Methodenartikel

Isolation, Vermehrung und Prion-Protein-Expression während neuronaler Differenzierung von Stammzellen menschlichen Zahnpulpa

DOI:

10.3791/59282

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18. März 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Experimental Medicine and Environmental Pathology, Sabina Universitas - Rieti University Hub, 2Department of Experimental Medicine, Sapienza University of Rome, 3Department of Science Dentistry and Maxillofacial, Sapienza University of Rome

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier präsentieren wir ein Protokoll für die menschlichen Dental Pulp Stammzellen isoliert und Vermehrung um das Prion-Protein-Expression bei neuronalen Differenzierungsprozess zu bewerten.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bioethische Fragen im Zusammenhang mit der Manipulation von embryonalen Stammzellen haben Fortschritte auf dem Gebiet der medizinischen Forschung behindert. Aus diesem Grund ist es sehr wichtig, adulten Stammzellen aus verschiedenen Geweben wie Fettgewebe, Nabelschnurblut, Knochenmark und Blut zu erhalten. Zu den möglichen Quellen ist Zahnpulpa besonders interessant, weil es einfach ist, in Bezug auf bioethische Aspekte zu erhalten. In der Tat Dental Pulp Stammzellen (hDPSCs) sind eine Art von adulten Stammzellen in neuronalen-ähnliche Zellen zu unterscheiden und kann der dritte Molar von gesunden Patienten (im Alter von 13-19) entnommen werden. Insbesondere wurde die Pulpa entfernt mit einem Bagger, in kleine Scheiben schneiden, mit Kollagenase IV behandelt und kultiviert in einem Kolben. Um die neuronale Differenzierung zu induzieren, wurden hDPSCs für 2 Wochen mit EGF/bFGF stimuliert. Bisher haben wir gezeigt, dass bei der Differenzierung der Gehalt an zellulären Prion Protein (PrPC) in hDPSCs erhöht. Die Cytofluorimetric Analyse zeigte frühen Ausdruck der PrPC , die nach neuronalen Differenzierungsprozess erhöht. Ablation von PrPC von SiRNA verhindert PrP neuronaler Differenzierung induziert durch EGF/bFGF. In diesem Beitrag zeigen wir, dass wir verstärkte Isolation, Trennung und in-vitro- Kultivierung Methoden der hDPSCs mit einige einfache Verfahren, effizientere Zellklonen erhaltenen und groß angelegte Erweiterung der mesenchymalen Stammzellen (MSCs) waren wurde beobachtet. Wir zeigen auch, wie die hDPSCs, mit Methoden, die gemäß des Protokolls erhalten sind ein ausgezeichnetes experimentelles Modell neuronaler Differenzierung der MSCs und anschließende zelluläre und molekulare Prozesse zu studieren.

Einleitung

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Mesenchymaler Stammzellen wurden isoliert aus verschiedenen Geweben, einschließlich Knochenmark, Nabelschnurblut, menschliche Zahnpulpa, Fettgewebe und Blut1,2,3,4,5 , 6. wie von mehreren Autoren berichtet, zeigen hDPSCs Kunststoff festhalten, eine typische Fibroblasten-ähnliche Morphologie. Diese stellen eine sehr heterogene Bevölkerung mit verschiedenen Klonen und Unterschiede in der proliferativen und differenzierenden Kapazität7,8. hDPSCs express spezifischer Marker für mesenchymale Stammzellen (d.h. CD44, CD90, CD73, CD105, STRO-1), sie sind negativ für einige hämatopoetischen Marker (z. B. CD14 und CD19) und sind in der Lage, in-vitro-multilineage Differenzierung9, 10,11.

Mehrere Autoren haben gezeigt, dass diese Zellen in der Lage sind zu differenzieren in Neuron-wie Zellen mit verschiedenen Protokollen, die den Zusatz von NGF, bFGF, EGF in Kombination mit den spezifischen Medien und Ergänzungen7,-12enthalten. Auch viele Proteine während neuronaler Differenzierungsprozess beteiligt sind, und unter diesen sind mehrere Papiere zeigen eine wichtige Rolle und Ausdruck des zellulären Prion-Proteins (PrPC), beide in embryonalen und adulten Stammzellen13, 14. PrPC stellt einen pleiotropen Molekül in der Lage verschiedene Funktionen innerhalb der Zellen als Kupfermetabolismus, Apoptose, und Widerstand gegen oxidativen stress15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22.

In unseren bisherigen Papier23untersuchten wir die Rolle von PrPC in den hDPSCs neuronalen Differenzierungsprozess. In der Tat hDPSCs express altklug PrPC und nach neuronaler Differenzierung war es möglich, eine zusätzliche Erhöhung zu beobachten. Andere Autoren die Hypothese auf einer möglichen Rolle von PrPC in neuronale Differenzierungsprozesse von Stammzellen. In der Tat treibt PrPC die Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen in Neuronen, Oligodendrozyten und Astrozyten24. Der Zweck dieser Studie war, die Methodik für die Gewinnung von Stammzellen aus Zahnpulpa, seine Differenzierungsprozess und die Rolle der PrPC während neuronaler Differenzierung zu betonen.

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Protokoll

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Dritte Molaren, die in der Studie verwendet wurden von Patienten (13-19 Jahre alt) mit keine vorherige Erfahrung im Bereich der Drogen- oder Alkoholkonsum, alle Nichtraucher-Zimmer und mit geeigneten Mundhygiene herausgeschnitten. Am Tag der Erklärung an die Abteilung Wissenschaft Zahnheilkunde und Kieferchirurgie der Universität Rom "La Sapienza" wurde von den Patienten oder die Eltern Einwilligung eingeholt. Die Einwilligung wurde basierend auf ethischen Überlegungen und Zustimmung der Ethik-Kommission.

1. Zahn und Zahnpulpa Extraktion

  1. Vorbereitung des entsprechenden Mediums für die Erhaltung oder Transport.
    1. Dulbeccos geändert Eagle mittlere niedrigen Konzentration von Glukose (DMEM-L) mit L-Glutamin (494,5 mL) vorzubereiten.
    2. Geben Sie 5 mL von Penicillin/Streptomycin (1 %) und 0,5 mL Amphotericin (0,1 %).
  2. Der dritte Molar vom Patienten zu extrahieren, schnell spülen Sie ihn mit PBS, legen Sie in einem 15 mL Reagenzglas mit dem Medium und überträgt es auf das Labor in weniger als 2 h.
  3. Öffnen Sie unter der Haube ein Biohazard den Zahn mit einem Cutter von koronalen Schnittlaufs parallel und tangential durch das Dach der Pulpakammer.
  4. Vorsichtig entfernen Sie, das Fruchtfleisch mit einem kleinen Bagger und legen Sie sie in ein Reagenzglas.
  5. Dreimal mit PBS waschen und Zentrifugieren bei 2.500 X g für 10 min bei RT

2. Verarbeitung der Pulpa und Stammzell-Release

  1. Entfernen des Überstands, Aufschwemmen das Pellet in Hanks Lösung und legen Sie sie in eine Petrischale. 2 h bei 37 ° C in 5 % CO2inkubieren.
  2. Typ IV Kollagenase Vorbereitung der Lösung.
    1. Bereiten Sie 0,8 mL DMEM-L.
    2. Schmelzen Sie 1 mg Typ IV Kollagenase in 0,8 mL DMEM-L und Vortex für mehrere Minuten.
    3. Fügen Sie DMEM-L bis zu 1 mL, eine Endkonzentration haben 1 mg/mL.
    4. Filtern Sie die Lösung mit einem 0,22 µM-Filter.
  3. Hank es Lösung durch Zentrifugation bei 2.500 X g für 10 min bei RT entfernen und dem Fruchtfleisch in kleine Scheiben ca. 1 mm jeweils mit einem Einweg Skalpell unterteilen.
  4. Legen Sie die Zellstoff-Scheiben in einer Petrischale und inkubieren Sie mit 1 mL Typ IV Kollagenase für 15 min bei 37 ° C in 5 % CO2.
  5. Mittlere Kultur Vorbereitung (500 mL).
    1. Auf 445 mL DMEM-L mit L-Glutamin.
    2. Fügen Sie 50 mL der fetalen Bovine Serum (FBS) (10 %).
    3. Fügen Sie 5 mL von Penicillin/Streptomycin (1 %).
  6. Zentrifugieren Sie die Probe bei 2.500 X g für 10 min bei RT, entfernen des Überstands, Aufschwemmen das Pellet in das Medium (Schritt 2.5) und Kultur in T25 Kolben speziell für Stammzellen bei 37 ° C in 5 % CO2.

(3) Stammzelle-Kultur und Vermehrung

  1. Jeden Tag überprüfen Sie die Kultur und nach 3 Tagen des Wachstums beobachten Sie verschiedene Klone von adhärenten Zellen innerhalb der Flasche.
  2. Alle 3 Tage ändern das Kulturmedium.
  3. Zwischen 7 und 12 Tagen sobald die adhärenten Zellen erreichen Zusammenfluss haben, lösen sie durch Behandlung der Zellen mit 1 mL Trypsin-EDTA für 3 min bei 37 ° C oder sanft mit einem Zelle Schaber.
  4. Fügen Sie 4 ml (Verhältnis 1:5) des Kulturmediums (Schritt 2.5), Trypsin-Aktion zu stoppen.
  5. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 6 min bei 259 X g, entfernen Sie überstand zu und legen Sie die Zellen in einem T25 Kolben zu propagieren.
    Hinweis: Alle 3 Tage erreichen die Zellen Zusammenfluss.
  6. Verbreiten Sie die Zellen bis zu 21 oder 28 Tage (ca. 6-8 Gänge), das Vorhandensein von nicht-Stamm wie Zellen in der Kultur zu vermeiden.
  7. Lösen Sie die Zellen mit 1 mL Trypsin-EDTA für 3 min bei 37 ° C oder sanft kratzen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 6 min bei 259 X g.
  8. Entfernen Sie den Überstand zu und testen Sie die Zellen für die Cytofluorimetric Analyse (Schritt 6).

(4) vorübergehende PrPC Silencing durch siRNA

  1. Kultur der hDPSCsin-6-Well-Platten (2 x 105 Zellen/mL) mit 2 mL Kulturmedium (Schritt 2.5) für 24 h.
  2. Am darauffolgenden Tag bereiten SiRNA PrP Medium (400 µL).
    1. Hinzufügen einer sterilen Reagenzglas 384 µL DMEM-L.
    2. 1 µL für jede Art von SiRNA PrP hinzufügen DMEM-L haben eine Endkonzentration von 5 nM (4 SiRNA PrP verwendet wurden und verifiziert durch den Lieferanten garantieren eine Knockdown Effizienz ≥70 %).
    3. DMEM-L. 12 µL Transfectionreagent hinzufügen
    4. Wirbel der Mischung und 10 min bei RT ermöglicht die Bildung von komplexen Transfektion inkubieren.
  3. Jede Probe 400 μl SiRNA PrP Medium hinzu und 6 h bei 37 ° c inkubieren
  4. Fügen Sie ohne SiRNA PrP Medium zu verwerfen, 1,6 mL Kulturmedium (Schritt 2.5) (Verhältnis von 1 bis 5).
  5. Lassen Sie die Zellen für 72 h bei 37 ° C.
  6. Entfernen Sie den Überstand zu und waschen Sie 3 Mal mit 2 mL PBS bei RT
  7. Fügen Sie 2 mL der neuronalen Kulturmedium für 7 bzw. 14 Tage (Schritt 5.1).
  8. Ändern der neuronalen Kulturmediums alle 3 Tage.
    Hinweis: Ersetzen Sie der SiRNA PrP Lösung jeder Zeit ersetzen die neuronalen Kulturmedium.
  9. Am Ende der Zeit 3 Mal mit 2 mL PBS bei RT waschen und testen für neuronale Oberflächenantigenen von Western-Blot Analyse.

(5) neuronale Einführungsprozess des hDPSCs

  1. Neuronale Kulturmedium Vorbereitung (500 mL).
    1. Bereiten Sie 444,7 mL basale Medien formuliert, um neuronale Zellen.
    2. Das Medium fügen Sie 50 mL serumfreien Ergänzung zur Unterstützung der langfristigen Rentabilität des embryonalen und adulten neuronalen Stammzellen (10 %) eingesetzt hinzu.
    3. Das Medium (Endkonzentration 20 ng/mL) 200 µL des basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) (Endkonzentration 40 ng/mL) und 100 µL der epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) hinzufügen.
    4. Geben Sie 5 mL von Penicillin/Streptomycin (1 %) auf das Medium.
  2. Kultur hDPSCs in 6-Well-Platten (2 x 105 Zellen/mL) bis zu 28 Tage von der Zellstoff-Trennung und mit 2 mL der neuronalen Kulturmedium zu stimulieren.
  3. Alle 3 Tage überstand verwerfen, 3 Mal mit 2 mL PBS bei RT waschen und 2 mL der neuronalen Kulturmedium zu ersetzen.
  4. Lösen Sie nach 7 bzw. 14 Tage die Zellen mit 1 mL Trypsin-EDTA für 3 min bei 37 ° C oder vorsichtig mit einem Schaber.
  5. Fügen Sie 4 mL (Verhältnis 1:5) Kulturmedium (Schritt 2.5), Trypsin-Aktion zu stoppen.
  6. Test für das Vorhandensein von neuronalen Oberflächenantigenen (Schritt 6) oder die Prion-Protein-Expression (Schritt 7) durch Flow-Zytometrie-Analyse.

6. Charakterisierung der hDPSCs von Flow Cytometry

  1. Wählen Sie mesenchymaler Stromazellen (MSC)-spezifische oder neuronale Oberflächenantigenen.
  2. Kultur der hDPSCs in 6-Well-Platten (2 x 105 Zellen/mL) mit 2 mL Kulturmedium (Schritt 2.5).
  3. Lösen Sie hDPSCs mit 28 Tagen von der Zahnpulpa Trennung oder nach 14 Tagen der neuronalen Kulturmedium (Schritt 5.1) mit 1 mL Trypsin-EDTA für 3 min bei 37 ° C oder sanft Schaber.
  4. 4 ml (Verhältnis 1:5) Kulturmedium (Schritt 2.5), Trypsin-Aktion zu stoppen und entmischen bei 259 X g für 6 min bei RT Waschen ein anderes 2 Mal mit 2 mL PBS bei RT
  5. Befestigen Sie die behandelten oder unbehandelten hDPSCs mit 4 % Paraformaldehyd in PBS für 10 min bei 4 ° c
  6. Permeabilize hDPSCS mit 0,1 % (V/V) nichtionisches Tensid mit PBS-Puffer für zusätzliche 10 min bei RT
  7. Führen Sie die Sperrung mit 5 % getrockneten Magermilch in 1 mL PBS für 1 h bei RT
  8. 3 Mal mit 1 mL PBS waschen und inkubieren Sie die Zellen mit Anti-CD105 (1: 100 / 5 x 105 Zellen), Anti-CD44 (1: 100 / 5 x 105 Zellen), Anti-STRO-1 (1: 100 / 5 x 105 Zellen), Anti-CD90 (1: 100 / 5 x 105 Zellen), Anti-CD73 (1: 100 / 5 x 105 Zellen), anti-β3-Tubulin (1: 100 / 5 x 105 Zellen), Anti-NFH (1: 100 / 5 x 105 Zellen) und Anti-GAP43 (1: 100 / 5 x 105 Zellen) mAb für 1 h bei RT
  9. Die Zellen 3 Mal mit 1 mL PBS waschen und inkubieren Sie mit Anti-Maus-PE (01:50 / 5 x 105 Zellen) oder Anti-Kaninchen-CY5 (01:50 / 5 x 105 Zellen) mAb für zusätzliche 1 h bei RT
  10. Verwenden Sie die sekundäre Antikörper für gating Immunopositive Zellen (Anti-Maus-PE oder Anti-Kaninchen-CY5-mAb) und analysieren Sie alle Proben mit einem Durchflusszytometer und erwerben Sie mindestens 20.000 Veranstaltungen.

7. Bewertung der PrPC Ausdruck in hDPSCs von Flow Cytometry Analysis

  1. Kultur der hDPSCsin-6-Well-Platten (2 x 105 Zellen/mL) mit 2 mL Kulturmedium (Schritt 2.5).
  2. Lösen Sie hDPSCs mit 21 und 28 Tagen Zahnpulpa Trennung und nach 7 bzw. 14 Tage mit neuronalen Kulturmedium (Schritt 5.1) mit 1 mL Trypsin-EDTA zu und stoppen Sie die Trypsin-Aktion zu, wie unter Punkt 6.4 beschrieben. Befestigen Sie die Exemplare mit 4 % Paraformaldehyd in PBS für 10 min bei 4 ° C.
  3. Permeabilize mit 0,1 % (V/V) nichtionischen Surfactantin PBS für 10 min bei RT. Entfernen Sie den Überstand und die Zellen mit Kaninchen Anti-PrP mAb EP1802Y (01:50 / 5 x 105 Zellen) Flecken mAb für 1 h bei RT inkubieren mit Anti-Kaninchen CY5 (01:50 / 5 x 105 Zellen) mAb für zusätzliche 1 h bei RT
  4. Alle Proben mit einem Durchflusszytometer analysiert und mindestens 20.000 Veranstaltungen zu erwerben.

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Ergebnisse

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Die Isolierung und Trennung Verfahren des hDPSCs von Zahnpulpa, gewonnen aus der dritte Molar sind komplexe Prozesse, in denen kleine Veränderungen ein ruinöse Ergebnis führen kann. In diesem Papier verwenden wir das Protokoll des Arthur Et Al. 12 mit einigen Verbesserungen. Eine repräsentative Regelung der Verfahren ist in Abbildung 1dargestellt.

hDPSCs stellt eine ...

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Diskussion

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Dabei konzentrierten wir uns auf Methoden zur Isolierung und neuronale Differenzierung der hDPSCs; Darüber hinaus haben wir die Rolle des PrPC in diesem Prozess ausgewertet. Es gibt verschiedene Methoden, zu isolieren und hDPSCs in Neuron-wie Zellen und kritischen Schritte während des Prozesses zu unterscheiden. hDPSCs sind in der Lage, mehrere Linien wie Neuronen, Chondroblasten, Adipozyten und Osteoblasten differenzieren. In unserem Paper untersuchten wir die Mechanismen der neuronale Differenzierung und das...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde von der "Fondazione Varrone" und Rieti Universität Hub "Sabina Universitas" zu Vincenzo Mattei unterstützt.

Abbildung 5 (A, B) abgedruckt mit freundlicher Genehmigung des Verlags Taylor & Francis Ltd aus: Rolle des Prion-Protein-EGFR multimolecular Komplex während neuronaler Differenzierung der menschlichen dental Pulp-Stammzellen. Martellucci, S., Manganelli V. C. Santacroce, Santilli F., Piccoli L., M. Sorice Mattei V. Prion. 2018 4 Mar. Taylor & Francis Ltd.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Amphotericin B-LösungSigma-AldrichA2942Es wird zur Ergänzung von Zellkulturmedien verwendet, es ist ein Polyen-Antimykotikum von Streptomyce
Anti-B3tubulinCell Signaling Technology #4466Als eine von sechs B-Tubulin-Isoformen wird sie während der fetalen und postnatalen Entwicklung stark exprimiert, bleibt aber im peripheren Nervensystem hoch
Anti-CD105 BD Biosciences611314Endoglin (CD105), ein Hauptglykoprotein des menschlichen Gefäßendothels, ist ein integrales Membranprotein vom Typ I mit einer großen extrazellulären Region, einer hydrophoben Transmembranregion und einem kurzen zytoplasmatischen Schwanz
Anti-CD44MilliporeCBL154-20ulPositive Zellmarker Antikörper, die gegen mesenchymale Stammzellen gerichtet
sind Anti-CD73 Zellsignaltechnologie 13160CD73 ist ein 70 kDa Glykosylphosphatidylinositol-verankertes, membrangebundenes Glykoprotein, das die Hydrolyse von extrazellulären Nukleosidmonophosphaten in bioaktive Nukleoside katalysiert
Anti-CD90MilliporeCBL415-20ulPositive Zellmarker Antikörper, die gegen mesenchymale Stammzellen gerichtet
sind Anti-GAP43 Zellsignaltechnologie #8945Ist ein spezifisches, wachstumsassoziiertes Protein des Nervensystems in Wachstumskegeln und Bereichen mit hoher Plastizität
Anti-Maus PE Abcamab7003ist ein Antikörper, der in der Durchflusszytometrie oder FACS-Analyse verwendet wird
Anti-NFH Zellsignaltechnologie #2836ist ein Antikörper, der endogene Spiegel des gesamten Neurofilament-H-Proteins
Anti-PrP mAb nachweist EP1802Y Abcamab52604Kaninchen monoklonal [EP 1802Y] zu Prion Protein PrP
Anti-Kaninchen CY5 Abcamab6564ist ein Antikörper, der in der Durchflusszytometrie oder FACS-Analyse verwendet
Anti-STRO 1MilliporeMAB4315-20ulPositive Zellmarker Antikörper, die gegen mesenchymale Stammzellen gerichtet
B27 Supp XF CTSGibco von life technologiesA14867-01B-27  kann verwendet werden, um die Induktion von humanen neuralen Stammzellen (hNSCs) aus pluripotenten Stammzellen (PSCs), die Expansion von hNSCs, Differenzierung von hNSCs und Erhaltung reifer differenzierter Neuronen in Kultur
BD Accuri C6 Durchflusszytometer BD BiosciencesAC6531180187Durchflusszytometer, ausgestattet mit einem blauen Laser (488 nm) und einem roten Laser (640 nm)
BD Accuri C6 Software BD BiosciencesSteuert das BD Accuri C6 Durchflusszytometer-System, um Daten zu erfassen, Statistiken zu erstellen und Ergebnisse zu analysieren
bFGFPeproThec, DBA100-18Bbasischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor 
Zentrifuge CL30RTermo fisher Scientific11210908es ist ein Gerät, das zur Trennung von Flüssigkeiten, Gas oder Flüssigkeit verwendet wird, basierend auf der Dichte
CO2 Inkubator 3541Termo fisher Scientific317527-185es gewährleistet optimale und reproduzierbare Wachstumsbedingungen für Zellkulturen
Kollagenase, Typ IV & nbsp;Life Technologies17104019Kollagenase ist eine Protease, die die Bindung zwischen einer neutralen Aminosäure (X) und Glycin in der Sequenz Pro-X-Glyc-Pro spaltet, die mit hoher Frequenz in Kollagen vorkommt.
Swann-Morton501Es wird verwendet, um Gewebe
zu schneiden DMEM-LEurocloneECM0060LDulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose mit L-Glutamin mit Natriumpyruvat
EGFPeproThec, DBAAF-100-15Epidermaler Wachstumsfaktor 
Fetal Bovine SerumGibco von life technologies10270-106FBS ist ein beliebtes Nahrungsergänzungsmittel, da es eine breite Palette von Funktionen in der Zellkultur bietet. FBS liefert Nährstoffe, Wachstums- und Bindungsfaktoren und schützt die Zellen vor oxidativen Schäden und Apoptose durch Mechanismen, die in serumfreien Medien (SFM)-Systemen schwer zu reproduzieren sind
Filtropur BT50 0,2.500 mL FlaschenaufsatzfilterSarstedt831.823.101Es ist ein Gerät, das zur Filtration von Lösungen verwendet wird
Flexitube GeneSolution für PRNPQiagenGS56214 siRNAs für das Entrez-Gen 5621. Zielsequenz N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA  N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA  N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA  Nr. 4  Die
Lösung von Hank 1xGibco von life technologies240200083Die wesentliche Funktion von Hanks′ Ausgewogene Salzlösung dient zur Aufrechterhaltung des pH-Werts sowie des osmotischen Gleichgewichts. Es versorgt die Zellen auch mit Wasser und essentiellen anorganischen Ionen
HiPerFect Transfektionsreagenz Qiagen301705HiPerFect Transfect Reagenz ist eine einzigartige Mischung aus kationischen und neutralen Lipiden, die eine effektive siRNA-Aufnahme und eine effiziente Freisetzung von siRNA in Zellen ermöglicht, was zu einem hohen Gen-Knockdown führt, selbst wenn niedrige siRNA-Konzentrationen
von Gibco by life technologiesist ein Basalmedium 10888022, das für die langfristige Erhaltung und Reifung reiner postnataler und adulter Gehirnneuronen entwickelt wurde.
ParaformaldehydSigma-Aldrich30525-89-4Paraformaldehyd wird zur Fixierung von Zell- und Gewebeschnitten während der Färbung
Penicillin/Streptomycin verwendet.EurocloneECB3001D Es wird zur Ergänzung von Zellkulturmedien verwendet, um die bakterielle Kontamination zu kontrollieren
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)EurocloneECB4004LX10 PBS ist eine ausgewogene Salzlösung, die für die Handhabung und Kultivierung von Säugetierzellen verwendet wird. PBS wird verwendet, um Säugetierzellen zu bewässern, zu waschen und zu verdünnen. Phosphatpufferung hält den pH-Wert im physiologischen Bereich
TC-Platte 6 Well, Cell+,FSarstedt833,920,300Es ist eine Wachstumsoberfläche für adhärente Zellen
Gewebekulturkolben T-25,Cell+,Belüftete KappeSarstedt833,910,302Gewebekulturkolben T-25, Polystyrol, Cell+ Wachstumsfläche für empfindliche adhärente Zellen, z.B. Primärzellen, schräger Hals, Beatmungskappe, gelb, steril, pyrogenfrei, nicht zytotoxisch, 10 Stk./Beutel
Triton X-100 Sigma-Aldrich9002-93-1Weit verbreitetes nichtionisches Tensid zur Rückgewinnung von Membrankomponenten unter milden, nicht denaturierenden Bedingungen
Trypsin-EDTA EurocloneECB3052D Trypsin spaltet Peptide auf der C-terminalen Seite von Lysin- und Arginin-Aminosäureresten. Trypsin wird verwendet, um adhärente Zellen von einer Kulturoberfläche zu entfernen
RöhrchenSarstedt62,554,502Röhrchen 15 mL, 120 mm x17 mm, PP
VBH 36 C2 CompactSteril ST-003009000Bietet umfassenden Schutz für die Umwelt und den Arbeiter
ZEISS Axio Vert.A1 – Invertiert  MikroskopZeiss3849000962ZEISS Axio Vert.A1 bietet einen einzigartigen Einstiegspreis und kann alle Kontrasttechniken bieten, einschließlich Hellfeld, Phasenkontrast, PlasDIC, VAREL, verbesserter Hoffman-Modulationskontrast (iHMC), DIC und Fluoreszenz. Integrierte LED-Beleuchtung für eine schonende Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Zellen. Der Axio Vert.A1 ist ergonomisch für Routinearbeiten konzipiert und kompakt genug, um in Gewebekulturhauben zu sitzen.
wird sind . verwendet werden.Das Neurobasal-A-Medium von

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Robey, P. G., Kuznetsov, S. A., Riminucci, M., Bianco, P. Bone marrow stromal cell assays: in vitro and in vivo. Methods in Molecular Biology. 1130, 279-293 (2014).
  2. Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418, 1-49 (2002).
  3. Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24, 1294-1301 (2006).
  4. Zannettino, A. C. W., et al. Multi-potential Human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. Journal of Cellular Physiology. 214, 413-421 (2008).
  5. Mattei, V., et al. Role of lipid rafts in neuronal differentiation of dental pulp-derived stem cells. Experimental Cell Research. 339, 231-240 (2015).
  6. Jansen, J., Hanks, S., Thompson, J. M., Dugan, M. J., Akard, L. P. Transplantation of hematopoietic stem cells from the peripheral blood. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 9 (1), 37-50 (2005).
  7. Young, F. I., et al. Clonal heterogeneity in the neuronal and glial differentiation of dental pulp stem/progenitor cells. Stem Cells International. 2016, 1290561(2016).
  8. Pisciotta, A., et al. Human dental pulp stem cells (hDPSCs): isolation, enrichment and comparative differentiation of two sub-populations. BMC Developmental Biology. 15, 14(2015).
  9. Atari, M., et al. Dental pulp of the third molar: a new source of pluripotent-like stem cells. Journal of Cell Science. 125, 3343-3356 (2012).
  10. Koyama, N., Okubo, Y., Nakao, K., Bessho, K. Evaluation of pluripotency in human dental pulp cells. Journal of oral and maxillofacial surgery: official journal of the American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 67, 501-506 (2009).
  11. Gronthos, S., et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. Journal of Dental Research. 81, 531-535 (2002).
  12. Arthur, A., Rychkov, G., Shi, S., Koblar, S. A., Gronthos, S. Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues. Stem Cells. 7, 1787-1795 (2008).
  13. Lee, Y. J., Baskakov, I. V. The cellular form of the prion protein is involved in controlling cell cycle dynamics, self-renewal, and the fate of human embryonic stem cell differentiation. Journal of Neurochemistry. 124, 310-322 (2013).
  14. Steele, A. D., Emsley, J. G., Ozdinler, P. H., Lindquist, S., Macklis, J. D. Prion protein (PrPc) positively regulates neural precursor proliferation during developmental and adult mammalian neurogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 3416-3421 (2006).
  15. Wulf, M. A., Senatore, A., Aguzzi, A. The biological function of the cellular prion protein: an update. BMC Biology. 15, 34(2017).
  16. Mattei, V., et al. Recruitment of cellular prion protein to mitochondrial raft-like microdomains contributes to apoptosis execution. Molecular Biology of the Cell. 22, 4842-4853 (2011).
  17. Linden, R. The Biological Function of the Prion Protein: A Cell Surface Scaffold of Signaling Modules. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 77(2017).
  18. Garofalo, T., et al. Role of mitochondrial raft-like microdomains in the regulation of cell apoptosis. Apoptosis. , 621-634 (2015).
  19. Watt, N. T., et al. Reactive oxygen species-mediated beta-cleavage of the prion protein in the cellular response to oxidative stress. The Journal of Biological Chemistry. 280, 35914-35921 (2005).
  20. Mattei, V., et al. Morphine Withdrawal Modifies Prion Protein Expression in Rat Hippocampus. PLoS One. 12, 0169571(2017).
  21. Hu, W., et al. Prion proteins: physiological functions and role in neurological disorders. Journal of the Neurological Sciences. 264, 1-8 (2008).
  22. Sorice, M., et al. Trafficking of PrPC to mitochondrial raft-like microdomains during cell apoptosis. Prion. 6, 354-358 (2012).
  23. Martellucci, S., et al. Role of Prion protein-EGFR multimolecular complex during neuronal differentiation of human dental pulp-derived stem cells. Prion. 12 (2), 117-126 (2018).
  24. Lee, Y. J., Baskokov, I. V. The cellular form of the prion protein guides the differentiation of human embryonic stem cell into neuron-, oligodendrocyte- and astrocyte-committed lineages. Prion. 8, 266-275 (2014).
  25. Huang, G. T., Sonoyama, W., Chen, J., Park, S. H. In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments. Cell and Tissue Research. 324, 225-236 (2006).
  26. Suchanek, J., et al. Dental pulp stem cells and their characterization. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacký. 153, Olomouc, Czechoslovakia. 31-35 (2009).
  27. Bressan, E., et al. Donor age-related biological properties of human dental pulp stem cells change in nanostructured scaffolds. PLoS One. 7 (11), 49146(2012).

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