren wir Ihnen eine standardisierte Reihe von Protokollen, die SOS im sich entwickelnden Zebrafischembryo zu beobachten. Ermitteln, Schließung Verzögerung Phänotypen, konzentrierten sich unsere Protokolle auf die Fähigkeit, die Trennung von zwei diskreten Lappen der dorsalen Nasal und dorsal-zeitliche Seiten des Auges, vergleichbar mit Techniken zur Aderhaut Fissur Verschluss Verzögerung visualisieren unterscheiden in den Augen der ventralen Phänotypen.

Diese Visualisierungs-Techn.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine widerstreitenden Interessen zu erklären.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde von kanadischen Institute der Gesundheit Forschung (CIHR), Naturwissenschaften und Engineering Research Council (NSERC), Alberta innoviert Technologie Futures, und Frauen und Kinder Health Research Institute (WCHRI) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1-Phenyl-2-ThioharnstoffSigma AldrichP7629-10G
100 mm PetrischaleFisher ScientificFB0875713
35 mm PetrischaleCorningCLS430588
AgaroseBioShop Canada Inc.AGA001.1
RinderserumalbuminSigma AldrichA7906-100G
DIC/FluoreszenzmikroskopZeissAxioImager Z1
DissektionsmikroskopOlympusSZX12
Dissektionsmikroskop KameraQimagingMicroPublisher 5.0 RTV
Dow Corning HochvakuumfettFisher Scientific14-635-5D
Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonat-Salz (Tricain)Sigma AldrichA5040-25G
Ziege Anti-Kaninchen Alexa Fluor 488Abcamab150077
ZiegenserumSigma AldrichG9023
BilderfassungssoftwareZeissZEN
InkubatorVWRModell 1545
Mikroskop-Deckglas (22 mm x 22 mm)Fisher Scientific12-542B
ObjektträgerFisher Scientific12-544-2
MinutienPin Fine Science Tools26002-10
mNachricht mMachine Sp6 TranskriptionskitInvitrogenAM1340
NotINew England BiolabsR0189S
Paraformaldehyd ( PFA)Sigma AldrichP6148-500G
Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol pH 6,7 +/- 0,2Fisher ScientificBP1752-100
Proteinase KSigma AldrichP4850
Kaninchen Anti-Laminin-AntikörperMillipore SigmaL9393
TURBO Dnase (2 U/µ L)InvitrogenAM2238
Ultrareine Agarose mit niedrigem SchmelzpunktInvitrogen16520-100
Ultrareines Natriumdodecylsulfat (SDS)Invitrogen15525017

Referenzen

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  1. Chow, R. L., Lang, R. A. Early eye development in vertebrates. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, (2001).
  2. Slavotinek, A. M. Eye development genes and known syndromes. Molecular Genetics and Metabolism. 104 (448-456), (2011).
  3. Gr....

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Schlagwörter

ZebrafischembryogeneseImmunfluoreszenzf rbungmRNA berexpressionDifferenzialinterferenzkontrastKonfokalmikroskopieStereomikroskopieLamininf rbungGFP CAX ExpressionVerz gerung des SOS Verschlusses

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