Identifizierung von Orexin- und Endocannabinoidrezeptoren bei erwachsenen Zebrafischen mit Immunoperoxidase und Immunfluoreszenzmethoden

Roberta Imperatore; Livia D'Angelo; Paolo De Girolamo; Luigia Cristino; Marina Paolucci

doi:10.3791/59308

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Methodenartikel

Identifizierung von Orexin- und Endocannabinoidrezeptoren bei erwachsenen Zebrafischen mit Immunoperoxidase und Immunfluoreszenzmethoden

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DOI:

10.3791/59308

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25. Juni 2019

Roberta Imperatore¹^,² , Livia D'Angelo³ , Paolo De Girolamo³ , Luigia Cristino² , Marina Paolucci¹

¹Department of Sciences and Technologies (DST), University of Sannio, ²Endocannabinoid Research Group, Institute of Biomolecular Chemistry, ³Department of Veterinary Medicine and Animal Productions, University of Naples Federico II

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Präsentiert sind hier Protokolle für die immunhistochemische Charakterisierung und Lokalisierung von Orexin-Peptid, Orexin-Rezeptoren, und Endocannabinoid-Rezeptoren im Darm und Gehirn von normalen und Diät-induzierten Adipositas (DIO) erwachsene Zebrafisch-Modelle mit Immunperixidase und Doppelimmunfluoreszenzmethoden.

Zusammenfassung

Immunhistochemie (IHC) ist eine hochsensible und spezifische Technik, die beim Nachweis von Zielantigenen in Gewebeabschnitten mit markierten Antikörpern beteiligt ist. Es ist ein mehrstufiger Prozess, bei dem die Optimierung jedes Schritts entscheidend ist, um das optimale spezifische Signal zu erhalten. Durch IHC kann die Verbreitung und Lokalisierung spezifischer Biomarker nachgewiesen werden, die Informationen zur evolutionären Konservierung aufzeigen. Darüber hinaus ermöglicht IHC das Verständnis von Expression und Verteilung simonischen Veränderungen von Biomarkern unter pathologischen Bedingungen, wie Fettleibigkeit. IHC, hauptsächlich die Immunfluoreszenztechnik, kann bei erwachsenen Zebrafischen verwendet werden, um die Organisation und Verteilung von phylogenetisch konservierten Molekülen zu erkennen, aber ein Standard-IHC-Protokoll ist nicht veröffentlicht. Orexin und Endocannabinoid sind zwei hochkonservierte Systeme, die an der Kontrolle der Nahrungsaufnahme und Adipositaspathologie beteiligt sind. Berichtet werden hier Protokolle verwendet, um Informationen über Orexin Peptid (OXA), Orexin-Rezeptor (OX-2R) und Cannabinoid-Rezeptor (CB1R) Lokalisierung und Verteilung in den Darm und Gehirn von normalen und Diät-induzierten adipösen (DIO) erwachsenen Zebrafisch-Modelle zu erhalten. Ebenfalls beschrieben sind Methoden zur Immunperoxidase und doppelten Immunfluoreszenz sowie die Herstellung von Reagenzien, Fixierung, Paraffin-Einbettung und Kryoschutz von Zebrafischgewebe und Vorbereitung auf einen endogenen Aktivitätsblockierungsschritt und Hintergrund Gegenfärbung. Der vollständige Satz von Parametern wird aus früheren IHC-Experimenten gewonnen, durch die wir gezeigt haben, wie Immunfluoreszenz beim Verständnis von OXs, OX-2R und CB1R-Verteilung, Lokalisierung und Erhaltung der Expression in erwachsenen Zebrafischen helfen kann. Gewebe. Die resultierenden Bilder mit hochspezifischer Signalintensität führten zur Bestätigung, dass Zebrafische geeignete Tiermodelle für immunhistochemische Studien der Verteilung, Lokalisierung und evolutionären Konservierung spezifischer Biomarker in physiologischen und pathologischen Bedingungen. Die hier vorgestellten Protokolle werden für IHC-Experimente an erwachsenen Zebrafischen empfohlen.

Einleitung

Immunohistochemistry (IHC) ist eine etablierte klassische Technik zur Identifizierung von Zell- oder Gewebekomponenten (Antigene) durch Antigen-Antikörper-Interaktion¹^,². Es kann verwendet werden, um die Lokalisierung und Verteilung von Zielbiomolekülen innerhalb eines Gewebes zu identifizieren. IHC verwendet immunologische und chemische Reaktionen, um Antigene in Gewebeabschnitten³zu erkennen. Die wichtigsten Marker, die für die Visualisierung von Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen verwendet werden, sind Fluoreszenzfarbstoffe (Immunfluoreszenz) und Enzym-Substrat-Farbreaktionen (Immun....