Reinigung der dendritischen Filopodia-reichen Fraktion

Zusammenfassung

In diesem Protokoll führen wir eine Methode zur Reinigung der dendritischen filopodiareichen Fraktion aus der phagozytischen Cup-ähnlichen Vorsprungstruktur auf kultivierten Hippocampus-Neuronen ein, indem wir die spezifische und starke Affinität zwischen einem dendritischen Filopodialen Adhäsionsmolekül, TLCN, und ein extrazelluläres Matrixmolekül, vitronectin.

Zusammenfassung

Dendritische Filopodia sind dünne und lange Vorsprünge, die auf dem Actin-Filament basieren, und sie dehnen sich aus und ziehen sich zurück, als ob sie nach einem Zielaxon suchen. Wenn die dendritischen Filopodia Kontakt mit einem Zielaxon herstellen, beginnen sie, zu Stacheln zu reifen, was zur Bildung einer Synapse führt. Telencephalin (TLCN) ist reichlich in dendritischen Filopodien lokalisiert und wird nach und nach von Stacheln ausgeschlossen. Die Überexpression von TLCN in kultivierten Hippocampus-Neuronen induziert die dendritische Filopodia-Bildung. Wir zeigten, dass Telencephalin stark an ein extrazelluläres Matrixmolekül, vitronectin, bindet. Vitronectin-beschichtete Mikroperlen induzierten phagozytische Tasse Bildung auf neuronalen Dendriten. In der phagozytischen Tasse, TLCN, TLCN-bindende Proteine wie phosphorylierte Sezrin/Radixin/Moesin (Phospho-ERM), und F-Actin sind angesammelt, was darauf hindeutet, dass Komponenten der phagozytischen Tasse denen der dendritischen Filopodia ähneln. So entwickelten wir eine Methode zur Reinigung der phagozytischen Tasse anstelle der dendritischen Filopodia. Magnetische Polystyrolperlen wurden mit Vitronectin beschichtet, das im Kulturmedium der Hippocampus-Neuronen reichlich vorhanden ist und phagozytische Becherbildung bei neuronalen Dendriten induziert. Nach 24 h Inkubation wurden die phagozytischen Becher leicht mit Waschmittel verwoben und mit einem Magnetabscheider gesammelt. Nach dem Waschen der Perlen wurden die Bindungsproteine eluiert und durch Silberfärbung und Western-Blotting analysiert. In der Bindungsfraktion waren TLCN und Actin reichlich vorhanden. Darüber hinaus wurden viele Proteine, die aus der Fraktion identifiziert wurden, auf die dendritische Filopodia lokalisiert; Daher nannten wir die Bindungsfraktion die dendritische filopodiareiche Fraktion. Dieser Artikel beschreibt Details über die Reinigungsmethode für die dendritische filopodiareiche Fraktion.

Einleitung

Dendritische Filopodia werden als Vorläufer von Stacheln angenommen. Actin Filamente in der dendritischen Filopodia regulieren ihre Ausdehnung und Rückzug^1,2,3. Nach Kontakt mit einem Axon beginnen ausgewählte dendritische Filopodien ihre Reifung in Stacheln, und eine Synapse wird^{gebildet 4,5}. Komponenten der Stacheln wurden aus einer umfassenden Analyse der postsynaptischen Dichtefraktionen^6,7bestimmt, während Komponenten der dendritischen Filopodia weitgehen....

Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee von RIKEN Wako genehmigt.

1. Kultur der Hippocampus-Neuronen

1. Vorbereitung des Kulturmediums
   1. Zubereitung von 200x Vitaminmischung. Lösen Sie 100 mg D-Pantothensäure-Hemicalciumsalz, 100 mg Cholinchlorid, 100 mg Folsäure, 180 mg I-Inositol, 100 mg Niacinamid, 100 mg Pyridoxal HCl und 100 mg Thiamin HCl in 500 ml Reinstwasser mit einem magnetischen Rührer. Die Lösung ist nicht vollständig aufgelöst. Sorgfältig mischen, in 50 ml-Rohren aliquotieren und bei -20 °C lagern.
   2. Vorbereitung der Riboflavin-Lösung. 100 ....

Ergebnisse

In kultivierten Hippocampus-Neuronen wurde TLCN reichlich auf die dendritische Filopodia, Welle und Soma lokalisiert und mit F-Actin kolokalisiert (Abbildung 1A, B). Wenn Polystyrol-Mikroperlen kultivierten Hippocampus-Neuronen zugesetzt wurden, wurden die Perlen automatisch mit Vitronectin (VN) beschichtet, das aus fetalem Rinderserum (FBS) im Kulturmedium gewonnen wurde; sie waren hauptsächlich an Dendriten gebunden, und sie induzierten die.......

Diskussion

Wir entwickelten eine Reinigungsmethode für die dendritische filopodiareiche Fraktion unter Verwendung einer Affinität zwischen dem Zelladhäsionsmolekül TLCN und dem extrazellulären Matrixprotein vitronectin. Im Vergleich zur PSD-Fraktion könnte es möglich sein, die synaptischen Proteine, die auf die unreife Synapse wirken, aus der dendritischen filopodiareichen Fraktion zu identifizieren. So unterscheiden sich die Bestandteile der dendritischen filopodiareichen Fraktion um 74% von denen der PSD-Fraktion. Anders als die .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1 M HEPES	Gibco	15630-080
1,7 mLl Low Binding MCT	Sorenson BioScience	39640T
200 mM L-Glutamin	Gibco	2530149
35 mm Kunststoff-Zellkulturschalen	Corning	430165
Anti-Aktin	Sigma-Aldrich	A-5060
Anti-Alpha-Actinin	Sigma-Aldrich	A-5044
Anti-Alpha-Tubulin	Sigma-Aldrich	T-9026
Anti-Ezrin	Sigma-Aldrich	Klon 3C12, SAB4200806
Anti-Galphaq	Santacruz	sc-393
Anti-MAP2	Chemicon	Klon AP20, MAB3418
Anti-Moesin	Sigma-Aldrich	Klon 38/87, M7060
Anti-PLCbeta1	Santacuz	sc-5291
Anti-PSD95	MA2	ABR
Anti-Spectrin beta	Chemicon	MAB1622
B27	Gibco	0080085SA
BCA Protein Assay Kit	Thermo	23227
Bromphenol blau	Merck	1.08122.0005
Calciumchrolid, wässrig	Wako	038-19735
Zellschaber	Falcon	353085
Zellsieb	Falcon	352350
Cholinchlorid	Sigma-Aldrich	C7527
Vollständiger EDTA-freier Proteaseinhibitor-Cocktail	Roche	11873580001
Cytosin Beta-D-Arabinofuranosid	Sigma-Aldrich	C-6645
DNase-I	Sigma-Aldrich	DN-25
D-Pantothensäure Hemicalciumsalz	Sigma-Aldrich	P5155
DynaMag-2 Magnet	Thermo	12321D
ECL Prime Western Blotting Detection Reagenz	GE	RPN2232
e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE Gradientengel	ATTO	E-T520L
Folsäure	Sigma-Aldrich	F8758
HBSS	Gibco	14175095
HRP-konjugiertes Anti-Kaninchen-IgG	Jackson ImmunoResearch	111-035-144
i-Inositol	Sigma-Aldrich	I7508
LAS-1000 mini	Fuji Film	LAS-1000 mini	Zum Nachweis von Lumineszenz aus WB-Membran
Magnetische Polystyrol-Mikrokügelchen	Sperotech	PM-20-10
MEM-Aminosäurelösung	Gibco	11130-051	30 mM L-Argininhydrochlorid, 5 mM L-Cystin, 10 mM L-Histidinhydrochlorid-H2O, 20 mM L-Isoleucin, 20 mM L-Leucin, 19,8 mM L-Lysinhydrochlorid, 5,1 mM L-Methionin, 10 mM L-Phenylalanin, 20 mM L-Threonin, 2,5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosin und 20 mM L-Valin
Mini-Elektrophoresesystem	ATTO	AE-6530
Niacinamid	Sigma-Aldrich	N0636
Penicilin / Streptomycin	Gibco	15070063
PhosSTOP Phosphatasehemmer Cocktail	Roche	4906845001
Poly-L-Lysinhydrobromid	Nacali	28360-14
Pyridoxal HCl	Sigma-Aldrich	P6155
Riboflavin	Sigma-Aldrich	R9504
Silberfleck 2 Kit wako	Wako	291-5031
Thiamin HCl	Sigma-Aldrich	T1270
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell	Bio-rad	1703940JA
Reinstwasser	MilliQ		Zur Herstellung von Reinstwasser