Mikroinjektion basierenden System für In Vivo Implantation von embryonalen Kardiomyozyten des aviären Embryos

Zusammenfassung

Bei dieser Methode sind embryonale Herz Gewebe chirurgisch Microdissected, dissoziiert, Eindringmittel beschriftet und in Host embryonalen Gewebe implantiert. Dies bietet eine Plattform für das Studium der Einzelperson oder Gewebe Ebene Entwicklungen Organisation unter ektopische hämodynamischen Bedingungen und/oder veränderten parakrine/Juxtacrine Umgebungen.

Zusammenfassung

Interpretation der relativen Auswirkung der Zelle autonomen Musterung versus extrinsische microenvironmental Einfluss auf die Zelle Abstammung Bestimmung ist eine allgemeine Herausforderung in der Entwicklungsbiologie Forschung. Im embryonalen Herzen dies als regionale Unterschiede in der Expression von transcriptional Regler, parakrine/Juxtacrine signalisieren Hinweise, besonders schwierig sein kann und hämodynamische Kraft sind alle bekannten Cardiomyocyte Reifung zu beeinflussen. Eine vereinfachte Methode, eine Entwicklung Cardiomyocyte molekulare und biomechanischen Mikroumgebung ändern würde, dienen daher als eine mächtige Technik, wie die lokalen Bedingungen Einfluss Zelle Schicksal und Funktion zu prüfen. Um dieses Problem anzugehen, haben wir eine Methode, um körperlich juvenile Kardiomyozyten Transplantation in ektopische Standorte in das Herz oder die umliegenden embryonalem Gewebe optimiert. Dies ermöglicht es uns, wie microenvironmental Bedingungen Einfluss Cardiomyocyte Schicksal Übergänge bei einzelligen Auflösung innerhalb der intakten Embryo zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein Protokoll in der embryonale Myozyten können werden aus einer Vielzahl von kardialen Subdomains isoliert, dissoziiert Eindringmittel beschriftet und mikroinjiziert zu Host Embryonen mit hoher Präzision. Zellen können dann direkt an Ort und Stelle mit einer Vielzahl von bildgebenden und histologischen Techniken analysiert werden. Dieses Protokoll ist eine leistungsstarke Alternative zu traditionellen Pfropfen Experimente, die in einem bewegenden Gewebe wie das Herz übermäßig schwierig sein kann. Die Grundzüge dieser Methode kann auch eine Vielzahl von Spender-Gewebe und Hostumgebungen und seine einfache Bedienung, niedrige Kosten, angepasst werden und Geschwindigkeit machen es eine potenziell nützliche Anwendung für eine Vielzahl von Studien.

Einleitung

Kardiale Entwicklungsforschung hat enorm aus dem Aufkommen der Keimbahn transgenen Modellsysteme profitiert hätten viele der genregulatorischer Netzwerke dieser Muster andere Zelle Linien und Funktionsbereiche im Herzen ausgewiesen. Allerdings kann erkennen wie diese Gen-Netzwerken interagieren und auf microenvironmental Bedingungen reagieren, einschließlich parakrine/Juxtacrine Signale und biophysikalischen Eingänge (dehnen, Dehnung, hämodynamische Flow), schwierig sein. Als solches ist es nicht immer leicht zu bestimmen, ob ein zellulärer Phänotyp als direkte Folge von einer genetischen Störung oder als sekundäre Folge einer Anpassung an Veränderungen der kardialen Biomechanik oder höherer Ordnung Gewebe Zusammensetzung^{1,2 entsteht} .

Pfropfen Experimente, die klassisch zu Adresse Konzepte der Schicksal-Spezifikation verwendet wurden, wäre Engagement, Induktion und Kompetenz^3,4, einen idealen Ansatz, einige der Herausforderungen zu umgehen definieren Zelle autonomen gegenüber Umwelteinflüssen im Herzen. Leider erschweren Herz Kontraktionen Standardansätze Pfropfen. Schnelle Bewegung des Gewebes verhindert oft transplantierten Zellen von der Einhaltung der Herzen und großen Gewebe sticht (normalerweise für die Pfropfung erforderlich) führen häufig zu Herzinsuffizienz und embryonale Tödlichkeit^5,6,7. Daher haben wir eine Druck-basierte, Mikroinjektion System für Präzision zellulären Implantation in die entwickelnden Küken Herz, umgehen die technischen Hürden der Gewebe Pfropfen beschriebenen^8,9. Mit dieser Technik können einzelne oder kleine Gruppen von Herzzellen von einem Spender Embryo isoliert mikroinjiziert werden in verschiedenen Regionen ein Host embryonale Herz, wodurch die Notwendigkeit für umfangreiche Host Vorbereitung und die großen Gewebe Beleidigungen, die entstehen, mit Standard-Pfropfen-Techniken. Die Mikroinjektion Nadeln verwendet für diese Implantation Studien haben einen Außendurchmesser von ~ 30−40 µm, was bedeutet, dass die Nadel direkt in das Zielgewebe platziert werden kann (z.B. dringen die embryonale myokardiale Wand) und Zellen mit fokal lieferbar minimaler Beschädigung des umgebenden Gewebes. Das Protokoll kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Isotopen, heterotopisch, Isochore und Heterochronic Manipulationen, bietet einen schnelle, flexiblen und kostengünstige Ansatz zur klassischen experimentellen embryologische Paradigmen in den Entwicklungsländern direkt untersuchen durchführen vier-Kammer-Herz.

Im unten beschriebenen Protokoll, beschriften wir Spender Zellen mit einer Zelle permeationsfähigen Leuchtstofffärbung, die für den Erfolg einer Mikroinjektion Experiment ermöglicht in Echtzeit überwacht werden und die Lage des eingepflanzt Zellen ohne die Notwendigkeit für irgendwelche dokumentiert werden zusätzliche Färbung. Allerdings ist darauf hinzuweisen, dass dieser Ansatz am besten geeignet für kurzfristige Experimente (ca. 48 h) ist, wie der Fluoreszenzfarbstoff durch Zellteilung verloren gehen kann. Alternative Ansätze können für längere Laufzeit Experimente verwendet werden.

Während wir diese Technik im Rahmen der kardialen Entwicklung präsentiert, haben wir es mit großem Erfolg zur Implantation Zellexperimente Mesoderm, Kopf, Gliedmaßen und Somiten eingesetzt. Als solche der Grundansatz beschrieben ist sehr gefügig und kann in einer Vielzahl von Organsystemen verwendet werden.

Protokoll

Alle beschriebene Methoden befolgen Tierbetreuung Richtlinien der University of North Carolina in Chapel Hill.

1. Vorbereitung der Mikro-Injektion Pipetten

1. Ziehen Sie mit einer Mikropipette Puller Glaskapillaren. Für einige Injektionen ist Nadel Abschrägung empfohlen, da es eine extrem scharfe Oberfläche frei von strukturellen Verunreinigungen bietet. Zu diesem Zweck polnische ein gezogener Nadelspitze auf einem abschrägen Rad in einem Winkel von 45° 15−20 Minuten.
   Hinweis: Genaue Einstellung für das Ziehen von variiert je nach der Abzieher verwendet wird. Der endgültige inneren Durchmesser der Abschrägung sollte zwischen 20−40 µm betragen.
2. Bestreichen Sie die inneren und äußeren Oberflächen des Glases Kapillare mit Silikon. Zunächst Tauchen Sie die Nadeln in den siliconizing Agenten, die äußere Oberfläche der Nadel und dann Backload die siliconizing Agents Lösung in jedem Mikropipette zur Beschichtung von der inneren Oberfläche zu beschichten.
   Hinweis: Beschichtung von der Glaskapillaren sollte 24 h vor der Implantation-Experiment durchgeführt werden. Glaskapillaren mit Silikon Beschichtung sorgt für eine chemisch inerte Oberfläche auf das Glas. Wenn die Kapillaren übrig sind wird unbehandelt, die Zellsuspension in späteren Schritten generiert und halten uns an das Glas stecken Sie die Nadel. Beschichtung ist daher notwendig und entscheidend für den Erfolg der Methode.
   Achtung: Der siliconizing Agent ist eine fertige handelsübliche Mischung aus Heptan und 1,7-Dichlor-1,1,3,3,5,5,7,7-Octamethyltetrasiloxane (Table of Materials). Es ist hochentzündlich und akut toxisch. Fassen Sie immer mit richtigen PSA innerhalb einer Abzugshaube.
   1. Backload die Nadel, laden ~ 5−10 µL des siliconizing Agents in einem Mikro-Injektion Pipettenspitze (Table of Materials). Setzen Sie die Mikro-Injektion-Spitze in das breite Ende von gezogenem Glas Kapillare und positionieren Sie die Spitze so weit unten wie möglich (in der Nähe der Nadelspitze Glas). Auswerfen des siliconizing Agents beim Entfernen langsam der Beladung Pipette um Luftblasen in der Nadel zu minimieren.
   2. Verlassen Sie die siliconizing Agents in der Glasnadel für 10 min, entfernen Sie, indem Sie mit einer neuen Laden-Pipette Absaugen und lassen Sie zu, dass Nadeln in einer Abzugshaube über Nacht trocknen.
3. Am Morgen des Experiments, spülen Sie die Glaskapillaren mit entionisiertem Wasser nach dem Verfahren in Schritt 1.2 und 3−4 h trocknen lassen.

2. Vorbereitung der Lösungen

1. Bereiten Sie 5 mL Trypsin neutralisierende Lösung durch die Ergänzung von 4,2 mL Dulbeccos modifizierten Eagle Medium und Hams Nährstoff Gemisch F12 (DMEM/F12) mit 750 µL des fetalen Bovine Serum (FBS) und 50 µL von Penicillin/Streptomycin vor. Bei 37 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.
2. Bereiten Sie 5 µM Kennzeichnung Farbstofflösung durch Pipettieren 5 µL 1 mM Lager Kennzeichnung Farbstoff (in Dimethyl Sulfoxid [DMSO], Table of Materials) in 995 µL Hank Salzlösung (HBSS) ausgeglichen. Vortex für 1 min und bei 37 ° C bis zu seiner Verwendung zu speichern.
3. Bereiten Sie frische Paraformaldehyd (PFA) durch die Kombination von 10 mL 32 % PFA-Stammlösung mit 62 mL Molekularbiologie Grad Wasser und 8 mL 10 x Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS). Die Endkonzentration beträgt 4 % PFA in 1 X DPBS.

3. Vorbereitung des Host-Embryonen

1. Inkubieren Sie fruchtbaren Eier in eine horizontale Ausrichtung in einem befeuchteten Inkubator bei 38 ° C bis zum Hamburger und Hamilton (HH) Etappe 19¹⁰.
   Hinweis: Die Bühne für Manipulation gewählt ist flexibel und völlig abhängig von den Zielen jedes einzelnen Experiment.
2. Ergebnis "flache" Ende der Eierschale am Ei Äquator mit abgewinkelten Pinzette, um ein kleines Loch zu machen > 1 mm im Durchmesser. Einfügen ein 18 G-Nadel mit angehängten 10 mL Spritze durch die Punktion und ~ 5 mL Albumin zu entfernen.
   Hinweis: Diese anatomische Lage ist außerhalb der "Luft-Zelle" innerhalb des Eies und hält Albumin vom lecken, sobald die Punktion erfolgt. Dieser Schritt wird empfohlen, da es "fällt" den Embryo von der Eierschale, Verhinderung von möglichen Schäden in den nachfolgenden Schritten.
3. Gelten Sie durchsichtiges Klebeband an die Spitze der Eierschale. Punkten mit abgewinkelten Pinzette und einem ~2.5 cm Fenster mit gebogenen Tenotomie Schere schneiden.
4. Prüfen und den Embryo basierend auf Hamburger und Hamilton¹⁰ festgelegten Kriterien zu inszenieren und die Punktion von Schritt 3.2 mit Tesafilm zu versiegeln.
   Hinweis: Hier werden HH 19 Embryonen verwendet, die 37−40 Somiten bis ins Heck Keim haben. Die Punktion sollte nicht bis versiegelt werden, nachdem das Fenster am oberen Rand das Ei (Schritt 3.3) geöffnet ist.
5. Tusche/HBSS Mischung (1:5) unter den Embryo mit einer 32 G-Nadel mit angehängten 1 mL Spritze ~ 200 µL zu injizieren.
   Hinweis: Indien Tinte bietet visuellen Kontrast zwischen dem Embryo und das Eigelb unter. Alternative Farbstoffe wie neutral rot oder handelsüblichen Cyan fluoreszierenden Proteins (GFP) oder blau fluoreszierenden Proteins (BFP) Fluoreszenz Filtersätze eingesetzt werden, um Kontrast zu verbessern.
6. Fügen Sie 1 mL HBSS tropfenweise auf der embryonalen Scheibe und Dichtung Fenstermodus Schalen mit Paraffin Film. Legen Sie Eier zurück in den befeuchteten Inkubator bis bereit zur Injektion.

4. Isolierung von Spendergewebe

1. Inkubieren Sie Spender fruchtbaren Hühnereier in einem befeuchteten Inkubator bei 38 ° C bis Stufe HH 19 (oder gewünschte Stufe).
2. Entfernen Sie den Embryo aus dem Ei zu und in ein 100 x 15 mm Petrischale mit sterilem HBSS bei Raumtemperatur (RT).
3. Chirurgisch Microdissect Vorhofflimmern Spendergewebe von jedem Embryo indem zuerst das gesamte embryonale Herz des Embryos zu isolieren und dann durch die Isolierung der Vorhöfe aus dem Herzen Zange, Tenotomie Scheren und Microspatula unter einem Stereo Mikroskop seziert. Pool in einem sterilen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit 1 mL HBSS auf Eis.
4. Sobald alle Spendergewebe gesammelt hat, pellet-das Gewebe durch Zentrifugation bei 1000 X g für 5 min bei 4 ° C in einem festen Winkel Microcentrifuge.

(5) Trypsin-Verdauung von Spendergewebe

1. Aufschwemmen Sie Zelle Pellets in 1 mL vorgewärmte 0,05 % Trypsin-EDTA und bei 37 ° C für 15 min in ein Schütteln Heizblock bei 300 u/min inkubieren. Alternativ können Sie ein Wasserbad mit periodischer Erregung der Probe.
2. Pipette der Aufschlusslösung rauf und runter um jede verbleibende Gewebe aufzubrechen, und wie in Schritt 4.4 pellet.
3. Aufzuwirbeln Sie das Pellet in 1 mL der Trypsin neutralisierende Lösung und Zentrifuge wie in Schritt 4.4.
4. Zellen in 400 µL rot fluoreszierende Farbstofflösung Kennzeichnung Aufschwemmen und Inkubation bei 37 ° C für 20 min in einem Hitze-Block. Alternativ können Sie ein Wasserbad.
5. Sobald die Kennzeichnung Reaktion abgeschlossen ist, die Zellen wie in Schritt 4.4 pellet und waschen mit 1 mL HBSS (Anzahl der Wäsche, die Schritte 1 bis 3 variiert werden können).
6. Aufzuwirbeln Sie die beschrifteten, gebeizte Zellen in einer Konzentration von ~ 50.000 Zellen/µL, die in der Regel ergibt sich eine 5−10 µL Arbeitsvolumen abhängig von der gesamten Zellausbeute.
   Hinweis: Zelle Konzentrationen unterhalb ~ 50.000 Zellen/µL können schlechte Injektion Effizienz führen.

6. in-Vivo-Injektion

1. BackLoad die Zellsuspension in eine Silikon behandelten Kapillare Glaspipette nach den Verfahren in Schritt 1.2. Montieren Sie die Pipette in den Druck-Microinjector-Apparat.
2. Entfernen Sie Host Embryonen aus befeuchteten Inkubator und setzen Sie in ein Ei-Halter unter den fluoreszierenden Stereo Mikroskop seziert.
   1. Öffnen Sie die Dotterhäutchen Membran mit sterilen feinen Pinzette und machen Sie einen kleinen Schnitt (~0.5−1.0 mm in der Länge) in den Herzbeutel. Weitere Manipulation/Dissektion kann je nach Zielregion zur Injektion erforderlich sein.
3. Positionieren Sie die Microinjector so, dass die Mikroinjektion Nadelspitze dringt in das Zielgewebe.
   1. Druck injizieren Zellen und das fluoreszierende Label zu verwenden, um festzustellen, dass die implantierte Zellen in gewünschte Gewebe vorhanden sind. Typische Injektionen beantragen, Einzelimpulse von weniger als 0,5 s Dauer von 100-400 Hektopascal in Druck.
      Hinweis: Pulslänge und Absolutdruck ist abhängig von der Anzahl der Zellen injiziert werden und können individuell geändert werden.
   2. Einfahren Sie der Microinjector Apparat und entfernen Sie das Ei nach der Injektion von Druck aus der Halterung zu.
4. Fügen Sie 1 mL warmen HBSS tropfenweise auf den Embryo, Eier mit transparentem Klebeband versiegeln und brüten in den befeuchteten Inkubator bei 38 ° C für 24 h Post Implantation.

(7) Isolierung und Analyse

1. Host-Embryonen in RT HBSS mit Zange, Tenotomie Schere und Microspatula ähnlich wie Schritt 4.3 isolieren und in 4 % PFA über Nacht bei 4 ° C mit sanftes Schaukeln zu beheben.
2. Waschen Sie Embryonen 3 x 5 min in HBSS bei RT mit sanftes Schaukeln, und speichern Sie in HBSS bei 4 ° C für weitere nachgelagerte Analyse (Mikroskopie, Immunohistochemistry, in-Situ-Hybridisierung, etc.).

Ergebnisse

Nach 24 h Inkubation, das Herz und die Surround-Gewebe des Hosts Embryonen wurden isoliert, fotografiert (Abb. 1A) und für immunofluorescent Analyse verarbeitet. In diesem Beispiel wurden in der Proepikards eines ähnlichen inszenierten Hosts Spender Vorhofflimmern Myozyten mikroinjiziert Embryo. Der Host-Embryo war dann mit dem Muskel-Marker (MF20 grün) und 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI; blau) gefärbt. Injizierte Zellen (rot) sind deutlich erkennbar (Abbildung 1B). Mögliche Anpassungen zu berücksichtigen, wenn Zellen nicht sichtbar sind enthalten: Spendergewebe wurde über verdaut (Zellen wäre nicht in der Lage zu befestigen), Kennzeichnung Farbstofflösung war zu verdünnen, Zellen waren übermäßig gewaschenen oder mehrere Zellteilungen führte zu Verlust des Labels.

Um zu bestätigen, dass die injizierten Zellen in diesem Beispiel myokardialen waren, geschnitten wir optisch dieser Embryo mit einem konfokalen Mikroskop (Abbildung 1C-E). Die einzige MF20 positive innerhalb der Proepikards (PE) sind die fluoreszierenden roten positive Zellen, die fokal implantiert wurden.

Abbildung 1 : Repräsentative Bilder von Embryonen isoliert 24 Stunden Post Injektion. (A) geringer Vergrößerung Hellfeld Bild der Stamm Region eines 3,5 (HH-Bühne-19)-Küken-Embryos. (B) zusammengeführten Bild zeigt injiziert Zellen (rot), Herzmuskelzellen (grün) und DAPI. Zellen von den Vorhöfen isoliert waren und mikroinjiziert in der Proepikards. (C) hohe Vergrößerung konfokale Bildgebung zeigt mit der Bezeichnung Zellen in den Kern der Proepikards. (D) hoher Vergrößerung konfokale Bildgebung bestätigt CT rot markiert Zellen sind Herzzellen. (E) dreidimensionale (3D) Rekonstruktion des injizierten Zellen aus Paneelen, D und E. At, Atrien; OFT, Ausflusstrakt; PE, Proepikards; VT, Ventrikel; MF20, Myosin 4. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Diskussion

Die Fähigkeit, wie microenvironmental Bedingungen Auswirkungen Herzmuskelzellen Schicksal Spezifikation und Abstammung Stabilisierung zu definieren ist grundlegend für die Schaffung eines zusammenpressende Verständnisses von angeborenen Herzerkrankungen sowie effiziente Protokolle für die richtige Entwicklung Reifung von Stammzellen oder somatischen Zellen umprogrammieren-basierte Kardiomyozyten. Das Protokoll beschriebenen gibt Ermittler die Möglichkeit, direkt assay Entwicklung der Herzmuskelzellen unter in vivo Bedingungen, zulassend Zellprozesse autonomen Reifung von parakrine/Juxtacrine und/oder hämodynamischen Signale getrennt werden verändert. In Kombination mit hochauflösenden Bildgebung, Genanalyse und physiologischen Assays kann diese Technik als eine leistungsstarke Ergänzung zu bestehenden transgene Modelle dienen.

Bilden eine technischen Standpunkt, der hier vorgestellten Protokoll setzt auf effiziente Isolierung, Kennzeichnung und präzise Implantation von Herzen Spenderzellen in Host embryonalen Gewebe. Die Verwendung eines Mikroinjektion stark hilft bei der Ausrichtung der die Spenderzellen und ermöglicht eine erfolgreiche Implantation ohne die Notwendigkeit der Schaffung einer großen Engraftment Website in das Wirtsgewebe. Einige operative Geschick ist erforderlich, um diese Technik jedoch durchführen wie reduzierte Tragfähigkeit führen kann, wenn die Injektionsnadel nicht sorgfältig in das Zielgewebe (wodurch Bruch des Herzens oder der lokalen Gefäßsystem) platziert wird. Pflege und Gedanken sollten auch die Isolierung und Kennzeichnung Schritte eingeräumt werden. Über Verdauung des Spenders kann Gewebe führen zu schlechten Implantation Effizienz und Transient Kennzeichnung Techniken kann das Zeitfenster über dem Spenderzellen verfolgt werden können (wie Zellteilung das Label verdünnen kann) zu begrenzen.

Diese Technik ist hochgradig modifizierbar und kann für vielfältige Zwecke angepasst werden. Z. B. werden Spender Zellen aus einer Vielzahl von Geweben und Stufen können isoliert werden, (obwohl Optimierung der enzymatischen Verdauung benötigt wird) und in ähnlicher Weise können injiziert in einer Vielzahl von Host-Gewebe in unterschiedlichen Entwicklungsstadien. Ebenso kann die Kennzeichnung Ansatz geändert werden, um Zellen in verschiedenen zeitlichen Fenster, einschließlich der Verwendung von fluoreszierenden anorganische Halbleiter-Nanokristallen für mehr vorübergehende Kennzeichnung und Implantation von Wachteln Zellen oder Zellen von Grün zu verfolgen fluoreszierendes Protein transgenen (GLP +) Spender Embryonen¹¹ für permeationsfähigen beschriften.

Während wir derzeit diese Technik für Vogelgrippe Implantation Studien verwenden, halten wir es für eine Vielzahl von Chimären Studien in der Zukunft verwendet werden könnten. Beispielsweise könnte genetisch veränderte Herzmuskelzellen aus transgenen Organismen isoliert und in die Vogelgrippe Herz mit einem sehr ähnlichen Protokoll mikroinjiziert. Darüber hinaus in Herzzellen von differenzierte Zellen ergibt sich Zellen oder über somatischer Zellen umprogrammieren Ansätze in das embryonale Herz, ihre Integration in das Gewebe und/oder die Reifung unter in-vivo biomechanischen bewerten mikroinjiziert werden könnte Bedingungen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1 mL Insulinspritze	BD	329654
1,7 mL Mikroröhrchen, klar	Genesee Scientific	24-282
10 ml Spritze	BD	305482
1000ul Reach Barrier Spitze im Rack, steril	Genesee Scientific	24-430
15 mL Zentrigigeröhrchen, im Rack	Genesee Scientific	28-101
1588 Genesis Hova-Bator Inkubator	GQF	813927021221
18G x 1 1/2 Nadel	BD	305196
200ul Barrier Tip Low Binding, Racked, steril	Genesee Scientific	24-412
32G x 1/2" Nadel	TSK Steriject Air-Tite	TSK3213
Alchohol Tücher 70%	Thermo Fisher Scientific	19015744
Abgewinkelt Pinzette	Fine Scientific Tools	11260-20
Backloading-Spitzen	Eppendorf	930001007
Schwarz Tusche	KOH-I-NOOR	3084-F
CellTracker Grün CMF	Thermo Fisher Scientific	C7025	1 mM in DMSO
CellTracker Rot CMTPX	Thermo Fisher Scientific	C34552	1 mM in DMSO
Zentrifuge	Eppendorf	5424R
Commercial Grade Packband	Klammern	2619001
gebogene Tenotomieschere	Fine Scientific Tools	14067-11
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	11330-032
DMSO,	wasserfrei Thermo Fisher Scientific	D12345
DPBS (10X), kein Kalzium, kein Magnesium	Thermo Fisher Scientific	14025092
Femtojet 4i	Eppendorf	5252000021
Fötales Rinderserum	Thermo Fisher Scientific	10437-028
Bruteier	Pilgrim's Hatchery	--
HBSS, Calcium, Magnesium, kein Phenolrot	Thermo Fisher Scientific	14025-092
Injectman 4	Eppendorf	5192000027D
Mikromanipulator	Leica Microsystems	--
Parafilm	SIGMA	P6543-1EA
Paraformaldehyd 32% in wässriger Lösung, EM Grade	VWR	100496-496
	Thermo Fisher Scientific	15140-022
Petrischale	Genesee Scientific	32-107
Pipettenschleifer	Narishige	EG-44
Pipettenabzieher	HEKA	PIP 6
Scotch Transparent	Tape Klammern	487909
Sigmacote	SIGMA	SL2-25ML
Stereomikroskop	Leica	--
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000023
Dünnwandige Glaskapillaren	World Precision Instruments	TW100F-4
Transferpipette	Thermo Fisher Scientific	273
Trypsin-EDTA (0,05%), phenolrot	Thermo Fisher Scientific	25300-054