Summary
פרוטוקול זה מתאר הליך מפורט עבור השעיית מחדש ו culturing תא גזע אנושי נגזר שהיו הבדיל בעבר מושלתי עצביים בתוך מבחנה במשך שבועות מרובים. ההליך מאפשר הדמיה מבוססי מבוסס על neurites, סינפסות, וסמנים מאוחר ביטוי עצבי בפורמט תואם עם מיקרוסקופ אור והקרנת תוכן גבוה.
Abstract
נוירונים הבדיל בתרבות דו מימדית מפני הגזע האנושי האנטי-עוצמה הנגזר של התאים (NPCs) מייצגים מערכת מודל רבת עוצמה כדי לחקור מנגנוני מחלות ולבצע הקרנת תוכן גבוה (HCS) כדי לחקור תרכובת ספריות או לזהות פנוטיפים מוטציה של גנים. עם זאת, עם התאים האנושיים המעבר NPC כדי פונקציונלי, בוגרת תא העצב דורש מספר שבועות. הסינפסות בדרך כלל להתחיל להיווצר לאחר 3 שבועות של בידול בתרבות דופלקס, ומספר חלבונים ספציפיים לעצב, למשל מאוחר יותר המבטא פאן-עצבי סמן neun, או השכבה 5/6 מוחין תא העצב הקליפת המוח סמן CTIP2, להתחיל לבטא סביב 4-5 שבועות לאחר בידול. זמן זה בידול ארוך יכול להיות בלתי תואם עם תנאי התרבות האופטימלית המשמש נפח קטן, multi-היטב פלטפורמות HCS. בין האתגרים הרבים הינם הצורך בתאים מבוזרים ומפוזרים בצורה אחידה עם אשכולות תאים מינימליים, והליכי תרבות המאומצים על הכדאיות ארוכת הטווח וההבשלה הפונקציונלית של הסינפסה. גישה אחת היא להבדיל נוירונים בפורמט גדול נפח, ואז לשחזר אותם בשלב מאוחר יותר ב HCS תואם multi-בארות. כמה אתגרים עיקריים כאשר משתמשים בגישה זו ציפוי מחדש מודאג הכדאיות ויכולת התאים, בשל שיבוש מלחיץ של רשת הדנדריטים והאקונאליות. כאן אנו מדגימים הליך מפורט ואמין עבור השעיית האדם המושרה בצורה מבחינה אנזיבית (היפנוטית)-נגזר הנוירונים לאחר הבידול שלהם עבור 4-8 שבועות בפורמט גדול של נפח, העברת אותם 384-היטב microtiter צלחות, ו culturing אותם לעוד 1-3 שבועות עם הישרדות תא מעולה. זה ציפוי מחדש של נוירונים אנושיים לא רק מאפשר את המחקר של הרכבה סינפסה בתוך שבועיים מחדש, אבל גם מאפשר מחקרים של התחדשות neurite ומאפיינים חרוט הצמיחה. אנו מספקים דוגמאות של asuritogenesis ו synaptogenesis באמצעות פלטפורמת 384-היטב.
Introduction
תא גזע האדם בעוצמה מרבית (היפנוטית)-הנוירונים הנגזרים רלוונטיים יותר ויותר בתחומים של מחקר בסיסי, פיתוח סמים, ורפואה משובי. זרימות עבודה ופרוצדורות כדי לייעל את התרבות שלהם ואת התחזוקה, ולשפר את היעילות של בידול לתוך תת נוירואליות ספציפיים, מתפתחים במהירות1,2. כדי לשפר את השירות ואת עלות האפקטיביות של תאי גזע האדם הנגזרים הנוירונים כמו מערכות מודל הקלה לניתוח תוכן גבוה בגילוי סמים ואימות היעד, זה שימושי כדי להקטין את זמן culturing הנדרש כדי ליצור בוגרת, פונקציונלי נוירונים, תוך שמירה על החוסן המקסימלי, התוכסות, ו-פנוטיפ. למרות תרבויות תלת ממדיות אורגנואיד הם הנהיגה פריצות דרך במחקר נוירופיתוח מחקר3, 2-מימדי התרבויות תואמות במיוחד עם יישומים מבוססי הדמיה אוטומטית בשל עובי רקמת מינימלי שלהם.
עם זאת, הסתגלות של שיטות הסינון המבוססות על הדמיה למודלים של מחלה נוירולוגית ונוירו-התפתחותית של האדם פרצופים אתגר גדול. מפרקי הזמן הארוכים שבהם מערכת העצבים האנושית מתבשלה בvivo מחייבת הארכה של התרבות כדי להכיל תוכניות טבעיות של ביטוי גנים ולהשיג התבגרות עצבית.
אחת ההשלכות המעשיות של התוכנית הארוכה בידול עצבי הוא כי התחזוקה של תרבויות מונאולאייה הנגזרות חייב להיות מתמשך במשך שבועות רבים כדי להשיג בגרות סינפסה נאותה. בתקופה זו, הושלתי העצביים שנותרו מובחן ממשיכים להתחלק. אלה יכולים להגדיל במהירות את התרבות ולגזול את התוכן התזונתי הנדרש כדי לשמור על הנוירונים קיימא postmitotic. במרץ מחלק את התאים העצביים (NPCs) יכול גם להתחרות עם נוירונים עבור המצע הצמיחה. זה יכול להפוך את התרבויות כגון בעיות של הדבקה גרועה, מצב בלתי מתאים עבור הדמיה מבוססי assays אומר. יתר על כן, חוקרים רבים מוצאים כי נפח התרבות קטן יותר, הקושי לשמור על אוכלוסיות בריאות של נוירונים הבדיל מספיק זמן כדי להתבונן בשלבים המאוחרים של בידול עצבי. במילים אחרות, בחני התבגרות סינפסה באמצעות הקרנת תוכן גבוה (hcs) גישות יכול להיות מאוד מאתגר עבור נוירונים אנושיים נגזר.
כדי לעקוף כמה בעיות אלה, הליך של השעיית מחדש וציפוי מחדש שונות בעבר נוירונים הנגזרים הנגזרות השתמשו. ראשית, זה מאפשר את המחקר של neurite מוצלח (או, מדויק יותר, neurite התחדשות) באוכלוסייה של נוירונים מחויבים לחלוטין. שנית, את הציפוי של הנוירונים הבדיל בעבר מתבנית נפח גדול (כמו 10 לוחות ס"מ או גדול יותר), למטה לתבניות נפח קטן (כמו hcs תואם 96-או 384-ובכן מיקרוטיטר צלחות) מאפשר הפחתה משמעותית בזמן הכולל culturing ב המצב הקטן של אמצעי האחסון. זה מקל על המחקר של הרכבה סינפסה והתבגרות במשך השבועות הבאים בתוך מבחנה.
עם זאת, הציפוי של נוירונים בוגרים שכבר הקימו neurites ארוך ורשת קישוריות מורכבת מציג אתגרים מספר, אחד מהם הוא שיעור גבוה לפעמים משתנה של מוות תאים. כאן, אנו מתארים הליך מחדש שתוצאתו הישרדות תא מעולה והתוכסות. בדרך כלל, נוירונים חשופים אנזימים פרוטטרמין לתקופות דגירה קצר (בדרך כלל ~ 3-10 דקות) על מנת לנתק את התאים מן המצע לפני trituration. הזמן הקצר פרוטפוליזיס זה נוהג להשתמש עבור השעיית מחדש והפסמות סוגים רבים של תאים מפרידים, כולל תאים נוירוונונאליות מובחן ושלתי4,5,6. עם זאת, עבור נוירונים הבדיל הנושאת ארוך, neurites מחוברים, זה חיוני לא רק לנתק תאים מן המצע אלא גם לשבש את הרשת הדנדריטים ו סיבי כדי לבודד תאים בודדים תוך מזעור נזק. אכן, משעבוד עבה של נוירונים בדרך כלל נוטה להתנתק מהמצע כסדין אחד, ולא כתאים בודדים. אם הטיפול לא נלקח כדי לשחרר את הרשת עבה של neurites, נוירונים לא רק להיות ניזוק הפוך במהלך trituration, אבל רבים מהם לא לעבור דרך המסנן המשמש להסרת הגושים, וכתוצאה מכך התשואה התא המסכן. בהמשך אנו מתארים שינוי פשוט הליך הדגירה הנפוצה השימוש הפרוטאז לנגד הקשיים האלה.
בפרוטוקול המתואר להלן, הנוירונים מודבטים עבור 40-45 דקות עם פרוטאז קלה, כגון אנזים פרוטנוגד חרדה (למשל, Accutase). במהלך 5-10 הראשון מינימום לאחר הוספת האנזים, הרשת העצבית מרימה את המצע כגיליון. דגירה המשיכה הפרוטאז עבור 30-40 דקות נוספות לפני שתמשיך באמצעות נשחקו עדין וסינון. זמן דגירה נוסף זה מסייע להבטיח כי העיכול של החומר מרגיע את הרשת הבין-תאית, ובכך להבטיח כי הטריטורציה הבאה מייצרת השעיה של תאים בודדים. הליך זה מגדיל את אחידות התפלגות התאים בעת ציפוי מחדש תוך מזעור מוות התאים. החלתי בהצלחה את השיטה לציפוי מחדש לתרבויות הנוירואליות שנוצרו על ידי פרוטוקולי בידול שונים7,8 ומקווים שונים של hiPSCs. ההליך מתאים בעיקר לשימוש עם רוב או כל הקווים של תאי גזע נגזר הנגזרים. ראינו כי זמן דגירה מורחבת פרוטאז לא חיוני לחלוטין לציפוי תרבויות מלוחות בפורמט קטן (למשל, 35 מ"מ קוטר); עם זאת, כפי שאנו מראים כאן, הוא מספק יתרון משמעותי בעת ציפוי מחדש של צלחות בקוטר גדול (למשל, 10 ס"מ קוטר או גדול יותר), כנראה בגלל neurites בצלחות כאלה יכול להאריך תהליכים ארוכים מאוד וליצור מערך מחובר בצפיפות.
כאן אנו מדגימים שיטה זו ולהמחיש בקצרה את היישום שלה ב-asuritogenesis מוקדם ועבור התבגרות סינפסה, אשר כרוכה באשכולות של חלבונים טרום וסינפטית לאורך הדנדריטים ואקסונים, ואחריו מאוחר יותר לוקליזציה באתרי סינפטית. הדוגמאות מדגישות את היתרונות שפרוטוקול זה מציע בשימור הכדאיות של התאים והתוכסות. ראשית, היא מאפשרת לחוקרים ללמוד צעדים מוקדמים של האדם neuritogenesis. ההגדרה הניסיונית דומה התרבויות הראשיות בשימוש נפוץ של קליפת המוח מכרסם או נוירונים היפוקמאל, איפה התאים מופקים מאוחר או מוקדם לאחר לידה מוחית הלידה, התיר על ידי נשחקו לאחר טיפול פרוטאז עדין, ומותר ל ליזום neurites או להתחדש neurites שנותקו בהליך9,10. בדומה לנוירונים כאלה הראשי מכרסם, הנוירונים הנגזרים הנגזרות להתחיל טופס או לחדש neurites שלהם בתוך שעות לאחר הציפוי, המאפשר הדמיה של גביעי צמיחה ומורפולוגיה neurite בסביבה אופטימלית עבור הדמיה גבוהה זמן רקתית עם פחות תאים מובחן המקיפים. הבחנו כי neurite מוצלח מסונכרן יותר לעומת עיכובים משתנים שונים שיעורי מוצלח לראות כאשר הנוירונים הראשונים מתחילים להבדיל מאוכלוסיית הקדמון. בנוסף, ציפוי מחדש מאפשר בחני של נוירונים המבטא סמנים בעלי משנה עצביים בדרך כלל מופיעים בשלב מאוחר יותר בהתפתחות העצבית, כגון שכבת קליפת הביצה 5/6 שעתוק מקדם CTIP2 (עוף אובלבומין הזרם המקדם של שעתוק מיזם חלבון מקדם אינטראקציה 2), או הסמן הפאן-עצבי NeuN11. תכונה שימושית במיוחד של הגישה החוזרת היא כי synaptogenesis ההכנסות בתוך מסגרת זמן תואם HCS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תקופת הבידול לפני ציפוי מחדש
- להבדיל נוירונים על 10 ס מ מנות, באמצעות פרוטוקול של בחירה7,8 עד נוירונים יצרו רשת עבה עם התהליכים שלהם ומבטאים לא רק סמנים עצביים מוקדם כגון MAP2 או TuJ1, אלא גם סמנים מאוחר כגון neun.
-
שינוי חצי בינוני של הבחירה כל 4 ימים במהלך תהליך הבידול העצבי.
הערה: שינויים נרחבים או תכופים יותר בינוני לדלל גורמים הזנה חיוניים, ויכול להיות התבגרות טובה.- עבור ה-iPSC-נגזר WT126 נוירונים, השתמש במדיה הבאה שלאחר בידול לפוסט: 5 מ"ל 100x N2, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF, 1 μg/mL, 200 μM חומצה אסקורבית, 1 μM diבוטירג-מחנה ו-10 מ"ל SM1 עבור 500 mL של הנשר המתוקן בינונית של שונה/ תערובת מזינים F-12 (Dמאמ/F12). בהדרגה, באמצעות שינויים בחצי מדיה, להחליף עם המדיום הבסיס העצבי (טבלת חומרים) ואת תוספי אותם.
- עבור הנוירונים הנגזרים iPSC הנגזר CVB, להשתמש הבאים לאחר בידול culturing בינוני: 500 mL בסיס עצבי בינונית (טבלת חומרים) ו 500 mL dmem דיום/F12 בינונית עם 2 Μg/mL למינציה, 10 מ ל גלוטמין תוסף (לוח חומרים), 0.75 mg/mL נתרן ביקרבונט, 5 מ"ל בינוני חיוני מינימלי (זיכרון) חומצות אמינו לא חיוניות, 0.2 חומצה אסקורבית מילימטר, 10 ng/mL BDNF, 20 מ"ל 50x B27, ו 10 מ"ל 100x N2 תוספת.
2. ציפויים בריבוי בארות
- יום לפני הציפוי החוזר, המעיל עם פולי אל אורלך (אש ף). התמוססות אש ף במים סטריליים כדי ליצור פתרון מניות (10 מ"ג/mL). אחסן את המניה הזאת ב-20 ° c. דלל את אש ף 1:100 במים כדי להניב ריכוז של 50 μg/mL כאשר זכוכית ציפוי 1:1000 יחס (10 μg/mL) כאשר ציפוי פלסטיק.
- החל את הציפוי ישירות על לוחיות היעד. השתמש בנפח הציפוי המתאים לגודל הלוחית (כלומר, לצלחת של 24 שעות להחיל את 500 μL של פתרון אש ף לכל טוב).
- אפשר לצלחות לשבת בחושך בלילה בטמפרטורת החדר.
- לאחזר צלחות מצופות ביום של ציפוי מחדש והעברה לארון ביולוגי סטרילי.
- . ולשטוף פעמיים במים סטריליים
- לדלל (1.15 mg/mL) בתמיסת מלח מאגור פוספט (PBS) ב 1:400 דילול.
הערה: הפשרת הלמינציה ב-4 ° צ' ובמהירות להוסיף ל-PBS כדי למנוע צבירה של ציפוי למינציה ואחיד. - מתיף מים סטריליים ולהחיל 500 μL של למינציה בציפוי לבארות מצופה בעבר עם אש ף.
- לוחות מניחים בחממה 37 ° c עבור מינימום של 4-6 h. השתמש incubations ארוך יותר, עד 16 h, עבור משטחי זכוכית. השתמש בזמני דגירה עקביים.
3. ציפוי מחדש של נוירונים
- לשטוף את הצלחת של נוירונים הבדיל עם PBS פעם בעדינות. פזר את הPBS בעדינות במורד הקיר של הצלחת, ולא ישירות על התאים, כדי להימנע מהפרעה להם.
- בעדינות לנגוע PBS, להיות זהיר כדי להימנע מלגעת בתאים ישירות אבל כדי לבשל מקצה המנה תוך המפנה אותו לעבר החוקר.
- החל מינימום 1 מ ל של האנזים פרוטחרדה (טבלת חומרים) לכל 10 ס מ לוחית ולהחזיר תאים לחממה. להוסיף כרכים קצת יותר גבוה אם החדר תרבות הרקמה מציג שיעור אידוי גבוה עקב לחות נמוכה.
- התאים דגירה עם אנזים פרוטנוגד חרדה עבור 40-45 דקות כדי לנתק אותם מן הצלחת ולנתק אותם מפני נוירונים אחרים בתוך הרשת העצבית.
הערה: התזמון בשלב זה הוא קריטי. קוצ'ינג הפרוטאז מוקדם מדי יכול להוביל מוות תאים מוגבר לאחר ציפוי מחדש. יצרנית האנזים פרוטחרדה ממליצה כי הטמפרטורות נמוך הרבה יותר מ 37 ° c לשמש עם תקופות דגירה ארוכה יותר עבור מעבר קווי התאים (למשל, לילה ב 4 ° c). עם זאת, לטיפול בנוירונים ב 4 ° צ' יש להימנע, כפי שהם מראים לעתים קרובות הישרדות עניים לאחר חשיפה קרה. היצרן מצהיר גם כי הדגירה 60 דקות עם האנזים ב 37 ° c מוביל הפעלה אנזימטית שלה. עם זאת, בניסיון של מחברים, הדגירה של 40-45 דקות של תרבויות כפתונאליות הנגזרות ב-37 ° c מספיקה לניצול יעיל ולהישרדות עצבית מצויינת בעת ציפוי מחדש. - בדוק נוירונים על מיקרוסקופ שלב-ניגודיות בזמן הדגירה ולאפשר טיפול פרוטאז להמשיך עד הרשת העצבית לחלוטין לנתק מן הצלחת ומתחיל להתפרק בסדינים קטנים בזמן לטלטל את הצלחת תחת מיקרוסקופ.
- כיבוי פעילות הפרוטאז באמצעות 5 מ ל של מדיה DMEM טרי עבור 1 מ ל של פרוטאז בצלחת 10 ס מ להפסיק את העיכול. בעדינות קצוצות תאים נגד צלחת 5-8 פעמים כדי לשבש את הרשת, באמצעות פיפטות סרולוגית. להיזהר לא להחיל יותר מדי לחץ כאשר triturating, כמו נוירונים הבדיל הם שבירים. אין להשתמש בטיפ P1000, מכיוון שהסוף הוא חד מדי וצר, ולכן ניתן לממש או לפגוע בנוירונים.
- החלת פתרון עם תאים באמצעות מסננת תא עם שינוי בקוטר 100 יקרומטר לתוך רענן 50 mL שפופרת חרוט על ידי ירידה.
- לשטוף מסננת עם תוספת של 5 מ ל של מדיה חדשה DMEM, לאחר תאים יש לסנן דרך.
- ספין תאים בצנטריפוגה שחקן העליון ב 1,000 x g עבור 5 דקות.
- החזר שפופרת חרוט אל הקבינט אבטחה טיחות ומייבשים את רוב המדיה, עוזב סביב 250 μl כדי להבטיח שתאים ישמרו על לחות.
- השהה תאים מחדש בעדינות ב-2 מ ל של מדיית DMEM טרייה. לא לנקז את הגלולה על הצד של הצינור. במקום זאת, בעדינות להפוך את חרוט 2-3 פעמים ולעבור תאים בסופו של 5 mL סרולוגית להיפטר מהם.
- החל 10 μL של נוירונים מחדש על הקצה של המוציטומטר.
- הוסף 8-10 μL של טרימין כחול ל-droplet של תאים כדי להעריך את הכדאיות בתאים במהלך שלב השעיה מחדש. החל 10 μL של תערובת זו ל-הומוציטוטומטר או למוני תאים אוטומטיים אחרים. להעריך כמו קיימא תאים אלה הם בהירים הפאזה ולא לכלול את הצבע הכחול טריפי.
- לקבוע כמות של תאים קיימא/mL, ולהכין לדלל את התוכן של צינור החרוט על פי צפיפות התא הרצוי.
- צלחת ~ 10,000 תאים לכל טוב עבור צלחת 384-באר; צלחת ~ 150000-200000 תאים לכל טוב עבור צלחת 24.
- הוסף DMEM טרי לצינור החרוט של תאים מושעה כדי להשיג דילול המתאים ולהוסיף תוספי מתאים נוספים כגון B27 ו/או BDNF, בהתאם לדרישות קו התא המסוים.
- הטיה בעדינות צינורית חרוט לערבב 2-3 פעמים.
- מלטף למינציה בציפוי מן הצלחת 24-באר, או מ 384-היטב צלחת multiwell יטב באמצעות 16-ערוץ pipet ולשטוף פעם אחת עם PBS.
- מP1000 את ה-PBS בעזרת הצלחת של 24 שעות ביממה, או את הפיפטה של 16 הערוצים ב384-לוחיות הרישוי.
- החלת פתרון התא על כל באר בתנועה בספרה שמונה כדי להימנע מהפייפת. אחידות הציפוי עשויה להיות ממוטבת גם באמצעות התקנים אוטומטיים לטיפול בנוזלים.
הערה: תוספת של למינציה לתקשורת החל 2-4 ימים לאחר הציפוי גם עוזר לשמור על התפלגות הומוגנית של התאים. - חזור על שלבים 3.19 ו-3.20 עבור כל באר.
- להחזיר את הצלחת לחממה להגדיר ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
- לאחר יומיים, להתחיל לשנות חצי בינוני כל 4 ימים באמצעות מדיה לאחר בידול culturing המתואר בסעיף 1.2. לאחר זמן ההבשלה הרצוי, לתקן תרבויות באמצעות 3.7% פורמלדהיד ב 37 ° צ' ותאי כתם לפי הדרישות הנסיוניות.
4. הכדאיות התאית לפוסט-ציפוי מחדש
- הוסף את כתב המוות המוקדם של התאים (VivaFix: 0.5 μL של הפתרון מלאי μL 50 לכל 500 μL מדיה התרבות בכל טוב) לאחר בקצרה וורטקספתרון המניה.
- התמונה החיים והתאים המתים מתורבתים על multiwells זכוכית, לאחר 20 דקות, ללא כל צעד כביסה, מאז זוהר לצבוע רק פעם אחת בתוך התאים, או לתקן ושיתוף כתם עם 4 ', 6-diamidino-2-פנילילינדול (dapi) ו/או נוגדנים אחרים לפני הדמיה במיקרוסקופ.
5. מכתים חיסוני
- תקן תרבויות עם 3.7% פורמלדהיד ב-PBS פלוס 120 ממ סוכות עבור 20 דקות ב 37 ° c.
- לשטוף ולחלחל עם 0.2% טריטון X-100 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לחסום עבור 30 דקות עם החלבון 2% סרום אלבומין (BSA).
- מתיף את BSA ללא שטיפה ומודרת עבור 1 h בטמפרטורת החדר עם הארנב anti-MAP2 נוגדן 1:1000, העכבר anti-β3 טובולין (TuJ1) נוגדן 1:2000, התרנגול נגד NeuN נוגדן (1:100) ונוגדן אנטי CTIP2 חולדה (1:500), או עם העכבר נגד PSD95 ( 1:200), ארנב נגד סינפסין 1 (1:200) והעוף אנטי MAP2 נוגדן עבור כתמים סינפטית.
- לשטוף עם PBS, ו דגירה עם אלקסה Fluor-מצועם נוגדנים משניים בתוספת DAPI עבור 45 דקות ב 37 ° c.
- לבסוף, לרחוץ פעמיים עם PBS לפני הדמיה.
6. הדמיה סידן
- להדביק תאים מתורבתים עם AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE (מכון Salk למחקרים ביולוגיים, GT3 Core מתקן) ב 10 ימים לאחר הציפוי ואת התמונה כדי להעריך את מעבר סידן ספונטנית ב 3-4 שבועות לאחר הציפוי.
7. רכישת תמונה וניתוח
הערה: לפרטים על מערכת הרכישה אנא פנה ל-קלבריזי et al.12.
- השתמש במודול דימות לקבלת תמונה ידנית או אוטומטית, ומודול תוכנה לניתוח תמונה, כגון CellProfiler13, עבור מדידות מורמטריות.
- חישוב אורך ממוצע של TuJ1 חיוביים neurites ו MAP2 הדנדריטים חיובי על ידי מדידת אורך כולל לכל שדה של השקפה מחולקת על ידי מספר הנוירונים (DAPI + MAP2 או תאים חיוביים TuJ1) בתוך אותו שדה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הציפוי החוזר של הנוירונים הנגזרים מhiPSCs שהיו מובחנים במשך שבועות מרובים מציע מספר יתרונות. עם זאת, ניתוק וציפוי מחדש של הנוירונים הבדיל, כי יש ארוך, דנדטים מחוברים הדדית ו אקסונים (איור 1א) יכול לגרום לחלקיק גבוה של נוירונים פגומים הפיך פגום.
כפי שמתואר בסעיף הפרוטוקול, השתמשנו דגירה עם אנזים פרוטנוגד חרדה כדי לנתק את הנוירונים מן המצע. בדרך כלל, בשל העבודה העבה שלהם של neurites (איור 1א), התאים נוטים לנתק את כולם בבת אחת כמו שכבה תחביריים אחת, אשר לעתים קרובות מתחיל לצוף בבאר (איור 1ג). זה קורה במהירות רבה, והוא אולי מדוע רוב המעבדות נוטות לאסוף את התאים לאחר רק 5 דקות של דגירה עם אנזים הבחירה שלהם של ברירה, ו לשבור באופן מיידי את הגיליון של התאים על ידי נשחקו (ללטף אותו למעלה ולמטה). עם זאת, מניפולציה מכנית זו מופיעה כתוצאה לחץ גבוה עבור נוירונים. אנו מאמינים מידת הלחץ עשוי להיות פרופורציונלי לאזור מכוסה על ידי הרשת העצבית, כי אנו מוצאים כי הנזק לכאורה של הדגירה הפרוטאז לקוי הוא גדול יותר עבור 10 ס"מ או לוחות גדולים יותר מאשר 35 מ"מ או לוחות קטנים יותר. כך, באופן אינטואיטיבי, מצאנו כי הארכת הדגירה האנזימטית ל-40-45 דקות מפחיתה את מוות התאים בזמן הדיסוציאציה של התא (איור 1ג) ומאפשרת החלמה יעילה יותר של תאים חיים ובריאים הפולטים תהליכים לאורך שעות לימים שלאחר ציפוי מחדש (איור 1B). ככל הנראה, זמן הדגירה המורחבת עם אנזים מתון נוגד חרדה מאפשר את העיכול החלקי של חלבונים כי בחוזקה לדבוק בתאים והתהליכים שלהם אחד לשני לבין מטריקס החילוץ. זה מאפשר לתהליך מחדש לעבוד ביעילות כדי להפריד תאים בודדים ללא צורך trituration נמרצת מדי.
כדי לכמת את האפקטיביות של ההליך דגירה מורחבת האנזים, אנו העריכו הכדאיות של תאים מושעה מיד לאחר נשחקו באמצעות טריפה כחול (איור 1ג), ומאוחר יותר ב 1, 3 ו -7 ימים לאחר הציפוי באמצעות תא מוקדם סמן מוות (איור 2). מיד לאחר trituration, טריקון כחול הצביע כי היה מוות באופן משמעותי תאים לאחר 5 דקות דגירה לעומת הדגירה 45 דקות עם האנזים פרוטנוגד חרדה (איור 1ג). שני קווי ה-iPSC שנהגנו להדגים את ההתבוננות הזאת הובלו לנוירונים משלב הקדמון העצבי באמצעות פרוטוקולים שונים, והראו רגישות שונה באופן כללי לתהליך הציפוי החוזר. תרבויות מן הקו WT126 הבדיל NPCs באמצעות "שיטת בחירת שושנת העלים"7 היו רגישים יותר לנזק מאשר תרבויות הבדיל בין קו CVB WT24 באמצעות שיטה בידול מהיר8. אף על פי כן, בשני הקווים מידת המוות של התאים המיידית היתה בקירוב באמצעות הליך דגירה האנזים המורחבת.
לאחר ציפוי מחדש, התרבויות הציגו הכפלה משוער של הכדאיות התאית בימים הבאים באמצעות הליך דגירה מורחבת האנזים, כפי שנקבע על ידי צפיפות של תאים DAPI-חיוביים (איור 2B, גרף בצד שמאל). בנוסף, הדגירה האנזים המורחבת הביא לצפיפות נמוכה יותר של תאים מתים או מתים שזוהו באמצעות ערכת הכדאיות של הוצאת הצבע (איור 2ב, גרף מימין). שבריר של תאים מתים שאותרו באמצעות שיטת הכדאיות לאחר 24 h לאחר הציפוי היה גבוה יותר מאשר ראה באמצעות טריפי כחול מיד לאחר הפעולה. זה כנראה משקף את הצטברות של תאים מתים וגוססים על אלה 24 שעות הראשון, אם כי גם אפשרי כי שיטת הכדאיות ברגישות יותר מזהה את המוות התאים מאשר הטריבין התכלת הקיום. תאים מתים המשיך להתגלות על 1-7 ימים לאחר הציפוי (איור 2ב). צפיפות הציפוי הראשונית הן עבור קבוצות נסיוניות (5 דקות ו-45 דקות) היה זהה ומבוסס על ספירת תאים חיים של הומוציטוטומטר של השעיית התאים שלאחר הניתוח. חשוב לציין, בכל פעם נקודות הזמן שלאחר הציפוי, מספר התאים החיים, בריאים היה כ הוכפל בעקבות הדגירה 45 מינימום האנזים לעומת 5 דקות דגירה. תצפיות אלה אושרו בצורה איכותית באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה לניטור מורפולוגיה של התאים בכל שלב: לפני הציפוי החוזר, במהלך הציפוי, ולאחר ציפוי מחדש (איור 1 ואיור 2).
אחד היתרונות של לציפוי הנוירונים הנגזרים מחדש לאחר שהם המבדילים במשך מספר שבועות הוא כי רוב התאים יהיה לצאת בשלב מחולל קדמון ולהיות מחויבת לפנוטיפ עצבי בזמן של ציפוי מחדש. שלב המעבר של בידול עצבי מושלתי עצביים מתרחש במשך מספר ימים, עם מספר גדול יותר של תאים בהדרגה לבטא סמנים עצביים בשלב מוקדם, כגון beta-III טובולין (זיהה נוגדן TuJ1) או MAP2. ביטוי הגנים מתפתח במשך מספר שבועות, ובסופו של דבר כתוצאה מכך הביטוי של השלב המאוחר הפאן-עצביים סמנים, כגון NeuN, או תא-סוג סמנים ספציפיים עבור נוירונים בקליפת המין כגון CTIP2. לכן, הציפוי של הנוירונים הבדיל בעבר הנגזרים מאפשר אחד ללמוד אירועים עצביים מוקדם, ארעי, כגון חניכה neurite, סוגי הנוירונים מזוהים. איור 3 ממחיש את הנוכחות המיידית של סמנים עצביים מוקדם בתרבויות שהיו מצופים מחדש לאחר 4 שבועות של הבחנה מראש בצלחת תרבות גדולה יותר. שים לב כי NeuN-ו CTIP2-המבטא נוירונים מזוהים בקלות בתוך מספר ימים לאחר הציפוי (איור 3). מאפיינים ותזמון של בידול עצבי יכול להשתנות בין קווי היפנואס. עבור השורה WT 126 ו CVB WT24 קווים שאנו מתארים כאן, 85 ± 12% (n = 2) ו 52 ± 11% (n = 5) של התאים, בהתאמה, הביע פעילות החיסונית של βIII-טובולין סמן TuJ1 ב 4 ימים לאחר ציפוי מחדש באמצעות הליך הדגירה המורחבת פרוטאז. עבור שני הקווים, 30-40% של התאים, ו 80-90% הנוירונים גם לבטא את השכבה 5/6 neocortical סמן. בנוסף לכדאיות משופרת, פרוטוקול פרוטאז מורחב גם בינוני משופר neurite מוצלח (ממוצע neurite אורך לכל תא העצב), כפי שמוצג באיור 4. שניהם neurite אורך הכולל (כולל באמצעות נוגדן Tuj1, אשר כתמים הן אקסונים ו דנדטים; איור 4 ב, גרף שמאלי) והתפתחות הדנדריטים (בכמת באמצעות MAP2, אשר כתמים רק דנדטים; איור 4 B, מרכז גרף) היו מועדפים בעת שימוש הליך דגירה המורחבת פרוטאז. שים לב כי הגרף עבור התאים DAPI-חיוביים (DAPI (+)) באיור 2 מבוססים על אותן דגימות תמונה של גרף ספירת התאים באיור 4, אך באיור 2 הם השתמשו בשיטה לא-אוטומטית שסייעה בתוכנת פיג'י, בעוד באיור 4 הם היו כמותית באמצעות ניתוח תמונה אוטומטית פלטפורמת cellprofiler. שתי ניתוחי התמונה הללו מגישות הניבו תוצאות דומות.
ציפוי שימושי לא רק כדי ללמוד neurite outgrowth, אלא גם כדי ללמוד סינפסות או אחרים מאוחר יותר להופיע תכונות ביולוגיות של נוירונים. ואכן, לאחר שבוע אחד בלבד שלאחר הציפוי אנו מתבוננים סמנים עבור חלבונים הקדם סינפטית ופוסט הסינפטית לקשט את הדנדריטים העצבי בתבנית דקדטה (איור 5א). לאחר 4 שבועות אנחנו גם מתחילים לזהות את הלוקליזציה שלהם, אשר הוא מחוון של היווצרות של סינפסות תפקודית (איור 5א). יתר על כן, פעילות חשמלית מזרמים מsynaptically ספונטניים ומונעים באמצעות הדמיה של סידן (איור 5B) או מערכים רב-אלקטרודה (אני).
איור 1 : שימור מעולה של הכדאיות העצבית לאחר דגירה ארוכה עם האנזים פרוטנוגד חרדה עבור הדיסוציאציה של התא. (A) התמונה ניגודיות השלב של הנוירונים NPC הנגזר הבדיל 3 שבועות. האזור הארוז בתמונה השמאלית מוגדל בימין. בשלב זה לנוירונים יש תהליכים ארוכים, אשר יוצרים ממשל עבה. קנה מידה ברים = 80 יקרומטר (משמאל); 35 יקרומטר (מימין). (ב) תמונות נבחרות של נוירונים הנגזרים ב 1 ו -5 ימים לאחר הציפוי. סרגל קנה מידה = 100 μm. (C) שמאל: תאים מתנתק כגיליון אחד בתוך דקות ספורות לאחר התחלת טיפול פרוטאז. סרגל קנה מידה = 200 μm. מימין: לאחר שתאי התלת-ממדי נספרים על ההיציטומטר לפני הציפוי. גרפים להראות כימות של תאים שאינם קיימא, טריפי-כחול חיוביים לאחר 5 דקות או 45 דקות דגירה עם האנזים פרוטנוגד חרדה עבור שני קווים שונים CVB WT24 (* * * p < 0.0003, unpaired t-test) ו WT 126 (* * * * p < 0.0001, unpaired t-test). ערכים מייצגים את הממוצע ± S. E. M של 4 משכפל בודד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : הכדאיות העצבית לאחר מספר ימים שלאחר הציפוי. (A) תמונות של WT126 NPC-נגזר הנוירונים ב 1 ו 3 ימים לאחר הציפוי באמצעות 5 דקות ו 45 דקות הדגירה הפרוטאז. תאים מתים מסומנים עם כתב. המוות הרגיש מוקדם של התאים תמונות שדות ברייטסיביות תואמות מוצגות בצד שמאל. כמה פסולת תאית (חץ כחול) מזוהה בדרך כלל לאחר ציפוי מחדש, במיוחד בקבוצה של 5 דקות. קנה מידה ברים = 150 μm. (ב) תמונות של CVB WT24 NPC התרבויות ב 1, 3 ו -7 ימים לאחר הציפוי באמצעות 5 דקות ו 45 מינימום פרוטאז הדגירה. תאים גוססים מסומנים עם כתב המוות הרגיש מוקדם התאים (אדום). כל גרעיני התאים החיים והגוססים מתויגים עם DAPI (ציאן). האות הלבן הממוזג מייצג את התאים DAPI ו-VivaFix-חיוביים (+). תאים מעטים להציג VivaFix מכתים אבל חסר DAPI צביעת (תאים אדומים בתמונה המשולבת בצד ימין); אלה הם כנראה תאים שהיו מתים למשך שעות רבות. סרגלי קנה מידה: 25 μm. הגרף הימני מראה כימות של שבריר של תאים מתים (VivaFix/DAPI) לאחר זמן דגירה שונים עם האנזים פרוטנוגד חרדה (5 דקות לעומת 45 דקות: * p < 0.05 1 d ו * * * p < 0.001, 3 ד; 2-way ANOVA, ואחריו השוואה multiferרוני פוסט הוק בדיקה). גרף שמאלי מציג שינויים בצפיפות התא הכוללת (DAPI (+) תאים עבור 5 דקות לעומת 45 דקות: * * * p < 0.0001 עבור כל נקודות הזמן; ANOVA דו-כיוון, ואחריו השוואה מרובת מבחנים של בונפררוני פוסט-הוק). כל הערכים מוצגים כממוצע ± S. E. M של 3 משכפל, עם מינימום של 1,500 תאים הבקיע לכל תנאי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : ביטוי לזיהוי של סמנים עצביים בשלב מאוחר מיד לאחר ציפוי מחדש. תרבויות של CVB WT24 היפאנט התאים הנגזרים התמונה 4 ימים לאחר ציפוי מחדש, שימוש 45 דקות דגירה של פרוטאז, מ 10 הצלחת ס"מ כי היה הבדיל משלב NPC במשך 4 שבועות. דוגמאות שמוצגות היו מוכתמות לסמנים הפאן-עצביים TuJ1, MAP2 או NeuN; או השכבה העמוקה של. תא העצב הקליפת-מCTIP2 שים לב לנוכחות של neurites נרחב, ואת הביטוי החזק של TuJ1 ו MAP2. הערה במיוחד כי חלק משמעותי של הנוירונים גם מבטא סמנים בשלב מאוחר NeuN ו CTIP2. סרגל בקנה מידה = 16 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4 : הצמיחה Neurite ו דנדט לאורך זמן בעקבות הדגירה האנזים קצר יותר וארוך יותר במהלך הציפוי מחדש. (א) בציפוי מחדש של הנוירוניםCVB WT24 היפנוסק במהירות להאריך neurites, כפי שזוהה באמצעות נוגדן Tuj1. שימו לב לכך שזמן הדגירה של הפרוטאז מקדם את neuritogenesis. סרגל בקנה מידה = 25 μm. (ב) כימות של neurite ו הדנדט אורך, מעל 1, 3 ו -7 ימים לאחר הציפוי באמצעות או 5 דקות או 45 דקות פרוטאז. אורך הneurite הכולל היה מכמת מTuJ1 (βIII-טובולין); דנדט-כתמים ספציפיים היה ככמת מ MAP2 מכתים snf תוקן לצפיפות התא הכולל (הגרף הימני). כל הערכים מוצגים כממוצע ± S. E. M של 3 משכפל. Neurite אורך 5 דקות לעומת 45 דקות: * p < 0.05 ביום 1 ו -7 ימים, * * p < 0.01 ב 3 יום; אורך דנדט 5 דקות לעומת 45 דקות: * * p < 0.01 ביום 1 ו 3 ימים, לא משמעותיים (ns) ב 7 יום; DAPI (+) 5 דקות vs 45 דקות: * * * p < 0.0001 עבור כל נקודות הזמן; ANOVA דו-כיוון, ולאחריו מבחן מרובה השוואה של בונפררוני פוסט הוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5 : הSynaptogenesis ומארעיות סידן ספונטנית ב הבדיל הנוירונים הנגזרים היפנוסק לאחר ציפוי מחדש. (א) שמאל: ב 4 שבועות לאחר שלאחר הציפוי באמצעות פרוטוקול דגירה מורחבת פרוטאז, סמן טרום סינפטיות סינפסין 1 הוא לזיהוי אשכולות דקדטים לאורך MAP2 הדנדריטים חיובי. קנה מידה של סרגלים = 5 μm. מימין: האזור הדנדריטי שנבחר מראה התאמה לשפות אחרות בין אשכולות טרום סינפטיות ופוסט-סינפטיות (חץ צהוב), אינדיקציה לסינפסות בעלי פוטנציאל פעיל. קנה מידה ברים = 1.5 μm. (ב) עזב: היפנוסק-הנוירונים הנגועים עם AAV8-Syn-jGCaMP7f-wpre שימשו כדי לפקח על ארעיות סידן ספונטנית מונע על ידי פעילות הרשת. התמונה ברייטפילד מוצגת בסמוך לעיבוד הצבע המדומה של GCaMP7 פלואורסצנטית בנקודת זמן בודדת בסדרת זמן הקפיצה. סרגל בקנה מידה = 25 μm. מספרים צבעוניים מציינים את 4 התאים שנבחרו שבו GCaMP7 פלואורסצנטית נמדד לאורך זמן, כפי שמוצג בעקבות בצד ימין. כל מעקב צבעוני מתאים לתא אחד. הכוכבית מצביעה על הזמן במהלך ההקלטה החיה שאליה מתאימה התמונה משמאל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6 : זרימת עבודה של הליכי ציפוי מחדש לתרבות hiPSCs עבור הקרנת תוכן גבוה ו/או מחקרים מפורטים של בידול neurite מוצלח או הקלטות מאה. החל התרבות המובחנים של נוירונים גדל עבור 4 או יותר שבועות בפורמט גדול יותר (למשל, a 10 ס מ התרבות הצלחת), נוירונים מודבטים עם פרוטאז עבור 40-45 דקות, triturated בעדינות כדי לנתק ולהשעות מחדש. תאים מופצים לאחר מכן לריבוי בארות תואם HCS, מצופה מחדש על מצעים תואמים עם גביעי צמיחה הדמיה (חץ צהוב) או מבנים אחרים, או על multi-בארות מתאים הקלטות מערך רב אלקטרודה. קנה מידה ברים = 27 יקרומטר, 5 יקרומטר, 2.5 יקרומטר, 130 יקרומטר (משמאל לימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הדגמנו הליך ישר קדימה עבור השעיה מחדש של התרבויות הנוירואליות האנושית הממוטב הכדאיות, בידול הצלחה, והדמיה subcellular באופן תואם פלטפורמות ההקרנה תוכן גבוה, ושאר הגורמים הרלוונטיים לגילוי הסמים. איור 6 ממחיש את זרימת העבודה הכוללת ודוגמאות ליישומים כאלה.
למרות שכאן אנו מתמקדים הנוירונים הנגזר הנגזרים כי הם מכוונים לעבר הגורל בקליפת העצב, אנו מצפים כי שיטה זו צריכה להיות ישימה באופן שווה לתאי גזע מעובריים האדם הנגזר, וכלה בתאי גזע הנגזרים מכוונים לכיוון אחר , פנוטיפים עצביים14,15.16,17,18 יתר על כן, אנו מקרים כי זה הליך פרוטאז מורחב עשוי להיות מועיל למצבים אחרים הדורשים השעיה של תאים שיש הוקמה neurite מישאל, למשל עבור מיון FACS או תא בודד ניתוח של נוירונים ראשוניים19 , . עשריםדולר
ציפוי הנוירונים הנגזרים מספק מערכת מודל קיימא שבה לחקור מנגנונים סלולריים ומולקולריים של הרבה אירועים ביולוגיים מרכזיים. לדוגמה, הליך זה יכול להקל על מחקרים מפורטים של האדם neurite מוצלח ומאפיינים חרוט הצמיחה, והשוואה של ממצאים לבסיס ידע נרחב שנבנה מעשורים של לימוד מינים אחרים, הן בעלי חוליות ו חסרי חוליות. אנו מוצאים כי הליך ציפוי מחדש עשה את זה קל יותר לייעל את התנאים כדי ליצור גביעי צמיחה גדולה יותר, כי הם מתאימים היטב להערכה אופטית של מבנה subcellular ותפקוד (איור 6). על ידי השוואה, אצטרובלים הצמיחה בדרך כלל נצפו במהלך הבידול הראשוני של נוירונים מ hiPSCs נוטים להיות קטנים וקומפקטי, ואת מערך צפוף של תאים לא עצביים בתרבויות כאלה עושה את זה קשה גם להתאים את תנאי המצע כדי ל לקדם חרוט הצמיחה מתפשטת לתמונה קונוסים צמיחה בודדים בתוך הסביבה רקמות מורכבות. כך, לציפוי נוירונים לתוך מאכל טרי מספק "לוח נקי" על אשר לראות גביעי צמיחה בתנאים הדמיה טובה.
ציפוי מחדש הוא יתרון במיוחד בעת שימוש פלטפורמות תרבות התא מתאים HCS כי זה מפחית במידה ניכרת את הזמן הכולל שבו תרבויות גדלים בכמויות קטנות. כרכים עבודה קטנים של בארות בודדות של 96, 384 או 1536-ובכן multi-בארות (כ 100, 50 ו 5 מיקרוליטר עבודה בנפח, בהתאמה) בדרך כלל דורש תכופים (כלומר, יומי) שינויים במדיה לנטרל אידוי ודלדול מזינים. שינויי מדיה תכופים הם יקרים, לא רק במונחים של ריאגנטים ועבודה, אבל הם יכולים להתפשר על הכדאיות של תרבויות על ידי דילול מדיה ממוזג על ידי הגדלת הסיכויים כי תאים לנתק מן המצע בשל מערבולת מכנית. ציפוי מחדש של hiPSCs יכול גם להקל על ההקלטה של פעילות פיזיולוגית באמצעות מערכים multielectrode21,22, או לחיות הדמיה של תרבויות באספאומר של פנוטיפים עצביים דינמיים23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו היא מרכיב של קבוצות המחקר הלאומי הקואופרטיב תא שיתופיות (NCRCRG) ללמוד מחלות נפש נתמך על ידי NIH מענק U19MH1 2015-0644. העבודה הראשונית נתמכת גם על ידי NIH מענק NS070297. אנו מודים לד"ר קרול בלטו ופרד Gage, מכון סאלק, שסיפק את שורת ה-WT 126 של תאי הקדמון העצביים, ואת ד"ר יוג'ין יו ו לורנס גולדשטיין, UC בסן דייגו על מתן קו CVB WT24 של תאים מחולל קדמון עצבי. אנו מודים לדבורה Pre במעבדה של ד ר אן באנג, המכון לגילוי רפואי של סנפורד ברנהם, לדיונים שימושיים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Post Replating Media | |||
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A4403 | Add 1 mL of 200 mM stock to 1 L of N2B27 media |
| Dibutyryl-cAMP | Sigma | D0627 | Add 1 µM |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml final concentration |
| B27 (50x) | Thermofisher Scientific | 17504044 | Add 20 mL to 1 L N2B27 media |
| DMEM/F12 with Glutamax | Thermofisher Scientific | 31331093 | Add N2 and distribute in 50 mL conicals; parafilm wrap lids |
| Human GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/mL final concentration |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050038 | Add 10 ml to 1 L N2B27 media; glutamine supplement |
| Mouse Laminin | Sigma | P3655-10mg | Add 100 µL to 50 mL N2B27 |
| MEM Nonessential Amino Acids | Thermofisher Scientific | 11140035 | Add 5 mL to 1 L N2B27 media |
| N2 (100x) Supplement | Life Technologies | 17502048 | Add 5 mL to 500 mL media |
| Neurobasal A Media | Thermofisher Scientific | 10888022 | Combine with DMEM/F12 to generate N2B27 media for CVB wt cells; neural basal A media |
| Neurobasal Media | Thermofisher Scientific | 21103049 | for WT126 cells; neural basal media |
| SM1 Supplement | StemCell Technologies | 5711 | Add 1:50 to media |
| Sodium bicarbonate | Thermofisher Scientific | 25080-094 | Add 10 mL to 1 L N2B27 media |
| Plate Preparation | |||
| 10 cm Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | 08772-E | Plastic TC-treated dishes |
| 6-well Tissue Culture Dishes | Thomas Scientific | 1194Y80 | NEST plates |
| Mouse Laminin | Life Technologies | 23017-015 | Add 1:400 on plastic |
| Poly-Ornithine | Sigma | P3655-10mg | Add 1:1,000 on plastic |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies | 10977-015 | To dilute Poly-L-Ornithine |
| Replating Reagents | |||
| 100 mM Cell Strainer | Corning | 431752 | Sterile, individually wrapped |
| 384-well plate, uncoated | PerkinElmer | 6007550 | Coat with PLO and Laminin |
| DPBS | Life Technologies | 14190144 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
| Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates | PerkinElmer | 6057500 | Rinse before coating with laminin |
| StemPro Accutase | Life Technologies | A1110501 | Apply 1 mL/10 cm plate for 30-45 min; proteolytic enzyme |
| Fixation Materials | |||
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-1 | Dissolved in PBS |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-12 | 0.8 g per 10 mL of fixative |
| Immunostaining Materials | |||
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse | Invitrogen | A-11001 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-11041 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-21449 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 561 Goat anti-rat | Invitrogen | A-11077 | secondary antibody |
| DAPI | Biotium | 40043 | visualizes DNA |
| Mouse antibody against b3-tubulin (TuJ-1) | Neuromics | MO15013 | early stage neuronal marker |
| Rat antibody against CTIP2 | Abcam | ab18465 | layer 5/6 cortical neurons |
| Chicken antibody against MAP2 | LifeSpan Biosciences | LS-B290 | early stage neuronal marker |
| Chicken antibody against NeuN | Millipore | ABN91 | late stage neuronal marker |
| Rabbit antibody against MAP2 | Shelley Halpain | N/A | early stage neuronal marker |
| Mouse antibody against PSD-95 | Sigma | P-246 | post-synaptic marker |
| Rabbit antibody against Synapsin 1 | Millipore | AB1543 | pre-synaptic marker |
| Bovine serum albumin (BSA) | GE Healthcare Life Sciences | SH30574.02 | 10% in PBS for blocking |
| Titon X-100 | Sigma | 9002931 | Dilute to 0.2% on PBS for permeabilization |
| Viability Markers | |||
| Vivafix 649/660 | Biorad | 135-1118 | cell death marker |
| Calcium Imaging | |||
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE | THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility | N/A | calcium reporter in a viral delivery system |
| hiPSC-derived NPCs | |||
| WT 126 (Y2610) | Gage lab | N/A | Marchetto et al., 2010 |
| CVB WT24 | Yeo and Goldstein labs | N/A | unpublished |
References
- Engel, M., Do-Ha, D., Munoz, S. S., Ooi, L. Common pitfalls of stem cell differentiation: a guide to improving protocols for neurodegenerative disease models and research. Cell and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3693-3709 (2016).
- Kim, D. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 109 (2014).
- Amin, N. D., Paşca, S. P. Building Models of Brain Disorders with Three-Dimensional Organoids. Neuron. 100 (2), 389-405 (2018).
- Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2019).
- Langdon, S. P. Cancer Cell Culture. , Humana Press. New York, NY. (2010).
- Picot, J. Human Cell Culture Protocols. 107, Springer Science & Business Media. Berlin, Germany. (2005).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
- Banker, G., Goslin, K.
- Calabrese, B., Halpain, S. Essential role for the PKC target MARCKS in maintaining dendritic spine morphology. Neuron. 48 (1), 77-90 (2005).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116 (1), 201-211 (1992).
- Calabrese, B., Saffin, J. M., Halpain, S. Activity-dependent dendritic spine shrinkage and growth involve downregulation of cofilin via distinct mechanisms. PLOS One. 9 (4), 94787 (2014).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).
- Gupta, S., et al. Deriving Dorsal Spinal Sensory Interneurons from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 390-405 (2018).
- Ogura, T., Sakaguchi, H., Miyamoto, S., Takahashi, J. Three-dimensional induction of dorsal, intermediate and ventral spinal cord tissues from human pluripotent stem cells. Development. 145, (2018).
- Playne, R., Jones, K., Connor, B. Generation of dopamine neuronal-like cells from induced neural precursors derived from adult human cells by non-viral expression of lineage factors. Journal of Stem Cells and Regenerative Medicine. 14 (1), 34-44 (2018).
- Rao, M. S., et al. Illustrating the potency of current Good Manufacturing Practice-compliant induced pluripotent stem cell lines as a source of multiple cell lineages using standardized protocols. Cytotherapy. 20 (6), 861-872 (2018).
- Suga, H. Differentiation of pluripotent stem cells into hypothalamic and pituitary cells. Neuroendocrinology. 101 (1), 18-24 (2015).
- Endaya, B., et al. Isolating dividing neural and brain tumour cells for gene expression profiling. Journal of Neuroscience Methods. 257, 121-133 (2016).
- Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population. Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).
- Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), e54900 (2017).
- Grainger, A. I., et al. In vitro Models for Seizure-Liability Testing Using Induced Pluripotent Stem Cells. Frontiers in Neuroscience. 12, 590 (2018).
- Daub, A., Sharma, P., Finkbeiner, S. High-content screening of primary neurons: ready for prime time. Current Opinion in Neurobiology. 19 (5), 537-543 (2009).
