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Methodenartikel

Visualisierung von der okulären Sulcus Superior in der Embryogenese Danio rerio

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DOI:

10.3791/59259

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27. März 2019

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1Department of Biological Sciences, University of Alberta, 2Women & Children's Health Research Institute, University of Alberta, 3Division of Anatomy, Department of Surgery, University of Alberta, 4Department of Cell Biology, University of Alberta, 5Department of Medical Genetics, University of Alberta, 6Neuroscience and Mental Health Research Institute, University of Alberta

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir eine standardisierte Reihe von Protokollen, die überlegene okuläre Sulcus zu beobachten eine kürzlich identifiziert, evolutionär konservierte Struktur in den Augen der Wirbeltiere. Verwendung von Zebrafischlarven zeigen wir Techniken notwendig, Faktoren zu identifizieren, die auf die Gründung und Schließung der überlegenen okuläre Sulcus beitragen.

Zusammenfassung

Angeborene okulären Kolobom ist eine genetische Erkrankung, die in der Regel als eine Spalte in der minderwertigen Aspekt des Auges infolge unvollständiger choroid Fissur Schließung beobachtet wird. Vor kurzem genannt die Identifikation von Personen mit Kolobom in der überlegene Aspekt der Iris, Netzhaut und Linse führte zur Entdeckung einer neuen Struktur, die überlegene Fissur oder überlegene okuläre Sulcus (SOS), die vorübergehend auf die dorsale vorhanden ist Aspekt der Optik-Cup während der vertebrate Augenentwicklung. Obwohl diese Struktur über Mäuse, Küken, Fisch und Newt konserviert ist, beschränkt sich unser heutiges Verständnis des SOS. Um Faktoren aufzuklären, die zu seiner Entstehung und Schließung beitragen, ist es unerlässlich, dass man es beobachten und erkennen Anomalien, wie Verzögerung bei der Schließung der SOS. Hier wollten wir eine standardisierte Reihe Protokolle erstellen, die verwendet werden, um effizient die SOS visualisieren durch die Kombination von allgemein verfügbaren Mikroskopiertechniken mit gemeinsamen molekularbiologische Techniken wie immunofluorescent Färbung und mRNA Überexpression. Während dieser Reihe von Protokollen konzentriert sich auf die Fähigkeit, SOS Verschluss Verzögerung zu beobachten, es ist anpassbar an die Bedürfnisse der Experimentator und kann leicht geändert werden. Alles in allem hoffen wir, eine zugängliche Methode zu erstellen, durch die unser Verständnis von der SOS vorangebracht werden kann, um das aktuelle Wissen der vertebrate Augenentwicklung zu erweitern.

Einleitung

Die Bildung des vertebrate Auges ist ein hoch konservierte Prozess in dem sorgfältig orchestrierten interzelluläre Signalwege Gewebetypen zu etablieren und regionale Identität1angeben. Störungen zu frühen Auge Morphogenese häufig2Blenden und tiefgreifende Mängel an die Architektur des Auges führen. Einer solchen Krankheit ergibt sich aus der Nichtbeachtung der Aderhaut okulären Riss in der ventralen Seite des Optik-Cup3schließen. Diese Störung, bekannt als okulären Kolobom wird voraussichtlich auftreten bei 1 von 4-5000 Lebendgeburten und Ursache 3-11 % der pädiatrischen Blindheit, gemeinhin als ein Schlüsselloch-artige Struktur, die inferior aus der Pupille in der Mitte des Auges4ragt manifestieren, 5,6. Die Funktion der Aderhaut Fissur soll stellen einen Einstiegspunkt für frühen Gefäßsystem Hineinwachsen in den Optik-Cup, danach werden die Seiten des Risses Sicherung um die Schiffe7umschließen.

Während okulären Kolobom seit der Antike bekannt ist, haben wir vor kurzem eine neue Untergruppe von Kolobom Patienten mit Gewebeverlust beeinflussen den Superior/dorsalen Aspekt des Auges identifiziert. Neuere Arbeiten in unserem Labor führte zur Entdeckung einer okulären Struktur im Zebrafisch dorsalen Auge, die wir als die überlegene okuläre Sulcus (SOS) oder überlegene Fissur8bezeichnen. Es ist wichtig zu beachten, dass die Struktur verfügt über Eigenschaften von einem Sulcus und ein Riss. Ähnlich wie bei einem Sulcus, ist es eine ständige Gewebeschicht, die sich aus der Nasal der zeitlichen Netzhaut erstreckt. Darüber hinaus die Schließung der Struktur wird nicht durch eine Fusion der beiden gegnerischen Basalmembran vermittelt, und es scheint einen morphogenetischen Prozess zu verlangen, mit dem die Struktur von Zellen besiedelt ist. Jedoch ähnlich wie ein Riss, bildet es eine Struktur, die die nasalen und temporalen Seiten des dorsalen Auges mit der Basalmembran trennt. Aus Konsistenzgründen werden wir bezeichnen es als SOS in diesem Text.

Die SOS ist evolutionär über Wirbeltiere, wobei sichtbar, während Auge Morphogenese in Fische, Küken, Molch und Maus8erhalten. Im Gegensatz zu der Aderhaut Fissur, die von 20 bis 60 Stunden nach Befruchtung (hpf) im Zebrafisch vorhanden ist, die SOS ist sehr flüchtig, wird gut sichtbar von 20-23 hpf und abwesend von 26 hpf-8. Neuere Forschungen in unserem Labor hat festgestellt, dass ähnlich wie bei der Aderhaut Fissur, die SOS eine Rolle bei vaskulären Führung während Auge Morphogenese8 spielt. Obwohl die Faktoren, die die Gründung und Schließung der SOS noch nicht vollständig verstanden sind, unsere Daten für dorsal-Ventral Auge Musterung Gene8Rollen markieren.

Zebrafisch ist eine ausgezeichnete Modellorganismus der SOS zu studieren. Als Modellsystem, bietet es eine Reihe von Vorteilen bei der Untersuchung der Augenentwicklung: Es ist ein Wirbeltier Modell; Jede Generation weist hohe Fruchtbarkeit (~ 200 Embryonen); seines Genoms wurde vollständig sequenziert, erleichtert die Genmanipulation; und etwa 70 % der menschlichen Gene haben mindestens ein Zebrafisch orthologs, so dass es ein ideales Genetik-basierte Modell der menschlichen Krankheit9,10. Vor allem seine Entwicklung erfolgt extern an die Mutter, und seine Larven sind transparent, wodurch für die Visualisierung des dritten Auges mit relativer Leichtigkeit11.

In dieser Reihe von Protokollen beschreiben wir die Techniken, durch die die SOS im Zebrafischlarven visualisiert werden kann. Die Vielfalt der Visualisierungs-Techniken, die in diesem Bericht verwendeten ermöglicht klare Beobachtung von SOS während der normalen Augenentwicklung sowie die Fähigkeit, SOS Schließung Mängel zu erkennen. Unsere Beispiel-Protokolle werden Untersuchungen von Gdf6, einem BMP in dorsal lokalisiert Auge und bekannten Regulator der SOS-Verschluss. Darüber hinaus können diese Techniken mit experimentellen Manipulationen zu identifizieren genetische Faktoren oder pharmakologische Wirkstoffe, die richtige SOS-Gründung und Schließung beeinflussen kombiniert werden. Darüber hinaus haben wir ein Protokoll durch die fluoreszente-Bildgebung aller Zellmembranen möglich ist, so dass des Experimentators, morphologische Veränderungen an den Zellen rund um den SOS zu beobachten aufgenommen. Unser Ziel ist es, eine Reihe von standardisierten Protokollen zu etablieren, die in der wissenschaftlichen Gemeinschaft verwendet werden können, bieten neue Einblicke in diese neuartige Struktur des dritten Auges.

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Protokoll

Alle hier beschriebene Methoden wurden von der University of Alberta Animal Care and Use Committee genehmigt.

1. Protokoll 1: Visualisierung von SOS Stereomikroskopie mit differential Interferenz Kontrast (DIC) Bildgebung

  1. Embryo-Sammlung
    1. Bereiten Sie in einem Tank ungechlortem Wasser Kreuze gdf6a+ / Zebrafisch am Abend durch die Kombination einer männlichen Zebrafisch mit einem weiblichen Zebrafisch. Achten Sie darauf, das Weibchen das Männchen trennen, mithilfe einer Trennlinie um sicherzustellen, dass die Embryonen innerhalb eines kleinen Bereichs der Zeit geboren werden.
    2. Am nächsten Morgen ziehen Sie die Trennlinie und erlauben Sie dem Zebrafisch, für nicht mehr als 30 min. sammeln die Embryonen in Petrischalen mit E3 Media, beschrieben in The Zebrafish Buch12, zu züchten und legen Sie sie in einem Inkubator 28,5 ° C.
    3. Entfernen Sie alle unbefruchtete Eier oder Toten Embryonen, die weiß und undurchsichtig erscheint.
  2. Vorbereitung und live-Imaging von Zebrafisch-Embryonen
    1. Um 20 Uhr hpf, ersetzen die E3 Medien mit E3 Media mit 0,004 % 1-Phenyl-2-Thioharnstoff (PTU), Pigment-Produktion zu verhindern.
      Hinweis: Zugabe von PTU in einer etwas späteren Timepoint wie 22-24 hpf, ist unwahrscheinlich, dass das Experiment aufgrund des frühen Alters der Embryonen zum Zeitpunkt der Bildgebung stören. Es wird jedoch empfohlen, die Embryonen früh zu behandeln, um vollständig Pigmentierung zu verhindern, da gibt es eine Band der Pigmentierung, die in den Augen der dorsalen angezeigt wird, die mit der SOS-Bildgebung stören können.
    2. Sicherzustellen Sie, dass alle Embryonen auf die richtige Entwicklungsstadien an verschiedenen Stellen im Vorfeld zu der Zeit der Beobachtung. Es wird empfohlen, dass dies in den Phasen die Somiten Anzahl deutlich sichtbar erfolgt wie Kimmel Et Al.13beschrieben ist. Entfernen Sie die, die entwicklungsgeschichtlich unreif sind.
    3. Legen Sie die Embryonen unter dem sezierenden Mikroskop und Dechorionate die Embryonen durch vorsichtig Auseinanderziehen der Chorion mit feinen Pinzette. Visualisieren Sie SOS im dorsalen Auge. Die SOS erscheinen als eine Einbuchtung am dorsalen Rand des Auges, und eine Linie über die dorsale Auge sichtbar sein soll. Für normale SOS-Verschluss, beobachten die Embryonen bei rund 20-23 hpf. Für die Prüfung der verzögerten SOS Schließung Phänotypen, beobachten die Embryonen bei 28 hpf oder später.
    4. Die Embryonen, die SOS Verschluss Verzögerung von denen zeigen, die nicht zu sortieren.
    5. Um diese Embryonen mit einem sezierenden Mikroskop zu fotografieren, bereiten Sie eine Petrischale mit 1 % Agarose in E3. Stechen Sie leicht das Zentrum der Agarose, ein flaches Loch zu schaffen, in dem das Eigelb des Embryos sitzen kann, wenn der Embryo in der Agarose platziert wird. Dadurch wird sichergestellt, dass der Embryo nicht schräg ist, wenn fotografiert wird.
    6. Embryonen mit 0,003 % Tricaine in E3 und seitlich auf die Agarose zu betäuben.
    7. Um die Embryonen mit einem zusammengesetzten oder confocal Mikroskop Bild, Übertragung des Embryos in 35 mm Petrischale mit einem kleinen Bolus nicht geliert 1 % niedrig schmelzende Punkt Agarose in E3 (w/V). Schnell positionieren Sie den Embryo seitlich mit einem feinen Angelschnur oder Wimper zu und warten Sie, bis die Agarose abkühlen. Sobald die Agarose fest ist, Gießen Sie genug E3 in das Gericht zur Deckung der Agarose. Für weitere Details siehe Distel und Köster14.
      Hinweis: Wenn einem inversen Mikroskop verwenden, der Embryo kann gegen das Glas ein Glasboden Deckglas Teller gelegt und mit standard 20 X Objektiv Objektiv abgebildet.
    8. Verwenden Sie ein Wasser eintauchen 20 X Objektiv, um SOS mit einem Compound-Mikroskop zu visualisieren. Ziehen Sie nach Visualisierung die Agarose von Embryonen und in 4 % Paraformaldehyd (PFA) zu beheben Sie oder erlauben Sie, ihre Entwicklung fortzusetzen.

2. Protokoll 2: Gesamte-Mount immunofluorescent Färbung des laminin

  1. Vollständig-hängen immunofluorescent Färbung des Laminin: Tag1
    1. Dechorionate Embryonen wie in Schritt 1.2.3, beschrieben, falls noch nicht geschehen. Beheben von Embryonen in einem Microcentrifuge Schlauch auf die gewünschte Timepoint in frisch zubereiteten 4 % PFA für 2 h auf Raumtemperatur (22-25 ° C) Shaker. Waschen, in 1 X PBST für 5 min, viermal.
      Hinweis: Nach der Gastrulation, können Embryonen besser nach Dechorionation festsetzen.
    2. Permeabilize Embryonen in 10 mg/mL Proteinase K bei Raumtemperatur für das Entwicklungsstadium 5 min. Inkubationszeit hängt an dem die Embryonen werden fixiert (siehe Thisse und Thisse15).
    3. Waschen, in 1 X PBST für 5 min, viermal.
    4. Embryonen in einer Lösung von 5 % Ziege Serum und 2 mg/mL Rinderserumalbumin (BSA) in 1xPBST für 1-2 h auf Raumtemperatur Shaker zu blockieren.
    5. Bereiten Sie Primärantikörper Lösung durch Verdünnung Kaninchen-Anti-Laminin-Antikörper in Block-Lösung bei einer Verdünnung von 1: 200.
    6. Inkubieren Sie die Embryonen in Anti-Laminin Primärantikörper Übernachtung im Shaker 4 ° C.
  2. Vollständig-hängen immunofluorescent Färbung des Laminin: Tag2
    1. Waschen, in 1 X PBST für 15 min, fünfmal.
    2. Bereiten Sie Sekundärantikörper Lösung durch Verdünnung Ziege-Anti-Kaninchen-Alexa Fluor 488-Antikörper in 1 X PBST zu einer Verdünnung von 1: 1000.
      Hinweis: Es ist möglich, diesen Schritt, um die verfügbaren Ressourcen der Experimentator Anzug mit verschiedenen Sekundärantikörper anzupassen.
    3. Inkubieren Sie die Embryonen in Sekundärantikörper Übernachtung im Shaker 4 ° C. Schützen Sie vor Licht, so viel wie möglich von diesem Schritt ab.
    4. Waschen, in 1 X PBST für 15 min, viermal. Die Embryonen können bei 4 ° C bis zu einer Woche, bei Bedarf gespeichert werden.
  3. Zerlegung und Montage des embryonalen Augen
    1. Falls gewünscht, die Embryonen in eine kleine Petrischale und deyolk die Embryonen in 1 X PBST. Zu diesem Zweck sanft stören das Eigelb mit feinen Zangen und Entfernen der Eigelb-Zellen durch milde Schaben von dem Dottersack.
    2. Die folgenden Konzentrationen von PBS-Glycerin Serienlösungen in Mikrozentrifugenröhrchen vorbereiten: 30 %, 50 % und 70 % Glycerin in PBS. Transferieren Sie die Embryonen in 30 % Glycerin/PBS, sicherstellen, dass die Embryonen auf die Lösung und die Übertragung so wenig von der vorherigen Lösung wie möglich platzieren. Warten Sie, bis die Embryonen an der Unterseite des Rohres zu versenken.
    3. Wenn Embryonen nach unten versenkt haben, übertragen Sie sie auf 50 % Glycerin/PBS. Wiederholen Sie und übertragen Sie auf 70 % Glycerin/PBS.
    4. Sobald die Embryonen in 70 % Glycerin/PBS versenkt haben, verschieben Sie sie in einer kleinen Plastikschale für Sezierungen.
    5. Trennen des Embryos nach dem Hinterhirn, und der hintere Gewebe für die Genotypisierung, verwenden, wenn nötig.
    6. Bewegen Sie den Kopf auf einen Objektträger übertragen als wenig Glycerin wie möglich. Verwenden Sie Zange oder anderen feinen Dissektion Tools auf das hintere Ende des Kopfes stationär zu halten halten. Verwenden Sie eine feine Minutien Pin oder andere feine Dissektion Tools sanft in das Vorderhirn Ventrikel aus der vorderen einfügen und drücken Sie nach unten, um die linken und rechten Hälften des Kopfes von einander zu trennen. Wiederholen Sie diesen Vorgang während der Bewegung nach hinten durch das Mittelhirn und in dem Hinterhirn Ventrikel, im wesentlichen fileting der Kopf der Mittellinie. Dies minimiert die manuelle Manipulation des Auges und umliegende Gewebe, wodurch die SOS unbeschädigt.
    7. Jede Seite der Kopf Mittellinie nach unten Auge oben anbringen. Position vier Beiträge Vakuum Fett an den Ecken (einen entsprechenden Abstand für das Deckglas verwendet wird) und mit einem Glas Deckgläschen abdecken, drücken Sie nacheinander auf jeden Post bis das Deckglas nimmt Kontakt mit den Proben. 70 % Glycerin am Rande des Deckglases Pipette, so dass das Glycerin darunter gezogen wird, füllt den Raum zwischen dem Deckglas und der Folie.
    8. Bild Proben innerhalb eines Tages oder Dichtung um das Deckglas mit Nagellack und Bildbeispiele erst, nachdem der Lack getrocknet ist. Speichern Sie im Dunkeln bei 4 ° C.

3. Protokoll Nr. 3: Visualisierung der SOS mit eGFP-CAAX mRNA

  1. Synthese von eGFP-CAAX mRNA
    1. Linearisieren Sie 1 mg pCS2-eGFP-CAAX Plasmid16 mit NotI in einem Reaktionsvolumen von 40 mL für 4 Stunden bei 37 ° C.
    2. Um die Beschränkung Digest Reaktion zu stoppen, fügen Sie 10 mL RNase-freies Wasser, 2,5 mL 10 % SDS und 2,0 mL 10 mg/mL Proteinase K.
    3. 1 Stunde bei 50 ° c inkubieren
    4. Fügen Sie Folgendes in die Reaktion (Gesamtvolumen 200 mL) und gehen Sie zum nächsten Schritt: 50 mL RNase-freies Wasser, 20 mL 3 M Natrium Acetat pH 5.2 und 75,5 mL RNase-freies Wasser
      Hinweis: RNase-freies Wasser wird in zwei verschiedenen Gelegenheiten zu verhindern übermäßige Verdünnung der Natriumacetat hinzugefügt.
  2. Reinigung der DNA durch Phenol/Chloroform Extraktion und Ethanol Niederschlag
    1. Fügen Sie 200 mL Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol und Wirbel für 20 S. getrennt die wässrigen und organische Phasen durch Zentrifugation bei 18.000 x g für 5 min.
    2. Übertragen Sie die obere wässrige Schicht zu einem neuen Microcentrifuge Schlauch, und achten Sie auf die Übertragung der unteren organische Schicht zu vermeiden. Die neue Röhre ein gleiches Volumen an Chloroform hinzufügen.
      Hinweis: Zugabe von Chloroform ist optional, aber es wird empfohlen, die vollständige Entfernung von Phenol aus der Probe zu gewährleisten.
    3. Vortex für 20 S. getrennt die wässrigen und organische Phasen durch Zentrifugation bei 18.000 x g für 5 Minuten.
    4. Nach wie vor Übertragung der oberen wässrigen Schicht zu einem neuen Microcentrifuge Schlauch, und achten Sie auf die Übertragung der unteren organische Schicht zu vermeiden.
    5. Fügen Sie 1/10 Volumen von 3 M Natrium Acetat pH 5.2.
    6. Überstürzen Sie DNA durch Zugabe von 3 Bände von 100 % RNase-freie Ethanol und Chill bei-20 ° C für 15 min. Zentrifugieren bei 18.000 x g für 20 min bei 4 ° C. Ein Pellet sollte sichtbar sein. Den Überstand abgießen.
    7. Waschen Sie die Tablette mit 100 mL kaltem 70 % Ethanol/RNase-freies Wasser. Zentrifugieren Sie nach vorsichtig mischen, um das Pellet losbrechen bei 18.000 x g für 15 min bei 4 ° C. Ein Pellet sollte sichtbar sein. Den Überstand abgießen.
    8. Das Pellet für 5 min an der Luft trocknen und die DNA in 7 mL Wasser Aufschwemmen.
      Hinweis: Die Pellets müssen länger als 5 min, je nach den Luftstrom getrocknet werden.
  3. Transkription und Reinigung von eGFP-CAAX mRNA
    1. RNase-freie Weise bereiten Sie eine in-vitro- Transkription Reaktion mit einem handelsüblichen Sp6 RNA Polymerase-Kit, mit etwa 1 mg gereinigte linearisierten Plasmid DNA in Schritt 3.2 erhalten. 2 h bei 37 ° c inkubieren
      Hinweis: Sp6-RNA-Polymerase muss für die Herstellung von angeschnittene Ärmel mRNA verwendet werden.
    2. Fügen Sie 1 mL DNase (2 U/mL; RNase frei) und 30 min bei 37 ° c inkubieren
    3. Reinigen Sie die mRNA mit jeder handelsüblichen RNA Reinigung Kit. Aliquoten die mRNA zu vermeiden wiederholte Frost-Tau-wechseln, und bei-80 ° c lagern
  4. Injektion und Visualisierung
    1. Embryonen zu erhalten, wie im Protokoll 1.1 beschrieben.
    2. Injizieren Sie mit Hilfe einer Mikroinjektion Apparatur, 300 Pg eGFP-CAAX mRNA im 1-Zell-Stadium.
    3. Bildschirm für Embryonen mit dem hellen Ausdruck von eGFP in den Augen mit einem Fluoreszenz-Stereoskop.
    4. Bild der Embryonen, wie im Protokoll 1.2 beschrieben.
    5. Alternativ, Dechorionate und befestigen Sie die Embryonen an die gewünschte Timepoint in 4 % PFA für 4 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4° C. Waschen Sie die Embryonen in 1 x PBST für 5 min, viermal und Dechorionate, wenn nicht zuvor getan. Sezieren die Augen aus und klebe sie auf Folien, wie im Protokoll 2.3 beschrieben.

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Ergebnisse

Der Zebrabärbling SOS erscheint um 20 Uhr hpf in der mutmaßlichen dorsalen Netzhaut-8. Von 23 hpf SOS Übergänge von seiner ursprünglichen engen Architektur auf einen breiten Einzug und 26 hpf-es ist nicht mehr sichtbar8. Daher, um die SOS während der normalen Zebrafisch Augenentwicklung zu untersuchen, die Embryonen zwischen 20-23 hpf einzuhalten. Während dieser Zeit ist die SOS zu beobachten, durch die sezierenden Mikroskop und mittels DIC ...

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Diskussion

Hier präsentieren wir Ihnen eine standardisierte Reihe von Protokollen, die SOS im sich entwickelnden Zebrafischembryo zu beobachten. Ermitteln, Schließung Verzögerung Phänotypen, konzentrierten sich unsere Protokolle auf die Fähigkeit, die Trennung von zwei diskreten Lappen der dorsalen Nasal und dorsal-zeitliche Seiten des Auges, vergleichbar mit Techniken zur Aderhaut Fissur Verschluss Verzögerung visualisieren unterscheiden in den Augen der ventralen Phänotypen.

Diese Visualisierungs-Techn...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine widerstreitenden Interessen zu erklären.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von kanadischen Institute der Gesundheit Forschung (CIHR), Naturwissenschaften und Engineering Research Council (NSERC), Alberta innoviert Technologie Futures, und Frauen und Kinder Health Research Institute (WCHRI) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1-Phenyl-2-ThioharnstoffSigma AldrichP7629-10G
100 mm PetrischaleFisher ScientificFB0875713
35 mm PetrischaleCorningCLS430588
AgaroseBioShop Canada Inc.AGA001.1
RinderserumalbuminSigma AldrichA7906-100G
DIC/FluoreszenzmikroskopZeissAxioImager Z1
DissektionsmikroskopOlympusSZX12
Dissektionsmikroskop KameraQimagingMicroPublisher 5.0 RTV
Dow Corning HochvakuumfettFisher Scientific14-635-5D
Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonat-Salz (Tricain)Sigma AldrichA5040-25G
Ziege Anti-Kaninchen Alexa Fluor 488Abcamab150077
ZiegenserumSigma AldrichG9023
BilderfassungssoftwareZeissZEN
InkubatorVWRModell 1545
Mikroskop-Deckglas (22 mm x 22 mm)Fisher Scientific12-542B
ObjektträgerFisher Scientific12-544-2
MinutienPin Fine Science Tools26002-10
mNachricht mMachine Sp6 TranskriptionskitInvitrogenAM1340
NotINew England BiolabsR0189S
Paraformaldehyd ( PFA)Sigma AldrichP6148-500G
Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol pH 6,7 +/- 0,2Fisher ScientificBP1752-100
Proteinase KSigma AldrichP4850
Kaninchen Anti-Laminin-AntikörperMillipore SigmaL9393
TURBO Dnase (2 U/µ L)InvitrogenAM2238
Ultrareine Agarose mit niedrigem SchmelzpunktInvitrogen16520-100
Ultrareines Natriumdodecylsulfat (SDS)Invitrogen15525017

Referenzen

  1. Chow, R. L., Lang, R. A. Early eye development in vertebrates. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, (2001).
  2. Slavotinek, A. M. Eye development genes and known syndromes. Molecular Genetics and Metabolism. 104 (448-456), (2011).
  3. Gregory-Evans, C. Y., Williams, M. J., Halford, S., Gregory-Evans, K. Ocular coloboma: a reassessment in the age of molecular neuroscience. Journal of Medical Genetics. 41 (12), (2004).
  4. Onwochei, B. C., Simon, J. W., Bateman, J. B., Couture, K. C., Mir, E. Ocular colobomata. Survey of Ophthalmolgy. 45, 175-194 (2000).
  5. Williamson, K. A., FitzPatrick, D. R. The genetic architecture of microphthalmia, anophthalmia and coloboma. European Journal of Medical Genetics. 57, 369-380 (2014).
  6. Chang, L., Blain, D., Bertuzzi, S., Brooks, B. P. Uveal coloboma: clinical and basic science update. Current Opinion in Ophthalmology. 17, 447-470 (2006).
  7. Kaufman, R., et al. Development and origins of Zebrafish ocular vasculature. BMC Developmental Biology. 15 (18), (2015).
  8. Hocking, J. C., et al. Morphogenetic defects underlie Superior Coloboma, a newly identified closure disorder of the dorsal eye. PLOS Genetics. 14 (3), (2018).
  9. Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Developmental Cell. 21 (1), (2011).
  10. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
  11. Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. International Journal of Developmental Neuroscience. 19, 621-629 (2001).
  12. Westerfield, M. The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th edition, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2007).
  13. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  14. Distel, M., Köster, R. W. In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
  15. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
  16. Kwan, K. M., Otsuna, H., Kidokoro, H., Carney, K. R., Saijoh, Y., Chien, C. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139, 359-372 (2012).
  17. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. Stages of Embryonic Development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  18. Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (79), e50525(2013).
  19. Percival, S. M., Parant, J. M. Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (113), e54218(2016).

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Nachdrucke und Genehmigungen

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