Wachstum und Charakterisierung der bestrahlten Organoide aus den Brustdrüsen

Zusammenfassung

Organoide, die sich aus den Meeressammrissen entwickelten, wurden bestrahlt und charakterisiert, um epitheliale Merkmale und Wechselwirkungen mit Immunzellen zu beurteilen. Bestrahlte Organoide können verwendet werden, um Wechselwirkungen mit Zellen besser zu bewerten, die zu der Rekrutierung von Tumorzellen in bestrahltem normalem Gewebe führen können.

Zusammenfassung

Organoide, die aus dem verdauten Gewebe gewonnen werden, sind mehrstufige dreidimensionale (3D) Konstrukte, die in vivo-Bedingungen besser rekapitulieren als Zellmonolayers. Obwohl sie nicht vollständig in vivo-Komplexität modellieren können, behalten sie eine gewisse Funktionalität der ursprünglichen Orgel. Bei Krebsmodellen werden Organoide häufig verwendet, um Tumorzelleinfälle zu untersuchen. Dieses Protokoll zielt darauf ab, Organoide aus dem normalen und bestrahlten Maus-Mammargewebe zu entwickeln und zu charakterisieren, um die Strahlenreaktion in normalen Geweben zu bewerten. Diese Organoide können in zukünftigen In-vitro-Krebs-Studien eingesetzt werden, um Tumorzellinteraktionen mit bestrahlten Organoiden zu bewerten. Die Brustdrüsen wurden resutiert, auf 20 Gy bestrahlt und in einer Kollagenase VIII Lösung verdaut. Epitheliale Organoide wurden durch Zentrifugaldifferenzierung getrennt, und 3D-Organoide wurden in 96-gut niedrig haftenden Mikroplatten entwickelt. Organoide drückten das charakteristische epitheliale Marker Cytokeratin 14 aus. Die Makrophage-Interaktion mit den Organoiden wurde in Ko-Kultur-Experimenten beobachtet. Dieses Modell kann nützlich sein, um Tumorstrominteraktionen, Infiltration von Immunzellen und Makrophage-Polarisation in einer bestrahlten Mikroumgebung zu untersuchen.

Einleitung

Etwa 60% der dreifachen negativen Brustkrebspatientinnen (TNBC) wählen^dieBrustkonservierungstherapie (BCT) als Behandlungsform 1. Bei dieser Behandlungsmodalität wird der Tumor, der einen Teil des Brustgewebes enthält, entfernt, und das umgebende normale Gewebe ist ionisierender Strahlung ausgesetzt, um alle verbleibenden Tumorzellen abzutöten. Die Behandlung reduziert die Wiederholung in weiten Teilen der Brustkrebspopulation; Allerdings sind etwa 13,5% der behandelten Patienten mit TNBC^Erfahrunglocoregional Wiederholungen 2. Daher wird die Untersuchung, wie Strahlung zirkulierende Tumorzellen rekrutieren kann (CTCs), z....

Protokoll

Tierstudien wurden in Übereinstimmung mit den vom Vanderbilt der Institutional Animal Care and Use Committee der Vanderbilt Universität genehmigten Tierstudien durchgeführt.

1. Vorbereitung von Mäusen und Zellaufnahme (angepasst von Nguyen-Ngoc et al.¹¹)

1. Opfere athymische Nu/Nu-Mäuse (8-10 Wochen alt) mit CO₂ Erstickung, gefolgt von Gebärmutterhalskrebs. Reinigen Sie die Haut mit 70% Ethanol.
2. Mit vorsterilisierter Schere und Zangen werden Bauch-und Leistenmischdrüsen von Mäusen entfernt. Lymphknoten vor dem Resektion entfernen. Spülen Sie in sterilen 1x Phosphat-gepufferten Salinen (PBS....

Ergebnisse

Bestrahlte epitheliale Säugetierorganoide wurden erfolgreich aus mausischen Brustdrüsen gewonnen, verarbeitet und auf Low-adhesion-Platten kultiviert (Abbildung1). Die Organoid-Ausbeute wurde durch Aussaat in verschiedenen Wachstumsumgebungen getestet (Abbildung 2A-G). Die Nähzellen direkt auf der Gewebekultur behandelten 10 cm Zellplatten führten zu einem Überwuwachs an Fibroblastzellen. Fibroblasten wurden in Phasenkontrastmikroskopie in oder in der Nähe der gleichen Fokus.......

Diskussion

In diesem Protokoll haben wir eine Methode für reproduzierbares Wachstum und Charakterisierung von bestrahlten Säugetierorganoiden entwickelt (Abbildung1). Eine Bestrahlungsdosis von 20 Gy wurde auf Spiegel früherer in vivo-Modellen der Tumorzellrekrutierung⁵angewendet. Die Bestrahlung der Brustdrüsen ex vivo vor der Organoidbildung ermöglichte die Isolierung von Strahlenschädefeffekten ohne eine entsprechende Infiltration von Immunzellen. Die Entwicklung eines in vit.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10% neutrales gepuffertes Formalin	VWR	16004-128
Anti-Cytokeratin 14	abcam	ab181595	Los: GR3200524-3
Rinderserumalbumin	Sigma	A1933-25G
Kollagen Typ I	Corning	354236
Kollagenase aus Clostridium Histolyticum, Typ VIII	Sigma	C2139
Kollagenase I	Gibco	17018029
DMEM/F12	Thermofisher	11320-033
DNAse	Roche	10104159001
DPBS	Fisher	14190250
E-Cadherin	Cell Signaling	24E10	Los: 13
FBS	Sigma	F0926
Gentamicin	Gibco	15750
Ziege Anti-Kaninchen sekundär		abcam ab150077	grün Los: GR3203000-1
Ziege Anti-Kaninchen sekundär	abcam	ab150080	rot Los: GR3192711-1
Hoechst 33342	Fisher	62249	Los: TG2611041
Insulin (10 mg/ml)	Sigma	I9278
Insulin-Transferrin-Selen, 100x	Gibco	51500-056
Matrigel-Basalmembran (Basalmembran extrahiert aus Engelbreth-Holm-Swarm-Maussarkom)	Corning	356237
Normales Ziegenserum	Vector Laboratories	S-1000
Nuclon Sphera 96-Well-Platten	Thermo	174927
PBS	VWR	10128-856
Stift-/Streptokokken-Fischer
Phalloidin	abcam	ab176757	Los: GR3214582-16
Tight Junction Protein 1	Novus	NBP1-85047	Los: C115428
Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylenglykol)	Sigma	X100-100ML
Trypsin	Gibco	27250-018
Tween-20 (Polyethylenglykol-Sorbitanmonolaurat)	Sigma	P1379-100ML

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