Die thermische Stabilität der Enzym-Aktivität wird leicht durch isothermen Titration Kalorimetrie (ITC) gemessen. Die meisten Protein Stabilität Assays derzeit verwendet Maßnahme Protein entfaltet, aber keine Informationen über enzymatische Aktivität. ITC ermöglicht die direkte Bestimmung der Wirkung des Enzyms Modifikationen auf die Stabilität der Enzym-Aktivität.
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Methodenartikel
Enzymatische Stabilität durch isothermen Titration Kalorimetrie Messung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Diese Arbeit zeigt eine neue Methode zur Messung der Stabilität der Enzymaktivität durch isothermen Titration Kalorimetrie (ITC). Der Gipfel Wärmerate nach eine einzige Injektion der Substrat-Lösung in eine Enzymlösung mit Enzym-Aktivität korreliert ist zu beobachten. Mehrere Injektionen des Substrates in das gleiche Enzym-Lösung im Laufe der Zeit zeigen den Verlust der Enzymaktivität. Der Test ist autonom, erfordert sehr wenig Personal Zeit und ist für die meisten Medien und Enzyme.
Einleitung
Enzyme sind Proteine, die in der Lage, eine breite Palette von organischen Reaktionen katalysieren. Die meisten Enzyme Funktion in wässriger Lösung an in der Nähe von neutralen pH-Wert, wodurch den Einsatz von harten Lösungsmitteln. Wegen der hohen Selektivität, katalysierten Enzymreaktionen produzieren weniger (in einigen Fällen keine Nebenprodukte) Nebenprodukte als nicht-selektive Katalysatoren wie Säuren und Laugen1. Dies ist besonders relevant in der Lebensmittel verarbeitenden wo alle chemische Reaktionen durchgeführt werden müssen, so dass das Endprodukt für den menschlichen Verzehr unbedenklich ist. Derzeit werden Enzyme verwendet, um h....
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Protokoll
1. Vorbereitung der Proben
-
1.000 mL 0,1 M-Natrium-Acetat-Puffer bei pH 4.6
- 800 mL destilliertem Wasser in ein Becherglas 1.000 mL Schloss zu messen.
- Gewicht 8,2 g wasserfreiem Natriumacetat und fügen Sie es den Becher.
- Stellen Sie den Becher auf einem Teller rühren, place einen rühren Stab in das Becherglas, schalten Sie die Platte rühren und rühren vollständig aufgelöst.
- Wenn wasserfreiem Natriumacetat vollständig aufgelöst ist, Messen Sie den pH-Wert der Lösung mit einem kalibrierten pH-Meter.
- Fügen Sie 1 M HCl oder NaOH entsprechend um den gewünschten pH-Wert 4,6 zu erhalten. <....
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Ergebnisse
Die repräsentativen Ergebnisse in Abbildung 1 und Abbildung 5 zeigen Daten aus zwei Enzyme, Laktase und Invertase. Laktase und Invertase katalysieren die Hydrolyse von einem Disaccharid in zwei Monosaccharide, endothermically und exotherm, beziehungsweise. Beide enzymatischen Reaktionen wurden bei Konzentrationen ausgeführt, die Sättigung des Enzyms ausgeschlossen.
Die Laktase-Daten zeigen, Verwendung von ITC Daten Enzymstabilität sch.......
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Diskussion
Automatisierung ist ein großer Vorteil des ITC Enzym Stabilität Tests hier beschrieben. Sobald die entsprechende Puffer und Lösungen vorgenommen werden, wird die Rüstzeit für jedes Assay ca. 15 min für die Person, die den Assay. Im Gegensatz dazu die konventionellen Assays für die Invertase und Laktase-Aktivität erfordern ca. 2 h mit kontinuierlichen Beteiligung von der Person, die die Probe und viele enzymatische Aktivität Assays nehmen wesentlich mehr Personenstunden. In einer früheren Publikation haben wir gezeigt, wi.......
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| a-Laktose | Fisher Scientific | unbekannt (zu alt) | 500g |
| Natriumacetat, wasserfrei 99% min | Alfa Aesar | A13184-30 | 250g |
| Laktase | MP Bio | 100780 | 5g |
| Salzsäurelösung, 1N | Fisher Wissenschaftlich | SA48-500 | 500 ml |
| Tischmessgerät - pH | VWR | 89231-622 | |
| Ethanol 70% | Fisher Scientific | BP8231GAL | 1-Gallonen |
| Micro-90 | Fisher Scientific | NC024628 | 1L (Reinigungslösung) |
Referenzen
- Anastas, P., Eghbali, N. Green chemistry: principles and practice. Chemical Society Reviews. 39 (1), 301-312 (2010).
- Jin, L. Q., et al. Immobilization of Recombinant Glucose Isomerase for Efficient Production of High Fructose Corn S....
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Nachdrucke und Genehmigungen
